甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白家族的分子作用機制及在胃癌中的研究進展

王婧,王文安,張安,甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 甘肅省蘭州市 730000

劉宏斌,解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院普外科 甘肅省蘭州市 730000

0 引言

甲基化修飾廣泛應(yīng)用于調(diào)節(jié)RNA、DNA和蛋白質(zhì)的活性,在正常機體和疾病的多種生物學(xué)行為中起重要作用,是近年來的研究前沿和熱點.s-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine,SAM)是幾乎所有細胞甲基化反應(yīng)的甲基供體,因此需要細胞精確地維持SAM的水平,但是目前對控制哺乳動物細胞內(nèi)SAM豐度的機制卻不甚了解.細菌使用核糖開關(guān)直接將細胞內(nèi)SAM水平與由蛋氨酸和ATP生成SAM的SAM合成酶的生產(chǎn)聯(lián)系起來.一些研究結(jié)果表明,人SAM合成酶的表達也受轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[1-4].核苷甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferaselike proteins,METTL)是蛋白質(zhì)的一個多樣化家族,其特征是存在甲基轉(zhuǎn)移酶樣結(jié)構(gòu)域和由中央的七鏈β-折疊結(jié)構(gòu)形成的結(jié)構(gòu)保守的SAM結(jié)合結(jié)構(gòu)域.到目前為止,DNA(胞嘧啶-5)甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)家族已經(jīng)得到了很好的研究,并被鑒定為DNA (Dnmt1、3a和3b),也被鑒定為RNA (Dnmt2)甲基轉(zhuǎn)移酶[5,6].METTL蛋白家族是通過調(diào)節(jié)SAM的濃度進而進行甲基化修飾.通過使用無標記定量質(zhì)譜系統(tǒng)研究了HeLa細胞中METTL蛋白家族成員的相互作用伴侶,發(fā)現(xiàn)許多METTL蛋白在穩(wěn)定的復(fù)合物之外發(fā)揮作用,而包括METTL3、METTL14和METTL7B在內(nèi)的其他蛋白家族成員則具有高置信度的相互作用伴侶[5,7-9].下文主要介紹METTL蛋白家族的分子作用機制以及其中的幾個家族成員在胃癌(gastric cancer,GC)中的研究進展.

1 METTL蛋白家族的概論

METTL蛋白家族的成員可在哺乳動物中甲基化RNA、DNA或蛋白質(zhì),家族成員主要進行RNA的甲基化修飾.

1.1 RNA甲基轉(zhuǎn)移酶 METTL3和METTL14催化mRNA和主要miRNA中N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)的形成.有趣的是,要使METTL3具有活性,必須與METTL14一起組成一個完整的體系[10].對于METTL7B,研究鑒定了跨膜蛋白TMEM126A是高度信任的相互作用因子.TMEM126A本身是Myc原癌基因蛋白的靶標,也是功能未知的線粒體膜蛋白,該基因的缺陷可導(dǎo)致7型視神經(jīng)萎縮.這種與線粒體膜蛋白的相互作用可能暗示了METTL7B在線粒體RNA甲基化中的潛在功能.METTL8可以在體外和人類細胞中催化RNA中3-甲基胞苷的形成.已經(jīng)確定脯氨酰4-羥化酶亞單位α1是METTL8的交互因子,可以推測METTL8將RNA修飾與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)合在一起.研究顯示METTL1可以在與Trna[鳥嘌呤-N(7)-]-甲基轉(zhuǎn)移酶非催化亞基WDR4形成復(fù)合體的情況下催化mRNA和tRNA中的7-甲基鳥苷形成[11-13].與此相反,另一種新近鑒定出的m6A RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL16似乎不需要其他蛋白質(zhì)來發(fā)揮其甲基轉(zhuǎn)移酶活性.通過對GFP-METTL16的純化進行活性測試,在體外RNA甲基轉(zhuǎn)移酶測定中,其純化包含預(yù)期的總細胞RNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性,這表明METTL16確實沒有為保持活性所需的必需伴侶[14].

1.2 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 敲除METTL4的RNAi不僅誘導(dǎo)G1期細胞周期停滯,而且導(dǎo)致中期染色體排列缺陷,進而提出METTL4可能使DNA甲基化[15].METTL9是一種類甲基化轉(zhuǎn)移酶,屬于DREVl轉(zhuǎn)甲基酶家族,可以與野生的P53結(jié)合,進而使DNA上的許多基因位點發(fā)生高甲基化,導(dǎo)致腫瘤抑制因子等重要基因失活.因此,可以通過研究DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑抑制特定位點上的核酸甲基化,進而可以糾正錯誤的甲基化修飾改變基因的表達,對疾病的診治提供新的思路[16,17].

