凍融循環(huán)對(duì)川西亞高山森林土壤酶活性的影響

陳子豪,張曉蓉,譚 波,衛(wèi)芯宇,諶 亞,楊玉蓮,3,吳慶貴,3,張 麗,*

1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)林業(yè)研究所,長(zhǎng)江上游林業(yè)生態(tài)工程四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,高山森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站, 成都 611130 2 四川阿壩藏族羌族自治州川西林業(yè)局, 阿壩州 624000 3 綿陽師范學(xué)院生態(tài)安全與保護(hù)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 綿陽 621000

土壤酶主要來源于土壤微生物代謝過程,以及土壤動(dòng)物、植物根系分泌及殘?bào)w分解[1]。土壤酶是土壤生態(tài)系統(tǒng)過程的重要參與者,在養(yǎng)分礦化和有機(jī)質(zhì)分解中起著至關(guān)重要的作用[2],土壤酶活性的調(diào)控因子包括土壤水分、溫度、團(tuán)聚體和微生物等[3- 5]。季節(jié)性凍融循環(huán)是全球中高緯度和高海拔地區(qū)重要的氣候特征[6]。凍融循環(huán)將改變土壤濕度和溫度,從而對(duì)土壤酶活性有著重要影響[7-8]。未來氣候變化導(dǎo)致凍融循環(huán)格局和頻次的改變,在高海拔地區(qū)可能更加顯著[9-10]。冬季降雪的減少意味著雪被保溫作用的減少,從而導(dǎo)致土壤凍融強(qiáng)度、凍結(jié)深度和凍融循環(huán)次數(shù)的增加[11-12],勢(shì)必改變底物有效性、土壤溫度、水分狀況等土壤酶的調(diào)控因子[13]。同時(shí),凍融循環(huán)還會(huì)促進(jìn)土壤的機(jī)械破碎,導(dǎo)致凋落物和根系殘?bào)w釋放大量養(yǎng)分,引起土壤酶活性變化[14]?？梢?凍融循環(huán)及其變化都將直接或間接影響土壤酶活性,最終改變土壤的生態(tài)過程。因此研究?jī)鋈谘h(huán)頻次的加劇對(duì)亞高山森林土壤酶活性的影響具有重要意義。

位于長(zhǎng)江上游的川西亞高山森林作為重要的生態(tài)屏障,在氣候調(diào)節(jié)、水源涵養(yǎng)、水土保持和生物多樣性保護(hù)等方面具有不可替代的作用和地位[15]。受地理位置、地質(zhì)條件和氣候的影響,每年11月至次年4月,該區(qū)森林土壤具有明顯的季節(jié)性凍融過程[16]。在全球氣候變暖的背景下,研究?jī)鋈谘h(huán)對(duì)川西亞高山森林土壤酶活性的影響,有助于認(rèn)識(shí)土壤酶應(yīng)對(duì)氣候變化的潛在機(jī)制。但前人在該地區(qū)凍融循環(huán)對(duì)土壤酶影響的研究結(jié)果沒有一致的規(guī)律[17-19],因此本文以川西亞高山三種森林類型(針闊混交林、針葉林、闊葉林)土壤為研究對(duì)象,采用室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn),研究?jī)鋈谘h(huán)對(duì)川西亞高山不同森林類型6種土壤酶活性的影響,以期為深入理解高寒森林生態(tài)系統(tǒng)對(duì)季節(jié)性凍融循環(huán)的響應(yīng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

研究樣地位于四川省綿陽市平武縣,王朗國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(32° 98′ N,104° 08′ E),海拔約2600 m。該區(qū)域地處橫斷山北緣的高山峽谷地區(qū),青藏高原和四川盆地的過渡帶,屬于丹巴-松潘半濕潤季風(fēng)氣候,5月至10月為濕季,11月至次年4月為干季,年降水量801—825 mm,集中在5—8月。年平均氣溫2.5—2.9℃,1月平均溫度-6.1℃,7月平均溫度12.7℃,土壤季節(jié)性凍融期長(zhǎng)達(dá)5—6個(gè)月。

