山東省副豬嗜血桿菌流行現(xiàn)狀調(diào)查及啟示

寧慧波，王 鵬，劉 偉

[1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.海博萊生物科技咨詢（北京）有限公司，海淀 100086]

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,Hps）自1910年以來就被認(rèn)為是豬格拉瑟氏?。℅l?sser's disease）的病原菌。該菌是上呼吸道的常在菌，通常定植在豬的鼻腔、扁桃體、氣管前段等部位，與豬的免疫系統(tǒng)保持著脆弱的平衡狀態(tài)。在應(yīng)激等多種因素作用下，Hps可突破鼻黏膜的屏障，引起全身性的感染。臨床上主要表現(xiàn)為漿液性纖維蛋白性-化膿性多發(fā)性漿膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、支氣管肺炎和敗血癥[1]。

豬是Hps的天然宿主。該病主要通過空氣傳播，一年四季均可感染，臨床上主要感染2周至4月齡的豬，尤其是5～8周齡仔豬。發(fā)病率在10%～15%，有窩發(fā)特點(diǎn)，死亡率可高達(dá)50%以上[2-3]。臨床死亡率取決于豬群感染菌株的毒力、仔豬的免疫力、豬群中并存病毒等其他病原體的穩(wěn)定性及宿主遺傳抗性[4]。

隨著規(guī)?；B(yǎng)豬的發(fā)展，此病的發(fā)病率和死亡率均呈顯著上升趨勢。豬只即使能耐過，也會造成生長發(fā)育不良，因此Hps可給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。美國、加拿大、西班牙等養(yǎng)豬業(yè)較發(fā)達(dá)國家早已有此病的報(bào)道，我國是世界上的養(yǎng)豬大國，由于多種病毒病的存在，導(dǎo)致養(yǎng)殖場對該病的防控并不予以重視。本研究通過臨床剖檢、PCR方法、細(xì)菌分離鑒定和藥敏試驗(yàn)初步了解山東省副豬嗜血桿菌病最新流行及耐藥情況，為山東省副豬嗜血桿菌病的防控提供數(shù)據(jù)參考。

1 調(diào)查對象

從2017年10月至2018年5月，對山東省20家規(guī)?；i場（存欄母豬＞500頭）進(jìn)行現(xiàn)場調(diào)查，對疑似發(fā)病豬剖檢進(jìn)行初步診斷。發(fā)病豬多表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、打噴嚏、呼吸困難、鼻腔有分泌物，消瘦（圖1）、生長緩慢、跛行等癥狀。部分病豬剖檢可見腹股溝淋巴結(jié)腫大出血（圖2）；脾臟邊緣出血（圖3）；腫脹關(guān)節(jié)切開呈膠凍樣，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有漿液性炎性滲出液（圖4）；心外膜與心臟粘連在一起，形成“絨毛心”狀（圖5）；腹腔內(nèi)臟器官粘連，呈現(xiàn)纖維性腹膜炎（圖6）；肝臟表面覆有一層干酪樣滲出物，形成肝周炎（圖7）。參照Magyara及Donkó等[5-6]的方法：沿第1、第2前臼齒之間垂直鋸開豬鼻進(jìn)行鼻甲骨病變評分，呈現(xiàn)重度萎縮（圖8）。

2 臨床材料

分別從20個(gè)調(diào)查豬場剖檢采集病料，從心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胸腹腔積液和關(guān)節(jié)液等部位無菌操作取樣。

3 實(shí)驗(yàn)室檢測

3.1 主要試劑

TSA（胰蛋白胨大豆?fàn)I養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）、TSB（胰蛋白胨肉湯營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）、NAD（氧化型輔酶1，終濃度終濃度0.1 g/mL）、犢牛血清（終濃度10%）、1×PBS、1.5%瓊脂糖凝膠。