1.3 蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶 METTL9和鈣連接蛋白前體(calnexin precursor,CANX)之間的相互作用,通過進行了GFP-METTL9免疫沉淀,并按預(yù)期通過免疫印跡檢測到CANX作為METTL9的相互作用因子.CANX在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)鈣濃度中起著重要作用,并且可以作為蛋白質(zhì)伴侶協(xié)助蛋白質(zhì)折疊和質(zhì)量控制.基于這種相互作用,我們可以推測METTL9可能是一種蛋白質(zhì)而不是RNA甲基轉(zhuǎn)移酶,并且可能將新生的蛋白質(zhì)折疊與翻譯后修飾結(jié)合在一起[7].研究表明METTL10和METTL11A是蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶[8,17].

2 METTL3-METTL4復(fù)合體的分子作用機制及其在GC中的研究進展

m6A被發(fā)現(xiàn)于20世紀70年代,是腺嘌呤(A)第6位氮原子發(fā)生甲基化而形成的一種修飾,是真核生物RNA最常見的甲基化修飾[18-20].m6A是哺乳生物中mRNA和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)中最常見的內(nèi)部修飾.M6A修飾受三種類型的酶調(diào)控：“寫入程序”(甲基轉(zhuǎn)移酶,包括WTAP,RBM15和METTL3/14/16等),“閱讀程序”(RNA結(jié)合蛋白和異質(zhì)核糖核蛋白的YTH域,包括YTHDF1/2/3等)和“橡皮擦”(脫甲基酶,包括ALKBH5和FTO),作用機制如圖1所示.m6A甲基轉(zhuǎn)移酶,結(jié)合蛋白和脫甲基酶可以誘導(dǎo)癌基因轉(zhuǎn)錄表達,癌細胞增殖,分化阻滯,侵襲,轉(zhuǎn)移,腫瘤發(fā)生和對癌癥治療的抵抗力[21,22].

METTL3可與METTL14、WTAP形成一個穩(wěn)定的異源二聚體,對哺乳動物的mRNA進行m6A甲基化修飾,這個復(fù)合體屬于甲基轉(zhuǎn)移酶類m6A調(diào)控蛋白[23-27].METTL3和METTL14均有甲基轉(zhuǎn)移酶活性,但METTL14的催化活性要遠高于METTL3.盡管單獨的METTL3或METTL14在體外表現(xiàn)出相對較弱的催化活性,METTL3-METTL4復(fù)合體則具有更高的催化能力.METTL3-METTL4復(fù)合體的結(jié)構(gòu)中只有METTL3與SAM結(jié)合,而METTL14起著底物識別的結(jié)構(gòu)性作用,因此,異二聚體METTL3-METTL14復(fù)合體被認為是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的催化結(jié)構(gòu)域[28].METTL3在催化中起到核心的作用,METTL14則起到支撐METTL3的結(jié)構(gòu)的作用.由METTL3-METTL4復(fù)合體介導(dǎo)的mRNA m6A修飾會導(dǎo)致mRNA衰減,降低mRNA穩(wěn)定性,促進mRNA從細胞核輸出到細胞質(zhì)以及將5-UTR-甲基化的mRNA翻譯成蛋白質(zhì).敲低METTL3或METTL14會重新調(diào)節(jié)許多轉(zhuǎn)錄本的表達,例如多能性因子Nanog,并損害胚胎干細胞分化[29-33].RNA甲基轉(zhuǎn)移酶還通過調(diào)節(jié)miRNA表達來調(diào)節(jié)基因表達,METTL3甲基化pri-miRNA,標記它們以進行識別和加工,并以與細胞類型無關(guān)的方式增強整體miRNA的成熟度[34].