區(qū)域內(nèi)土壤類型主要為棕壤和暗棕壤,森林類型屬于亞高山暗針葉林區(qū),針葉林(Coniferous forest, CF)主要樹種為紫果云杉(Piceapurpurea),林下植被有管花鹿藥(Smilacinahenryi)、茜草(Rubiacordifolia)、條裂鐵線蕨(Adiantumcapillus-veneris)等；混交林(Mixed forest, MF)主要由岷江冷杉(Abiesfaxoniana)、紫果云杉(Piceapurpurea)、紅樺(Betulaalbosinensis)和高叢珍珠梅(Sorbariaarborea)等組成,林下植被有高山杜鵑(Rhododendronlapponicum)、缺苞箭竹(Fargesiadenudata)、白苞蒿(Artemisialactiflora)等；闊葉林(Broadleaf forest, BF)主要由梾木(Cornusmacrophylla)、槭屬(AcerLinn.)、稠李屬(PadusMill.)、茶藨子(Ribesjanczewskii)和高山柳(Salixcupularis)等組成,林下植被有缺苞箭竹(Fargesiadenudata)、胡頹子(Elaeagnuspungens)、水金鳳(Impatiensnoli-tangere)等[15-16, 20]。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2017年5月采集供試土壤,在王朗國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的針闊混交林、針葉林以及闊葉林內(nèi)分別選取3個(gè)坡向與坡度相似的樣地,每個(gè)樣地內(nèi)隨機(jī)布設(shè)1個(gè)5 m×5 m的樣方,在每個(gè)樣地內(nèi)用五點(diǎn)取樣法采集去除凋落葉、苔蘚等地被物的0—10 cm土壤混合均勻,將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室,剔除根系和雜質(zhì),取一部分用于測(cè)定土壤理化性質(zhì),其余過2 mm篩,存于4℃冰箱待用。對(duì)應(yīng)收集各樣地的凋落葉,風(fēng)干備用,同時(shí)取一部分凋落葉測(cè)定其理化性質(zhì)。土壤和凋落葉理化性質(zhì)詳見衛(wèi)芯宇等[21]。

每個(gè)樣地分別稱取250 g過篩新鮮土樣,置于350 mL的培養(yǎng)罐中,土壤的含水量統(tǒng)一調(diào)節(jié)并保持為60%田間持水量。基于前期觀測(cè)數(shù)據(jù)和溫度動(dòng)態(tài)特征[16],模擬野外溫度變化設(shè)置凍融循環(huán)處理,凍融循環(huán)處理為-5℃培養(yǎng)12 h和5℃培養(yǎng)12 h視為一個(gè)周期,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。用保鮮膜封住培養(yǎng)罐口防止其他雜質(zhì)的輸入,并用針在保鮮膜上扎多個(gè)小孔,保持培養(yǎng)罐內(nèi)外空氣流通[21]。分別在培養(yǎng)的第5、10、20、40、80次凍融循環(huán)時(shí)取樣測(cè)定各土壤酶活性。

1.3 土壤酶活性測(cè)定

酶活性的測(cè)定采用Sinsabaugh[6],Allison[22-23]等的酶標(biāo)板法并做部分修改。稱取3 g土壤加入20 mL,50 mmol,pH = 5.0的醋酸緩沖溶液中,用磁力攪拌機(jī)攪拌2 min,得到的混合液為粗酶液。設(shè)置底物對(duì)照組、粗酶液對(duì)照組和樣品測(cè)量組；底物對(duì)照組：150 μL底物+100 μL醋酸緩沖液,粗酶液對(duì)照組：100 μL粗酶液+150 μL醋酸緩沖液,樣品測(cè)量組：100 μL粗酶液+150 μL底物。各土壤酶對(duì)應(yīng)的底物見(表1),過氧化物酶、多酚氧化酶的酶標(biāo)板還需分別加20 μL 0.3% H2O2和20 μL 20 mmol乙二胺四乙酸(EDTA)。

酶標(biāo)板放在恒溫箱30℃下避光培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間見(表1)。除過氧化物酶、多酚氧化酶之外,每個(gè)酶標(biāo)板加20 μL 1 mol NaOH以終止反應(yīng)。過氧化物酶、多酚氧化酶活性通過測(cè)量各自在DNM- 9602型酶標(biāo)儀450 nm、410 nm處的最大吸光度來量化,其余土壤酶在405 nm處測(cè)定,單位表達(dá)為μmol g-1h-1。

