lncRNA DCST1-AS1靶向miR-874-3p對直腸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

顏王鑫,戚曉哲,林繼徐,周慧珍,陳亮,溫州市人民醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科 浙江省溫州市 325000

孫躍勝,溫州市人民醫(yī)院普外科 浙江省溫州市 325000

0 引言

直腸癌(rectal cancer,RC)是世界上常見的消化道惡性腫瘤,且50歲以下人群發(fā)病率呈上升趨勢,且晚期患者居多[1,2].隨著分子生物學(xué)的進步與發(fā)展,分子靶向治療可能成為治療RC的重要手段,因而探究新的診斷和治療靶點,有助于提高治療效果及改善患者預(yù)后.多種長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA)和miRNA在RC中表達(dá)失調(diào),并可能作為RC診斷及治療的潛在靶點[3].研究表明,lncRNA DCST1-AS1在肝癌和三陰性乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),其表達(dá)水平與癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4,5].經(jīng)StarBase預(yù)測發(fā)現(xiàn),miR-874-3p與lncRNA DCST1-AS1存在結(jié)合位點.miR-874-3p在食管鱗狀細(xì)胞癌、上皮性卵巢癌組織及結(jié)RC組織中低表達(dá),與癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移或凋亡有關(guān)[6-8].但lncRNA DCST1-AS1和miR-874-3p在RC組織和細(xì)胞中的表達(dá)、作用及兩者的關(guān)系,目前還尚未可知.本課題研究lncRNA DCST1-AS1和miR-874-3p在RC組織中的表達(dá),及兩者對RC SW1463細(xì)胞增殖、凋亡的影響和分子機制,以期為RC的靶向治療提供新靶點.

1 材料和方法

1.1 材料 選取2017-06/2018-12本院病理檢查確診為RC的患者手術(shù)切除的RC組織及癌旁組織(距離RC組織邊緣＞5 cm)各30例,將組織標(biāo)本置于液氮中保存,術(shù)后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存.男19例,女11例,年齡19-74歲(49.93歲±18.59歲),參照AJCC第八版RC pTNM分期系統(tǒng)進行分期：Ⅰ期4例,Ⅱ期12例,Ⅲ期9例,Ⅳ期5例.所有患者術(shù)前未接受放療和化療.人RC細(xì)胞株SW1463購自美國ATCC；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司；四氮唑藍(lán)(thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT)、二甲基亞礬(dimethyl sulfoxide,DMSO)和胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich公司；凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑、實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；lncRNA DCST1-AS1抑制物(si-DCST1-AS1)、lncRNA DCST1-AS1過表達(dá)載體pcDNA-DCST1-AS1、miR-874-3p mimics (miR-874-3p)、miR-874-3p干擾劑(anti-miR-874-3p)、陰性對照(si-NC、miR-NC、anti-miR-NC、pcDNA)和引物購自上海吉瑪制藥有限公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)購自美國Promega公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；流式細(xì)胞儀購自美國BD公司；Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：將RC SW1463細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素)中,置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),消化傳代.將對數(shù)生長期的SW1463細(xì)胞以2×l05個細(xì)胞/孔接種于6孔板中,細(xì)胞融合度達(dá)到80%時根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染.根據(jù)轉(zhuǎn)染載體分組為si-NC組、si-DCST1-AS1組、miR-NC組、miR-874-3p組、pcDNA組、pcDNA-DCST1-AS1組、si-DCST1-AS1+anti-miRNC組和si-DCST1-AS1+anti-miR-874-3p組.轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞驗證后進行后續(xù)實驗.

1.2.2 Real-time PCR檢測lncRNA DCST1-AS1和miR-874-3p的表達(dá)：用TRIzol試劑提取RC組織、癌旁組織或細(xì)胞總RNA,保存于-80℃.然后按照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書合成cDNA,以cDNA為模板進行Real-time PCR檢測miR-874-3p和lncRNA DCST1-AS1,反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min；然后95 ℃ 15 s,55 ℃1 min,共40個循環(huán).引 物 如 下：miR-874-3p 上 游：5’-GAACTCCACTGTAGCAGAGATGGT-3’,下游：5’-CATTTTTTCCACTCCTCTTCTCTC-3’；lncRNA DCST1-AS1上游：5’-TTCGTCTGGTCCCAATGTGTGG-3’,下游：5’-AAGCAGGACGAGTAAACCAACC-3’.用2-△△Ct方法進行數(shù)據(jù)分析.

1.2.3 MTT實驗測定細(xì)胞增殖：將SW1463細(xì)胞以1×103個細(xì)胞/孔(100 μL細(xì)胞/孔)接種于96微孔板中,分別在培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時進行MTT實驗,每孔分別加入20 μL MTT溶液,培養(yǎng)4 h,棄培養(yǎng)上清,每孔再加入150 μL DMSO,室溫震蕩混勻15 min,酶標(biāo)儀測定490 nm吸光度值.