GC是消化道最多見的惡性腫瘤,早期發(fā)現(xiàn)較為困難,一般在偶然檢查中發(fā)現(xiàn),往往已處于晚期,給患者及家屬帶來巨大的精神和經(jīng)濟壓力.GC的發(fā)病原因復(fù)雜,它的發(fā)生、發(fā)展是一個由多種癌基因包括原癌和抑癌基因、促凋亡和抑凋亡基因共同參與的多階段、多途徑的過程.從分子水平探討GC發(fā)病機制是近幾年來研究的熱點之一,基因水平的研究可以為GC的診斷、治療和預(yù)后的判斷開辟新的途徑[35-38].METTL3介導(dǎo)的m6A修飾存在于GC細胞中,鋅指MYM型含1 (zinc finger MYM-type containing 1,ZMYM1)是METTL3的真正m6A靶標.METTL3對ZMYM1 mRNA的m6A修飾依靠“閱讀器”蛋白HuR依賴性途徑增強了其穩(wěn)定性.此外,ZMYM1通過募集CtBP/LSD1/CoREST復(fù)合物結(jié)合并介導(dǎo)E-鈣粘蛋白啟動子的阻遏,從而促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化程序和轉(zhuǎn)移.揭示了METTL 3/ZMYM 1/E-鈣粘蛋白信號作為抗GC轉(zhuǎn)移策略中的潛在治療靶點[39].通過shRNA轉(zhuǎn)染敲低了人GC細胞系A(chǔ)GS和MKN45中的METTL3,RT-qPCR分析和蛋白質(zhì)印跡分別驗證了RNA干擾對mRNA和蛋白質(zhì)水平的有效性,發(fā)現(xiàn)METTL3可抑制AGS和MKN45細胞中的細胞增殖,遷移和侵襲.此外,METTL3減少GC細胞中的Bcl2和增加Bax和活性Caspase-3,這表明細胞凋亡途徑被激活.機制研究表明METTL3導(dǎo)致人GC細胞中AKT信號通路失活,包括AKT磷酸化水平降低以及下游效應(yīng)子p70S6K和Cyclin D1的表達.揭示了METTL3的下調(diào)會抑制人GC細胞的增殖和遷移,并導(dǎo)致AKT信號通路失活,這表明METTL3可能是治療人GC的潛在靶標[40-46].研究發(fā)現(xiàn),METTL14mRNA在GC組織中與癌旁組織相比,表達水平顯著降低.通過RNAi干擾內(nèi)源性METTL14表達后,可顯著促進GC細胞的增殖、侵襲和遷移.結(jié)果說明METTL14可能在GC發(fā)生發(fā)展過程中起到抑癌基因作用,METTL14的抑癌作用也許能為GC臨床分型診斷、治療方案選擇以及衡量愈合提供一個新的生物學(xué)標志[47,48].

3 METTL9的分子作用機制及其在GC中的研究進展

METTL9是P53的一個下游基因,METTL9的染色體定位是在16p12-13,由六個外顯子和五個內(nèi)含子組成,METTL9mRNA的開放閱讀框在282-1130 bp處,編碼序列長度為849 bp.METTL9基因序列能與野生型P53蛋白結(jié)合,與突變型P53蛋白幾乎不結(jié)合.METTL9蛋白為親水性蛋白,存在一個跨膜區(qū),大約在42-79氨基酸片段,沒有信號肽[17,49].METTL9是一種類甲基化轉(zhuǎn)移酶,屬于DREVl轉(zhuǎn)甲基酶基因家族,與DREVl基因具有高相似性,而且與野生的P53的內(nèi)含子區(qū)域結(jié)合,致使發(fā)生高甲基化,導(dǎo)致腫瘤抑制因子等重要基因失活.在該蛋白酶的作用下,可能使DNA的SAM的甲基轉(zhuǎn)移到CpG二核苷酸的胞嘧啶5位碳原子上,生成5-甲基胞嘧啶,最終導(dǎo)致DNA甲基化,引起癌癥的發(fā)生[6,16].

圖1 N6-甲基腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶,去甲基化酶和結(jié)合蛋白的作用機制.橘色箭頭表示抑制作用,灰色箭頭表示促進作用.

METTL9基因作為P53的一個下游基因在GC組織中高表達,在正常組織中低表達并在GC組織中隨組織分化程度減低表達成上升趨勢[49].所以,我們可以把METTL9當(dāng)作腫瘤標記物對腫瘤風(fēng)險進行評估,進而得到預(yù)防策略,對早期診斷及手術(shù)方式提供指導(dǎo).

