鈣離子脅迫條件下苦蕎種質(zhì)資源多樣性分析

肖 雪， 章潔瓊2， 陳玉琳， 陳慶富， 朱麗偉， 霍冬敖

(1.貴州師范大學，生命科學學院，求是學院，苦蕎產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心， 貴陽 550025;2.貴州省農(nóng)作物技術(shù)推廣總站， 貴陽 550001)

中國西南喀斯特地區(qū)以貴州省為中心，該地區(qū)是喀斯特地貌分布面積大、發(fā)育最典型的片區(qū)之一，約占我國喀斯特地區(qū)總面積的27%[1]。在自然地理環(huán)境中，流水溶蝕石灰?guī)r的基礎上外界機械運動形成了獨特的喀斯特地貌[2]?？λ固丨h(huán)境是一個極其特殊的環(huán)境系統(tǒng)[3-5]：生境中的基巖多為可溶性碳酸鹽巖類，并隨著石漠化程度增加，土壤中鈣離子呈現(xiàn)正相關，其鈣含量約為酸性土壤的3倍[6-7]。鈣離子是植物生長發(fā)育中必需的礦質(zhì)元素之一[8]。種子萌發(fā)過程中，鈣離子通過改變酶活性，進而影響種子萌發(fā)速率，但不同植物種子萌發(fā)對于鈣離子濃度響應不一[9]。

苦蕎是雙子葉蓼科(Polygonaceae)苦蕎屬(FagopyrumMill)植物。中國是苦蕎的起源地和多樣性中心，有著豐富的野生資源和栽培品系[10]?？嗍w因其獨特的抗旱耐瘠、營養(yǎng)均衡，已成為中西部生態(tài)脆弱地區(qū)重要的糧經(jīng)作物[11-12]。近年來，隨著我國城鎮(zhèn)化率飛速攀升，土地資源無節(jié)制開發(fā)侵占了耕地資源，脆弱的喀斯特地區(qū)農(nóng)業(yè)面臨直接威脅。因此，篩選耐受高濃度鈣離子苦蕎基因資源，對脆弱地區(qū)生態(tài)保護有著重要意義。

本研究以不同來源地的苦蕎資源為研究對象，通過設置不同的鈣離子濃度，觀察苦蕎種子萌發(fā)情況，探究適宜苦蕎種子萌發(fā)的鈣離子濃度，為喀斯特等高富集鈣離子地區(qū)栽種適宜苦蕎品系提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所采用的材料來源于5省份共計30份苦蕎資源(表3)。

1.2 試驗方法：

1.2.1試驗設計

試驗共設置3個鈣離子濃度處理，每重復50粒種子，每處理重復2次。采用無水氯化鈣配置鈣離子溶液，濃度梯度設置為0，0.075，0.15 mol/L。

1.2.2種子萌發(fā)試驗

挑選大小一致、健康飽滿的苦蕎種子，用濃度為1%的次氯酸鈉消毒，蒸餾水清洗3～4次后置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿(直徑為9 cm)中，每皿50粒；將上述處理后的種子置于人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度：25 ℃，光照：16 h光照、8 h黑暗)；24 h后記錄種子的萌發(fā)數(shù)(以胚根突破種皮為標準，記錄露白粒數(shù))；每天觀察情況，直到第5天(每天補充適量溶液)。

1.2.3種子萌發(fā)參數(shù)的統(tǒng)計

依據(jù)苦蕎種子萌發(fā)特點，借助種子萌發(fā)特性分析軟件包GERMINATOR[13]中的方法，推算出5個與種子萌發(fā)相關指標2 dGR、5 dGR、GI、AUC、T 50，衡量種子發(fā)芽特性。其中：

2 dGR：發(fā)芽勢(%)=(2 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/每皿總種子數(shù))×100%；

5 dGR：發(fā)芽率(%)=(5 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/每皿總種子數(shù))×100%；

GI：發(fā)芽指數(shù)=Σ(Gt/Dt)，Dt是發(fā)芽日數(shù)，Gt為第t天的發(fā)芽種子數(shù)；

AUC(發(fā)芽曲線下面積)：將1～5 d的值連接起來，看覆蓋的面積，作為生活力指標；

T 50：發(fā)芽率達到50%所需要的時間。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗采用Microsoft Excel 2016軟件和SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。運用R 3.6.3統(tǒng)計軟件(https://www.R-project.org/)基于離差平方和法(Ward)的聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣對苦蕎種子萌發(fā)的影響