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率：將轉(zhuǎn)染后各組SW1463細(xì)胞接種于6孔板中,培養(yǎng)至對數(shù)生長期,收集細(xì)胞后用PBS緩沖液洗滌2次,胰酶消化,根據(jù)凋亡試劑盒說明書操作,上流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞凋亡率.

1.2.5 Western blot檢測細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白1(CyclinD1)、p21、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)蛋白：收集轉(zhuǎn)染后各組SW1463細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,將蛋白樣本進行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)PVDF膜,室溫封閉2 h,加入稀釋后的一抗,37 ℃過夜孵育,洗膜后加入稀釋的酶標(biāo)二抗,顯影,拍照,以GAPDH為內(nèi)參照,分析蛋白表達(dá)水平.

1.2.6 雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗：根據(jù)方法1.2.1進行轉(zhuǎn)染,將構(gòu)建的lncRNA DCST1-AS1的野生型(WT-DCST1-AS1)和突變型(MUT-DCST1-AS1)雙熒光素酶報告載體,分別與miR-NC或miR-874-3p共轉(zhuǎn)染SW1463細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48 h,收集、裂解細(xì)胞并離心收集上清,根據(jù)試劑盒說明書進行操作,以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照,檢測并計算相對螢火蟲熒光素酶活性.

統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)均以mean±SD表示,數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進行分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.兩組間采用獨立樣本t檢驗,多實驗組間比較采用單因素方差進行分析.

2 結(jié)果

2.1 lncRNA DCST1-AS1和miR-874-3p在RC組織中的表達(dá) 與癌旁組織組相比,在RC組織組中l(wèi)ncRNA DCST1-AS1含量顯著升高(P＜0.05),而miR-874-3p含量顯著降低(P＜0.05)(表1).

2.2 抑制lncRNA DCST1-AS1表達(dá)對RC SW1463細(xì)胞增殖的影響 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、Western blot和MTT實驗結(jié)果表明,與si-NC組相比,si-DCST1-AS1組SW1463細(xì)胞中的lncRNA DCST1-AS1含量降低,細(xì)胞活性[光密度(optical density,OD)=490 nm]在24 h、48 h、72 h均顯著下降,CyclinD1含量降低,p21蛋白含量升高,均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖1和表2).說明抑制lncRNA DCST1-AS1表達(dá)可以抑制RC SW1463細(xì)胞增殖.

2.3 抑制lncRNA DCST1-AS1表達(dá)對RC SW1463細(xì)胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染si-DCST1-AS1后,與對照si-NC組相比,si-DCST1-AS1組的SW1463細(xì)胞凋亡率顯著增加,Bcl-2含量降低,Bax含量升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖2和表3).

2.4 lncRNA DCST1-AS1靶向調(diào)控miR-874-3p的表達(dá)通過StarBase預(yù)測發(fā)現(xiàn),miR-874-3p與lncRNA DCST1-AS1的序列中含互補的位點(圖3).雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示,與對照miR-NC組相比,miR-874-3p組野生型WT-DCST1-AS1的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P＜0.05),而突變型MUT-DCST1-AS1的螢火蟲熒光素酶相對活性無變化(表4).qRT-PCR結(jié)果表明,上調(diào)lncRNA DCST1-AS1可下調(diào)miR-874-3p含量,下調(diào)lncRNA DCST1-AS1可顯著上調(diào)miR-874-3p含量(表5).

2.5 miR-874-3p過表達(dá)對RC SW1463細(xì)胞增殖和凋亡的影響 結(jié)果表明,與miR-NC組相比,miR-874-3p組SW1463細(xì)胞中的miR-874-3p含量顯著升高,細(xì)胞OD值在24 h、48 h和72 h時均顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高,CyclinD1和Bcl-2蛋白含量降低,p21和Bax含量升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),見圖4和表6.

2.6 干擾miR-874-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA DCST1-AS1表達(dá)對RC SW1463細(xì)胞增殖和凋亡的作用 為確認(rèn)lncRNA DCST1-AS1通過調(diào)控miR-874-3p對RC SW1463細(xì)胞增殖和凋亡發(fā)揮調(diào)控作用,在抑制lncRNA DCST1-AS1同時干擾miR-874-3p.結(jié)果表明,與si-DCST1-AS1+anti-miR-NC組相比,si-lncRNA DCST1-AS1+antimiR-874-3p組SW1463細(xì)胞OD值在24 h、48 h和72 h時顯著升高,細(xì)胞凋亡率顯著降低,CyclinD1和Bcl-2蛋白含量升高,p21和Bax含量降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖5和表7).