4 METTL16的分子作用機制及其在GC中的研究進展

METTL16是鑒定出的第二種甲基腺苷(methyladenosine,mA)甲基轉(zhuǎn)移酶,其已知的底物包括U6小核核糖核酸(small nuclear RNA,snRNA)和編碼轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄物1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)的人MAT2A mRNA[49-51].METTL16在結(jié)構(gòu)上與METTL3類似,但具有一些獨特的元素,例如Rossmann折疊中的獨特αB螺旋.與METTL3-METTL14復(fù)合體相比,全長METTL16形成同型二聚體,一種天然的凝膠位移分析表明METTL16與MALAT1 RNA三螺旋結(jié)合.此外,盡管METTL16的結(jié)晶部分具有與全長多肽相同的活性,但METTL3-METTL14復(fù)合體的催化結(jié)構(gòu)域需要METTL3的N末端CCCH基序才能發(fā)揮全部活性,可能需要額外的結(jié)構(gòu)域才能將RNA底物正確定位在METTL3-METTL14復(fù)合體的催化腔內(nèi),而METTL16的延伸環(huán)足以定向其RNA底物以進行mA修飾.因此,盡管METTL3和METTL16的催化活性可能具有相似的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),但由于延伸環(huán)的位置和其他RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的存在,導(dǎo)致底物特異性差異很大[52-54].METTL16誘導(dǎo)mRNA的3-UTR以及U6小核RNA的A43中的mA修飾,該堿基在剪接過程中與前mRNA的5個剪接位點堿基配對,這表明METTL16在mRNA穩(wěn)定性和剪接中起重要作用.有趣的是,一項研究提出了METTL16在mRNA前剪接過程中發(fā)揮了額外的作用,使METTL16可以作為無論是mA的“書寫器”還是“閱讀器”.作為mA的“書寫器”,METL16在SAM存在下迅速甲基化MAT2A mRNA,導(dǎo)致內(nèi)含子保留,然后發(fā)生核降解[55,56].當(dāng)SAM水平低時,MAT2A mRNA上METTL16的長期占據(jù)會增強保留內(nèi)含子的剪接.從大腸桿菌到人均發(fā)現(xiàn)METTL16同源物,它們均具有N端甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域.作為SAM依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶,預(yù)測METTL16具有高度保守的Rossmann折疊[57].MALAT1核糖核酸三螺旋本身或鄰近區(qū)域是METTL16的底物.MAT2A保留的內(nèi)含子的剪接被快速誘導(dǎo)蛋氨酸耗竭后,此效應(yīng)需要一個保守的發(fā)夾(hp1),我們進一步顯示了它是METTL16 mA底物.重要的是,敲除METTL16可以消除蛋氨酸缺乏條件下對MAT2A剪接的誘導(dǎo),同時將METTL16強制結(jié)合到MAT2A 3UTR足以在Met充足的條件下促進剪接.我們提出了一個模型,其中MAT2A hp1上的METTL16占用促進了保留的內(nèi)含子的剪接.在高SAM含量下,METTL16迅速結(jié)合,甲基化和解離,有利于內(nèi)含子保留.在SAM限制條件下,METTL16不能有效地甲基化,這會增加其在hp1上的停留時間并刺激保留的內(nèi)含子的剪接.我們得出的結(jié)論是METTL16是保守的U6 snRNA甲基轉(zhuǎn)移酶,它已經(jīng)在脊椎動物中進化出了另一種功能,通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)SAM合成酶基因的表達來控制SAM穩(wěn)態(tài)[58-61].

雖然,目前對于METTL16在GC中的研究還沒有相關(guān)文獻的報道,但是METTL16相關(guān)的兩個癌基因MAT2A和MALAT1已經(jīng)被證實與GC的發(fā)生發(fā)展相關(guān).對癌組織及癌旁組織進行實時熒光定量 PCR與Western blot技術(shù)檢測,結(jié)果顯示GC組織中MAT2A mRNA相對表達量明顯高于癌旁正常胃組織,表明MAT2A在GC中表達上調(diào)[59].MALAT1基因在GC組織中呈高表達,下調(diào)MALAT1基因表達可有效抑制GC細胞增殖、遷移和侵襲力,為以MALAT1為靶點的GC基因靶向治療奠定了基礎(chǔ)[55].

5 結(jié)論

目前,METTL蛋白家族引起了人們的極大興趣,因為該蛋白家族被認為涵蓋了許多潛在的新型甲基轉(zhuǎn)移酶.但是,對于許多METTL蛋白,尚不清楚它們是否確實是活性酶,以及它們的底物是什么：RNA,DNA或蛋白質(zhì).最近發(fā)現(xiàn),在我們研究的酶中,除METTL3-14復(fù)合體外,還有METTL7B,METTL8和METTL16等都是RNA甲基轉(zhuǎn)移酶.在過去的幾年中,由METTL家族成員催化的新發(fā)現(xiàn)、新類型和新的RNA修飾位點的首次功能表征,激發(fā)了對該蛋白家族的興趣.METTL蛋白家族對GC的作用已經(jīng)有一些研究進展,但調(diào)控機制尚不明確,對METTL蛋白家族的深入研究將對GC乃至所有腫瘤的診療有極其重要的意義.