3.2 PCR檢測

采取病豬淋巴結(jié)、肺臟、大腦研磨提取DNA/RNA，進(jìn)行PCR檢測，具體見表1。

表1 PCR/RT-PCR引物片段

3.3 組織病理學(xué)檢測

對剖檢豬的腦、肺、淋巴結(jié)及扁桃體取樣，10%中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，鏡檢。

3.4 細(xì)菌分離鑒定

將無菌采集的豬心包液、關(guān)節(jié)液等分別接種于血瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h，挑取可疑單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。挑取菌落涂片，經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢。

3.5 藥敏試驗(yàn)

通過PCR鑒定菌株的懸液，將TSB純培養(yǎng)物吸取0.2 mL無菌棉棒涂布含犢牛血清（終濃度10%）和NAD（終濃度0.1 g/mL）的TSA培養(yǎng)基，待干后，用無菌鑷子將藥敏片等距平貼于培養(yǎng)基表面，置37℃培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑d≥20 mm為高度敏感，15 mm＜d＜20 mm為中度敏感，d≤15 mm為低度敏感，無抑菌環(huán)為不敏感。選取藥物為：頭孢噻呋鈉30 μg/片、強(qiáng)力霉素30 μg/片、氟苯尼考 30 μg/片、恩諾沙星 5 μg/片、阿米卡星 30 μg/片、阿莫西林 10 μg/片、慶大霉素 10 μg/片。

4 結(jié)果

4.1 臨床剖檢調(diào)查結(jié)果

現(xiàn)場剖檢發(fā)現(xiàn)，40%的豬場存在典型的副豬嗜血桿菌發(fā)病癥狀，如胸腹腔積液、肝周炎、心包炎等。所調(diào)查的豬場100%存在萎縮性鼻炎感染發(fā)病的情況，并且鼻甲骨均為重度萎縮。

4.2 PCR檢測結(jié)果

經(jīng)PCR檢測，Hps的檢出率為45%（圖9），藍(lán)耳病的檢出率為 40%（圖 10），55.56%（5/9） 的 Hps感染豬場存在藍(lán)耳病混合感染現(xiàn)象。

4.3 組織病理學(xué)檢測結(jié)果

鏡檢可見化膿性腦膜炎病變，腦膜血管充血，大量中性粒細(xì)胞浸潤（圖11）；肺泡壁毛細(xì)血管充血，肺泡腔和支氣管內(nèi)大量中性粒細(xì)胞浸潤（圖12）；淋巴結(jié)呈漿液性淋巴結(jié)炎病變，淋巴小梁及實(shí)質(zhì)中毛細(xì)血管充血，水腫（圖13）；扁桃體毛細(xì)血管充血，隱窩擴(kuò)張，內(nèi)含中性白細(xì)胞（圖14）。

4.4 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

TSA培養(yǎng)基可見無色透明、邊緣整齊的小菌落（圖15）；革蘭氏染色可見散在絲狀、大小不等的革蘭氏陰性細(xì)小桿菌（圖16）。

細(xì)菌分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，35%的豬場存在副豬嗜血桿菌的感染，其中部分剖檢存在典型副豬嗜血桿菌感染的豬場未分離出該菌，這與抗生素的治療使用或許存在一定關(guān)系。另外部分剖檢未發(fā)現(xiàn)典型副豬嗜血桿菌感染的豬場分離出該菌，這或許與感染的副豬嗜血桿菌血清型存在一定聯(lián)系。對于副豬嗜血桿菌某些血清型，如 3、6、7、9、11 型，豬感染后通常無明顯臨床癥狀及病理變化。

4.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離到7株副豬嗜血桿菌整體對恩諾沙星、頭孢噻呋鈉高度敏感；對阿米卡星、慶大霉素中度敏感；對阿莫西林、氟苯尼考、強(qiáng)力霉素低度敏感（表2）。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 mm