3 討論

多種lncRNA、miRNA和mRNA在RC中上調(diào)或下調(diào),通過lncRNA-miRNA等內(nèi)源性RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),參與大腸癌發(fā)生發(fā)展[3,9-13].因而本研究積極探尋新型LncRNA并探究其在RC發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機制,為RC的靶向治療提供新方向.

DCST1-AS1是一種lncRNA,在三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)組織中表達(dá)上調(diào),MYC激活DCST1-AS1,并與miR-873-5p結(jié)合促進TNBC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,DCST1-AS1基因敲除抑制TNBC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[5].lncRNA DCST1-AS1在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)組織中也高表達(dá),并且其高表達(dá)與較大的腫瘤和較短的存活時間顯著相關(guān),敲除DCST1-AS1顯著抑制HCC細(xì)胞增殖、促進細(xì)胞凋亡和周期阻滯,并抑制體內(nèi)腫瘤生長,DCST1-AS1競爭性結(jié)合miR-1254,從而上調(diào)Fas凋亡抑制劑2促進HCC細(xì)胞的增殖[14].lncRNA DCST1-AS1在RC中的表達(dá)和作用尚不清楚.本研究檢測30例RC組織發(fā)現(xiàn),與癌旁組織相比,在RC組織中l(wèi)ncRNA DCST1-AS1的含量顯著升高,抑制lncRNA DCST1-AS1可降低細(xì)胞中CyclinD1和Bcl-2含量,提高p21和Bax蛋白含量,抑制RC SW1463細(xì)胞增殖并促進細(xì)胞凋亡.

另外,本研究通過StarBase預(yù)測發(fā)現(xiàn),miR-874-3p與lncRNA DCST1-AS1的序列間存在互補結(jié)合位點.通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)和qRT-PCR進一步發(fā)現(xiàn),lncRNA DCST1-AS1靶向負(fù)調(diào)控miR-874-3p的表達(dá).miR-874在多種癌癥中發(fā)揮抑癌基因的作用.miR-874-3p在肝細(xì)胞癌組織下調(diào),過表達(dá)miR-874-3p可靶向PIN1抑制腫瘤增殖并促進細(xì)胞凋亡[15].miR-874-3p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)降低,過表達(dá)miR-874-3p可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和管形成能力[16].miR-847在胃癌樣本中表達(dá)下調(diào),其過表達(dá)可靶向水通道蛋白-3抑制胃癌細(xì)胞的生長、遷移、侵襲和致瘤性[17].miR-874在結(jié)RC組織中表達(dá)明顯下調(diào)并可抑制結(jié)RC細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18].本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-874-3p在RC組織中表達(dá)下調(diào),過表達(dá)miR-874-3p可抑制RC SW1463細(xì)胞增殖,促進細(xì)胞凋亡,且干擾miR-874-3p表達(dá)則會逆轉(zhuǎn)抑制lncRNA DCST1-AS1對SW1463細(xì)胞增殖、凋亡的作用,驗證了兩者在RC中存在調(diào)控關(guān)系.

綜上,本研究闡述了在RC組織中,lncRNA DCST1-AS1上調(diào),miR-874-3p下調(diào),在RC SW1463細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DCST1-AS1靶向miR-874-3p調(diào)控SW1463細(xì)胞增殖和凋亡,lncRNA DCST1-AS1可能是RC的潛在分子靶點.

文章亮點

實驗背景

近年來,直腸癌(rectal cancer,RC)發(fā)病率與死亡率逐年上升,已嚴(yán)重威脅人類生命安全,目前RC發(fā)生及發(fā)展的分子機制尚未完全闡明.目前臨床主要采用手術(shù)與放化療結(jié)合等方式進行治療,患者預(yù)后很差.隨著生物技術(shù)的發(fā)展,分子靶向治療逐漸成為RC等腫瘤的新型治療手段,但關(guān)于RC靶向治療的潛在作用靶點尚未完全闡明.

表1 lncRNA DCST1-AS1和miR-874-3p在直腸癌組織中的表達(dá)(mean±SD,n=30)

表2 抑制長鏈非編碼RNA DCST1-AS1表達(dá)對直腸癌SW1463細(xì)胞增殖的影響(mean±SD,n=9)

表3 抑制長鏈非編碼RNA DCST1-AS1表達(dá)對直腸癌SW1463細(xì)胞凋亡的影響(mean±SD,n=9)

表4 雙熒光素酶報告實驗(mean±SD,n=9)

實驗動機

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA)在RC等腫瘤中表達(dá)異常,但關(guān)于其具體作用機制尚未完全闡明,lncRNA主要通過靶向調(diào)控miRNA表達(dá)而調(diào)控其靶基因表達(dá)從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡等生物學(xué)過程,已有研究顯示lncRNA DCST1-AS1在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因作用,但其在RC中的表達(dá)及其作用機制尚未闡明.