表1 土壤酶活性測(cè)定的底物和培養(yǎng)時(shí)間

pNP：對(duì)硝基苯酚,p-Nitrophenyl；EDTA：乙二胺四乙酸,Ethylenediaminetetraacetic Acid

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0(IBM SPSS Statistics, Chicago, IL, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用重復(fù)測(cè)量方差分析(RMANOVA)檢驗(yàn)凍融環(huán)境、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)各林型土壤酶活性的影響。利用單因素方差分析(ANOVA)對(duì)同次取樣不同林型和不同溫度環(huán)境同林型在不同培養(yǎng)時(shí)間的土壤酶活性進(jìn)行分析,顯著性水平設(shè)為P= 0.05。使用Origin Pro 2018(OriginLab, Northampton, MA, USA)軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

凍融循環(huán)對(duì)碳(C)相關(guān)土壤酶活性產(chǎn)生了一定的影響,但均沒有達(dá)到顯著水平。針葉林、闊葉林土壤的纖維素酶活性隨著凍融次數(shù)的增加先升高后降低,且均在凍融循環(huán)第20次時(shí)達(dá)到最高；β-葡萄糖苷酶活性在凍融前期較低且表現(xiàn)平穩(wěn),后期則明顯升高,但這一規(guī)律不適用于針闊混交林；3種林型的土壤過氧化物酶、多酚氧化酶活性在凍融循環(huán)期間無明顯變化趨勢(shì)(圖1)。在凍融循環(huán)期間,不同林型的土壤C相關(guān)酶活性存在顯著差異。其中,針葉林的土壤纖維素酶活性顯著高于闊葉林；而闊葉林的土壤過氧化物酶活性顯著低于針闊混交林和針葉林(圖1,表2)。

圖1 凍融循環(huán)下三種林型土壤碳相關(guān)酶活性Fig.1 Soil enzyme activities of three forest types in Freeze-thaw cycles FTC：凍融循環(huán),Freeze-Thaw Cycles；FT：林型,Forest Type；CBH：纖維素酶,Cellulase；BG：β-葡萄糖苷酶,β-Glucosidase；POD：過氧化物酶,Peroxidase；PPO：多酚氧化酶,Polyphenol Oxidase；不同小寫字母表示同一次取樣各林型之間差異顯著(P < 0.05)；不同大寫字母表示同一林型在培養(yǎng)時(shí)間上的差異顯著(P < 0.05)

凍融循環(huán)對(duì)氮(N)相關(guān)土壤酶活性產(chǎn)生了極顯著的影響(P< 0.01)。3種林型的土壤β-N-乙酰葡萄糖苷酶在凍融循環(huán)前期呈現(xiàn)升高趨勢(shì),后期則顯著下降并趨于平穩(wěn)；闊葉林的β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性變化范圍較??；針葉林和闊葉林的β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性在凍融循環(huán)第40次時(shí)最低(圖2)。在凍融循環(huán)期間,不同林型的土壤β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性存在一定的差異,主要表現(xiàn)在凍融循環(huán)前期,針葉林的土壤β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性明顯高于針闊混交林和闊葉林。同時(shí)凍融循環(huán)和林型的交互作用對(duì)土壤β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性影響不顯著(圖2,表2)。

圖2 凍融循環(huán)下三種林型β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性Fig.2 β-N-acetylglucosidase activities of three forest types in Freeze-thaw cyclesFTC：凍融循環(huán),Freeze-Thaw Cycles；FT：林型,Forest Type；NAG：β-N-乙酰葡萄糖苷酶,β-N-Acetylglucosidase；不同小寫字母表示同一次取樣各林型之間差異顯著(P < 0.05)；不同大寫字母表示同一林型在培養(yǎng)時(shí)間上的差異顯著(P < 0.05)

圖3 凍融循環(huán)下三種林型磷酸酶活性Fig.3 Phosphatase activities of three forest types in Freeze-thaw cyclesFTC：凍融循環(huán),Freeze-Thaw Cycles；FT：林型,Forest Type；AP：磷酸酶,Phosphatase；不同小寫字母表示同一次取樣各林型之間差異顯著(P < 0.05)；不同大寫字母表示同一林型在培養(yǎng)時(shí)間上的差異顯著(P < 0.05)

凍融循環(huán)對(duì)磷(P)相關(guān)的土壤酶活性產(chǎn)生了顯著的影響(P< 0.05)。針葉林的土壤磷酸酶活性隨凍融次數(shù)的增加而升高,針闊混交林和針葉林的土壤磷酸酶活性均在培養(yǎng)到第20次時(shí)達(dá)到最高,而闊葉林則在第40次凍融循環(huán)時(shí)達(dá)到最高。在凍融循環(huán)期間,不同林型的土壤磷酸酶活性存在顯著差異(圖3)。其中,針葉林的土壤磷酸酶活性顯著高于針闊混交林、闊葉林,從第20次凍融循環(huán)持續(xù)到培養(yǎng)結(jié)束都表現(xiàn)出這一特征；而且闊葉林的土壤磷酸酶活性變化范圍明顯較小。與上述土壤酶一樣,凍融循環(huán)和林型的交互作用對(duì)土壤磷酸酶活性影響不顯著(圖3,表2)。