5 調(diào)查啟示

5.1 Hps在山東省規(guī)?；i場廣泛存在

本次調(diào)查中，現(xiàn)場剖檢發(fā)現(xiàn)，40%的豬場存在較為典型的Hps病理變化；通過對病料進(jìn)行PCR鑒定，45%的豬場病料為陽性；通過細(xì)菌分離培養(yǎng)，35%的豬場分離到該菌。3種診斷方法的結(jié)果一致表明，Hps在山東省規(guī)?；i場普遍存在。

5.2 臨床混感較為普遍

Hps是一種上呼吸道的常在菌，也是一種條件性致病菌，在不利的飼養(yǎng)環(huán)境、應(yīng)激及其他病原菌侵襲下，可突破鼻黏膜屏障，引發(fā)全身性的感染。所以臨床上該菌常與萎縮性鼻炎、藍(lán)耳病、圓環(huán)病毒病等疾病混合感染[7-9]。鋸鼻結(jié)果顯示，所有豬場均存在重度萎縮性鼻炎病變；PCR鑒定結(jié)果顯示，55.56%的Hps感染豬場存在藍(lán)耳病混合感染現(xiàn)象；應(yīng)引起高度重視。

5.3 抗生素預(yù)防及治療效果不佳

豬細(xì)菌病可以選用敏感藥物來預(yù)防及治療，但是Hps的耐藥性產(chǎn)生較快，大量長期使用抗生素會造成藥物的敏感度日趨下降，從而影響該病的防控效果[10-11]。另外，Hps屬于革蘭氏陰性菌，被抗生素殺滅的同時(shí)會釋放內(nèi)毒素，使機(jī)體發(fā)熱，容易造成多重感染。盡管抗生素可以殺滅細(xì)菌，但是其不能抑制內(nèi)毒素的生物活性。此次調(diào)查的豬場均在哺乳仔豬階段進(jìn)行了藥物預(yù)防，從發(fā)病率來看，藥物預(yù)防效果并不理想。對分離菌株進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)，進(jìn)一步說明了該菌的耐藥性較強(qiáng)。

5.4 臨床剖檢需與其他疾病鑒別診斷

臨床剖檢疑似Hps感染病例多以纖維素性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎等為特征。但這些全身性感染的臨床癥狀及病變并非該病原的特異性變化。非溶血性大腸桿菌、放線桿菌、豬鼻支原體會引發(fā)纖維素性多漿膜炎[12]；鏈球菌、豬丹毒、豬滑液支原體可以引發(fā)跛行與關(guān)節(jié)炎[13]；豬偽狂犬病病毒及鏈球菌會引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；因此診斷時(shí)需要與其他病原進(jìn)行鑒別診斷。如不能確診，可以通過PCR和細(xì)菌分離等方法進(jìn)行確診，以避免因誤診而造成不必要的損失[14]。

5.5 實(shí)驗(yàn)室檢測工作繁瑣且要求嚴(yán)格

現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中可以通過豬群的臨床癥狀及病理剖檢進(jìn)行初步診斷。如要確診，還需要通過PCR、組織病理學(xué)及細(xì)菌分離培養(yǎng)等方法。臨床采集的病料可以直接用于PCR檢測，若要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)或細(xì)菌分型，則需要進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。但是Hps生長條件要求苛刻、生長速度緩慢、死亡快，培養(yǎng)難度較大[15]。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)首先應(yīng)選取臨床癥狀典型且未經(jīng)過抗生素治療的發(fā)病初期的病豬，用棉拭子在心包、關(guān)節(jié)、腦膜等封閉狀態(tài)部位采集。鑒于Hps是上呼吸道的常在菌，健康豬的鼻腔、扁桃體、氣管部位可分離出該菌；盡管其可以引發(fā)肺炎，但未必是引發(fā)肺炎的真正病原，可能是豬感染其他病原或者死亡后，該菌沿呼吸道下行侵入的，故臨床中一般不建議肺組織采樣。由于該菌很難在室溫下存活，所以采集的病料應(yīng)12～24 h內(nèi)盡快送檢，以提高細(xì)菌的檢出幾率。