不同鈣離子濃度處理下，30種苦蕎品系種子萌發(fā)參數(shù)不盡相同(圖1)?？嗍w發(fā)芽勢隨鈣離子濃度的增加呈先升后降的趨勢。鈣離子濃度0 mol/L時，發(fā)芽勢均值為(73.23±10.16)%，當鈣離子濃度達到0.075 mol/L時，發(fā)芽勢快速上升，均值達到(89.27±6.03)%，與0 mol/L時發(fā)芽勢相比，差異達顯著水平。鈣離子濃度0.15 mol/L時，發(fā)芽勢快速下降，均值僅為(47.60±18.73)%。發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)以及AUC(發(fā)芽曲線下面積)參數(shù)與發(fā)芽勢表現(xiàn)出相同趨勢。其中AUC指的是將種子萌發(fā)1～5 d的值連接起來，所覆蓋的面積，該指標可以判定種子的生活力，當鈣離子濃度為0.075 mol/L時，AUC均值為(86.93±5.76)%，與鈣離子濃度0 mol/L以及0.15 mol/L時相比，AUC參數(shù)顯著提高。T 50可以衡量種子萌發(fā)的一致性。鈣離子濃度0.15 mol/L時，T 50均值為(48.65±8.53)h，而當鈣離子濃度為0 mol/L和0.075 mol/L時，該參數(shù)均值分別為(41.10±4.00)h和(28.80±5.17)h，差異分別達顯著。

2.2 苦蕎種子萌發(fā)參數(shù)相關性分析

由表1可知，5個萌發(fā)參數(shù)均呈極顯著相關。其中發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和AUC成正相關，T 50與這4個參數(shù)負相關。

2.3 苦蕎耐鈣極端種質(zhì)的初步篩選

綜合苦蕎萌發(fā)參數(shù)對30份苦蕎種質(zhì)進行聚類分析，并針對不同類群進行萌發(fā)參數(shù)方差分析(表2)。在鈣離子濃度0 mol/L時，苦蕎種質(zhì)劃分為3個大類群(圖2)，類群間在發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、AUC和T 50均存在差異(表2)。鈣離子濃度0.075 mol/L時，苦蕎種質(zhì)劃分為3個大類群(圖3)，類群間在萌發(fā)參數(shù)存在差異。其中Ca-0.075-II群種質(zhì)對于低濃度鈣離子響應比較靈敏，發(fā)芽指數(shù)、AUC和T 50與對照相比有顯著提升。鈣離子濃度0.15 mol/L時，苦蕎種質(zhì)同樣劃分為3個大類群，類群間在發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、AUC和T 50均存在差異(圖4)。在高鈣離子濃度地區(qū)，萌發(fā)受到影響，但Ca-0.15-II群種質(zhì)對響應較不敏感，相對萌發(fā)參數(shù)表現(xiàn)良好。

表1 鈣脅迫下苦蕎種子萌發(fā)參數(shù)的相關性分析

注：***:在0.001水平上極顯著相關。

表2 不同濃度鈣離子處理下苦蕎種質(zhì)聚類分析和萌發(fā)參數(shù)的差異分析

注：不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

3 討 論

在我國中西部喀斯特生態(tài)脆弱地區(qū)，苦蕎因其適應性極強，且富含氨基酸以及生物黃酮類物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)價值，已逐漸成為出口糧食之一[14]。芽菜苦蕎不涉及深加工過程，能最大限度保存營養(yǎng)物質(zhì)且風味獨特[15]，但苦蕎種子萌發(fā)過程中，存在著種子發(fā)芽率低、萌發(fā)一致性差等諸多因素，限制了芽菜苦蕎的進一步推廣。

3.1 鈣離子脅迫對苦蕎種子萌發(fā)的影響

本試驗研究表明，苦蕎種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和AUC參數(shù)均隨鈣離子濃度的增加表現(xiàn)出現(xiàn)先升后降的趨勢。環(huán)境鈣離子濃度較高時，外界較低的水勢脅迫種子吸水困難，呼吸作用受到抑制，進而導致種子萌發(fā)率降低[16]。這與李永濤等[17]和蔡喜悅等[7]的研究結(jié)果相一致。而呂朝燕等[18]研究表明，低濃度鈣離子脅迫可以顯著提高紫花苜蓿種子發(fā)芽率。劉小麗等[19]通過不同鈣離子濃度對香椿種子萌發(fā)因素進行研究表明，低鈣離子處理同樣可以促進種子的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等顯著提升。本研究發(fā)現(xiàn)，總體上低濃度鈣離子對苦蕎種子萌發(fā)具有促進作用，高濃度鈣離子脅迫對苦蕎種子萌發(fā)起到抑制作用。

3.2 基于復合萌發(fā)參數(shù)對苦蕎芽菜選育

為篩選出耐受喀斯特區(qū)域高濃度鈣離子苦蕎種質(zhì)資源和苦蕎芽菜最優(yōu)品系，基于種子萌發(fā)的5個指標參數(shù)將30份苦蕎品系進行聚類分析，類群間的方差分析揭示：在鈣離子濃度0.075 mol/L時，苦蕎Ca-0.075-III群6個品系具有較高的發(fā)芽指數(shù)、AUC，T 50數(shù)值最小，表明這些品系可以作為高種子發(fā)芽率、一致性芽菜推薦品系。而在鈣離子濃度0.15 mol/L時，Ca-0.15-II群13個品系具有較高的萌發(fā)率，可以作為喀斯特高鈣區(qū)域選育材料進行優(yōu)系選育。

表3 苦蕎種質(zhì)資源名稱及產(chǎn)地