表5 長鏈非編碼RNA DCST1-AS1調(diào)控miR-874-3p表達(dá)(mean±SD,n=9)

表6 miR-874-3p過表達(dá)對直腸癌SW1463細(xì)胞增殖和凋亡的影響(mean±SD,n=9)

表7 干擾miR-874-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制長鏈非編碼RNA DCST1-AS1表達(dá)對直腸癌SW1463細(xì)胞增殖和凋亡的作用(mean±SD,n=9)

實驗?zāi)繕?biāo)

本研究主要探究lncRNA DCST1-AS1在RC中的表達(dá)及其對miR-874-3p的靶向調(diào)控作用,為進一步揭示RC發(fā)病機制奠定實驗基礎(chǔ),以期為RC的靶向治療提供潛在的靶點.

實驗方法

圖1 增殖相關(guān)蛋白表達(dá).CyclinD1:細(xì)胞周期蛋白1; GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶.

圖2 抑制長鏈非編碼RNA DCST1-AS1表達(dá)對直腸癌SW1463細(xì)胞凋亡的影響.A:凋亡相關(guān)蛋白表達(dá); B:細(xì)胞凋亡流式圖.Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2; Bax:B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白; GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶.

圖3 lncRNA DCST1-AS1的序列中含有與miR-874-3p互補的核苷酸序列.WT-DCST1-AS1:野生型載體; MUT-DCST1-AS1:突變型載體.

圖4 miR-874-3p過表達(dá)對直腸癌SW1463細(xì)胞凋亡的影響.A:增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá); B:細(xì)胞凋亡流式圖.CyclinD1:細(xì)胞周期蛋白1;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶; Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2; Bax:B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白.

采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測RC組織及細(xì)胞中l(wèi)ncRNA DCST1-AS1與miR-874-3p的表達(dá)；采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)分別將si-NC、si-DCST1-AS1、miRNC、miR-874-3p mimics、si-DCST1-AS1與anti-miRNC、si-DCST1-AS1與anti-miR-874-3p轉(zhuǎn)染至RC細(xì)胞；采用MTT法檢測細(xì)胞增殖；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率；采用Western blot法檢測細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；采用雙熒光素酶報告實驗驗證lncRNA DCST1-AS1和miR-874-3p的靶向關(guān)系.

圖5 干擾miR-874-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA DCST1-AS1對直腸癌SW1463細(xì)胞凋亡的作用.A:增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá); B:細(xì)胞凋亡流式圖.CyclinD1:細(xì)胞周期蛋白1; GAPDH:甘油醛-3-磷酸脫氫酶; Bcl-2:B淋巴細(xì)胞瘤-2; Bax:B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白.

實驗結(jié)果

lncRNA DCST1-AS1在RC組織及細(xì)胞中呈高表達(dá),而miR-874-3p呈低表達(dá)；干擾lncRNA DCST1-AS1表達(dá)或miR-874-3p過表達(dá)可顯著抑制RC細(xì)胞增殖,促進細(xì)胞凋亡,并可促進p21、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白表達(dá)及抑制細(xì)胞周期蛋白1、B淋巴細(xì)胞瘤-2表達(dá)；lncRNA DCST1-AS1可靶向結(jié)合miR-874-3p,并可負(fù)向調(diào)控miR-874-3p的表達(dá)；干擾miR-874-3p表達(dá)與干擾lncRNA DCST1-AS1表達(dá)共同處理可顯著減弱干擾lncRNA DCST1-AS1表達(dá)對RC細(xì)胞增殖及凋亡的作用.

實驗結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA DCST1-AS1在RC細(xì)胞中表達(dá)水平升高,miR-874-3p的表達(dá)水平降低；本研究提出干擾lncRNA DCST1-AS1表達(dá)可能通過靶向上調(diào)miR-874-3p的表達(dá)從而抑制RC細(xì)胞增殖及促進細(xì)胞凋亡；本研究結(jié)果可為RC的靶向治療提供新方向,lncRNA DCST1-AS1可能作為RC治療的潛在靶點.

展望前景

本研究將繼續(xù)探究miR-874-3p下游靶基因表達(dá),并分析lncRNA DCST1-AS1-miR-874-3p-靶mRNA分子軸在RC發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機制；本研究將進一步采用體內(nèi)動物實驗驗證lncRNA DCST1-AS1-miR-874-3p-靶mRNA分子軸在RC發(fā)病中的作用機制.