3 討論

川西亞高山森林土壤在凍融季節(jié)仍有著較高的土壤酶活性[24]。凍融循環(huán)會(huì)引起土壤水熱條件、團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)以及土壤中可利用養(yǎng)分的改變[25],從而影響到土壤酶活性。研究發(fā)現(xiàn),隨著凍融頻次的增加,土壤纖維素酶活性和β-葡萄糖苷酶活性均有所增加(圖1)。這可能是由于凍融循環(huán)頻次的增加導(dǎo)致更多的土壤有機(jī)質(zhì)從顆粒物中釋放,使水溶性有機(jī)碳含量上升,土壤微生物活性得到增加[26]。在凋落物分解的不同階段,由不同的土壤酶分別占據(jù)主導(dǎo)地位[27],從而對(duì)應(yīng)不同的土壤有機(jī)質(zhì)分解過程[6]。在有機(jī)質(zhì)分解早期,含量較高的纖維素被優(yōu)先分解,此時(shí)纖維素酶活性較高；在纖維素分解最后一步,β-葡萄糖苷酶將葡萄糖二聚體和某些纖維素低聚糖水解為葡萄糖[28],此時(shí)其活性較高；本研究也得出了相似的規(guī)律(圖1)。同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)林型對(duì)土壤纖維素酶活性產(chǎn)生顯著影響。根據(jù)資源配置理論,土壤酶的生產(chǎn)是微生物的一種取食策略,存在調(diào)節(jié)機(jī)制；底物濃度的高低意味著其獲取的難易程度,微生物在生產(chǎn)土壤酶時(shí)會(huì)權(quán)衡資源配置,盡可能降低生產(chǎn)成本[29]。林型的差異直接導(dǎo)致可利用有機(jī)質(zhì)的差異,刺激微生物生產(chǎn)土壤酶的“經(jīng)濟(jì)法則”[30]。表2中,針葉林的土壤纖維素酶活性顯著高于闊葉林,是由于針葉林可直接利用的碳較少,這刺激針葉林的微生物和植物生產(chǎn)較多的纖維素酶以獲取足夠的碳,因此其纖維素酶活性較高。但不同林型的樹種組成、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、有機(jī)質(zhì)含量以及凋落物質(zhì)量存在差異[31-33],初始凋落物質(zhì)量被視為凋落物分解的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)力之一[34-35],這勢(shì)必造成土壤酶活性的差異,使針闊混交林的土壤纖維素酶、β-葡萄糖苷酶活性與單一林型相比不存在明顯變化規(guī)律(圖2)。

表2 凍融循環(huán)下三種林型土壤酶活性重復(fù)測(cè)量方差分析(RMANOVA)結(jié)果

表中數(shù)值為各次測(cè)定酶活性平均值,單位：μmol g-1h-1；同列不同小寫字母表示林型間差異顯著(P< 0.05)

土壤過氧化物酶主要氧化酚類、胺類為醌,能夠反應(yīng)土壤腐殖化狀況；土壤多酚氧化酶是一種非特異性酶,可分解木質(zhì)素和腐殖酸等難降解聚合物[36]。影響土壤中多酚氧化酶和過氧化物酶活性的因素包括可溶性酚類化合物的濃度、植物凋落物中木質(zhì)素的含量、土壤pH值和氮素利用率；同時(shí)土壤過氧化物酶、多酚氧化酶在環(huán)境中穩(wěn)定性較土壤水解酶差,時(shí)空變化巨大,變異系數(shù)可達(dá)300%[37]。本研究發(fā)現(xiàn),土壤過氧化物酶、多酚氧化酶活性受凍融循環(huán)的影響不顯著,原因可能有兩點(diǎn)：(1)在高寒生態(tài)系統(tǒng)中,土壤中的過氧化物酶和多酚氧化酶活動(dòng)受到土壤低溫和低氧的限制[6]；而凍融循環(huán)沒有去除這些限制,甚至加強(qiáng)了限制,其對(duì)該地區(qū)復(fù)雜有機(jī)質(zhì)分解和合成中相關(guān)土壤酶的影響需進(jìn)一步研究。(2)土壤微生物生產(chǎn)過氧化物酶、多酚氧化酶出于多種目的,包括個(gè)體生長(zhǎng)、解毒酚類物質(zhì)、獲取C資源等,導(dǎo)致其活性是多個(gè)生態(tài)過程的綜合結(jié)果[37],凍融循環(huán)的影響也是多方面的,因此很難直接量化二者關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn),林型對(duì)土壤過氧化物酶活性產(chǎn)生顯著影響。林型之間的樹種和微生物群落結(jié)構(gòu)等存在差異[32],最終影響過氧化物酶活性及分布。本研究的針葉林以杉木為主,杉木根、根樁分解過程中產(chǎn)生沒食子酸、香草醛等多酚類物質(zhì)[38],這刺激了針葉林土壤過氧化物酶活性的增加,從而使針闊混交林和針葉林土壤的過氧化物酶活性顯著高于闊葉林。