5.6 需采取更合理有效的方法進(jìn)行防控

我國養(yǎng)豬水平逐年提升，但是作為常在菌和條件性致病菌的Hps，在豬群受到各種應(yīng)激或者其他疾病感染時(shí)，其常常并發(fā)或者繼發(fā)而在臨床中呈現(xiàn)，給豬場的疾病防控帶來了很大的困擾。盡管可以采取口服或者肌注抗生素來預(yù)防，但必須要在臨床癥狀出現(xiàn)前使用才會有效果；而一旦該菌進(jìn)入了漿膜、腦組織及關(guān)節(jié)后，抗生素將難以發(fā)揮作用。長期使用抗生素預(yù)防勢必造成耐藥性的增強(qiáng)，并且治療時(shí)會產(chǎn)生內(nèi)毒素，最終影響治療效果。因此，需采取更加合理有效的防控手段。

在豬場生產(chǎn)中，Hps在豬群中反復(fù)循環(huán)，可以通過水平傳播和垂直傳播。出生1周齡內(nèi)的仔豬，其鼻腔黏膜很容易存在該菌的寄生。因此，來自母豬的母源抗體和天然免疫是控制該病的關(guān)鍵性因素[15]。母豬免疫不僅能減少降低本身感染的幾率，同時(shí)也能減少仔豬上呼吸道Hps的定居數(shù)量以及定居菌株的血清型種類[16]，從而降低仔豬全身性感染的風(fēng)險(xiǎn)。通常情況下，母豬未免疫，其母源抗體一般2周內(nèi)消退非常明顯；而母豬免疫，其母源抗體可對6周內(nèi)的仔豬產(chǎn)生保護(hù)。若仔豬后期感染壓力較大，可考慮對2～3周齡仔豬進(jìn)行免疫。

Hps血清型眾多，盡管目前定型的有15種，但是依然有20%以上的菌株不能分型。雖然我國分離的血清型和歐美報(bào)道的一致，都是以4型和5型為主[17-18]，但是一個(gè)豬群中常出現(xiàn)幾個(gè)菌株或血清型，甚至在單個(gè)豬上不同部位可以分離多個(gè)菌株或血清型[19]。所以，選擇具有良好交叉免疫力的菌株及血清型的疫苗尤為重要[20]。

6 小結(jié)

近幾年，我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)取得了快速的發(fā)展，但副豬嗜血桿菌病已成為規(guī)?；i場主要的細(xì)菌性傳染病之一，該病的高發(fā)病率和死亡率使廣大豬場蒙受較大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也使得豬場耐藥性及用藥成本增加的現(xiàn)象頻頻發(fā)生。本次調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)山東省規(guī)模化豬場普遍感染副豬嗜血桿菌，并存在與豬萎縮性鼻炎、藍(lán)耳病混合感染的情況；分離菌株的耐藥性較為嚴(yán)重。該研究為副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)，也為該病的臨床預(yù)防提供了理論依據(jù)。

病毒是否通過糞口傳播待查

這兩天在湖北省武漢市、廣東省深圳市甚至在美國的首例病例中都在確診患者的糞便中檢測到了新型冠狀病毒核酸。2月2日，在國家衛(wèi)健委新聞發(fā)布會上，中國疾控中心傳染病處研究員馮錄召表示，這個(gè)現(xiàn)象說明了病毒可以在消化道復(fù)制并且存在，但是不是通過糞口傳播，或者通過含有病毒的飛沫形成氣溶膠的方式再傳播，需要流行病學(xué)調(diào)查和研究進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)現(xiàn)象。國家衛(wèi)健委疾控局副局長王斌表示，隨著假期臨近結(jié)束，各行各業(yè)的人陸續(xù)返回工作崗位。針對這樣一個(gè)防控形勢，已針對不同人群，分類制定了不同的防護(hù)規(guī)范和指南。

（摘自《健康報(bào)》2020.02.03葉龍杰/文）