在培養(yǎng)期間,凍融循環(huán)顯著影響了土壤β-N-乙酰葡萄糖苷酶和磷酸酶活性。β-N-乙酰葡萄糖苷酶將幾丁質(zhì)水解成氨基糖,參與了微生物吸收N[29],其在土壤N循環(huán)中具有重要作用。頻繁的凍融作用改變土壤結(jié)構(gòu)并釋放大量活性有機(jī)碳,還會(huì)造成部分植物根系死亡,促進(jìn)其殘?bào)w的腐爛和降解,進(jìn)而加快了N循環(huán)速率[39-40],給β-N-乙酰葡萄糖苷酶提供可利用的養(yǎng)分和有機(jī)碳源,因此其活性在凍融循環(huán)前期明顯升高。凍融循環(huán)對(duì)不同林型N循環(huán)的影響存在差異。本研究中,針葉林的土壤β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性顯著高于針闊混交林和闊葉林(表2),這與前人的研究結(jié)果形似,不同林型在凍融循環(huán)期間,土壤氨氧化古細(xì)菌的數(shù)量及分布,土壤脲酶活性存在差異[24]；同時(shí),淺雪被斑塊土壤的凈氮氨化量、硝化量和礦化量均表現(xiàn)為冷杉次生林高于針闊混交林[41]。土壤磷酸酶能夠催化磷酸酯的水解反應(yīng),將土壤有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為無機(jī)磷酸根離子以后供根系吸收[42],常用來反映土壤有效磷轉(zhuǎn)化方向和強(qiáng)度[43]。前人研究發(fā)現(xiàn),磷酸酶活性在未凍結(jié)土壤中比凍結(jié)土壤中高兩倍[44],凍結(jié)環(huán)境會(huì)降低磷酸酶活性,而在凍結(jié)末期磷酸酶活性會(huì)相對(duì)較高[8],與本研究結(jié)果一致。本研究中凍融循環(huán)前期三種林型土壤磷酸酶活性均較低,但隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加,土壤磷酸酶活性呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)(圖3)。這可能與土壤的持水量有關(guān),土壤濕團(tuán)聚體穩(wěn)定性一般隨凍融循環(huán)次數(shù)由3次增加到6次而增加,超過6次開始降低[45],可溶性磷含量增加[46],導(dǎo)致土壤磷酸酶活性增加。

綜上所述,川西亞高山森林的與C相關(guān)土壤酶活性受凍融循環(huán)影響有限,三種林型間與C相關(guān)土壤酶活性的差異主要由凋落物組分不同造成,凍融循環(huán)在該地區(qū)對(duì)土壤C循環(huán)的影響還需深入研究。凍融循環(huán)顯著影響川西亞高山森林與N和P相關(guān)土壤酶活性,其中,β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性顯著升高后下降并平穩(wěn),磷酸酶在培養(yǎng)后期顯著升高。不同林型的土壤酶對(duì)凍融循環(huán)的響應(yīng)存在差異。說明,凍融循環(huán)格局改變對(duì)川西亞高山森林土壤生態(tài)過程有著深遠(yuǎn)的影響。這些結(jié)果為進(jìn)一步探討全球變暖背景下亞高山森林土壤酶活性變化提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù),本研究只是室內(nèi)短期模擬實(shí)驗(yàn),土壤酶活性對(duì)凍融循環(huán)格局長(zhǎng)期波動(dòng)的響應(yīng)有待進(jìn)一步監(jiān)測(cè)研究。