兩棲類皮膚石蠟切片樣本量探討
——以峨眉髭蟾毛細血管豐富度為例

許雙， 戴強， 張丕珠， 鄭渝池*

(1. 中國科學(xué)院成都生物研究所，成都610041； 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

兩棲動物皮膚的功能包括離子及水交換(Bentley & Yorio，1979；Marrero & Hillyard，1985；Sullivanetal.，2000)、感覺(Kitson & Roberts，1983；Mearow & Diamond，1988)、機械與化學(xué)防御(Fox，1986；Evans & Brodie，1994；Woodhamsetal.，2007；Jeckeletal.，2015)和呼吸(Duellman & Trueb，1994；Nussbaum & Wilkinson，1995；Bickfordetal.，2008；Robischon，2017)。對皮膚各功能對應(yīng)結(jié)構(gòu)特征的量化常借助石蠟切片技術(shù)，涉及如分裂相表皮細胞比例(耿欣蓮，1959)、皮膚各層厚度(Grevenetal.，1995；Barrionuevo，2017；Yangetal.，2019)、腺體數(shù)量和大小(de Almeidaetal.，2007；Gon?alves & de Brito-Gitirana，2008；Yangetal.，2019)等。特征值的準確獲得受樣本設(shè)計影響。目前在石蠟切片技術(shù)領(lǐng)域，即使針對相同特征，已發(fā)表工作所采用的設(shè)計(包括切片數(shù)、測量數(shù)等)也少見統(tǒng)一(Norrisetal.，1989；劉滿櫻等，2007；李洋等，2009；Pratesetal.，2012；Brunettietal.，2016；Barrionuevo，2017；Ponssaetal.，2017；Wanningeretal.，2018)。例如皮膚各層厚度的測量，曹燕等(2011)對齒突蟾屬Scutiger4個物種背腹面等距測量5次，而Chammas等(2015)對疣蟾Rhinellagranulosa背腹面測量30次，Ponssa等(2017)對細趾蟾屬Leptodactylus物種背部不同部位測量5次，VanBuren等(2019)對白唇樹蛙Litoriainfrafrenata背腹及后肢腹面隨機測量10次。

不同結(jié)構(gòu)特征的量化，緣其自身特點，對樣本設(shè)計的要求理當(dāng)不同。實際工作中，同一批次石蠟切片樣品往往為不同特征提供數(shù)據(jù)。通過直接測量即可獲得數(shù)據(jù)的指標，如厚度可能需要較小的樣本量。而另外一些無法直接測量的特征則可能需要更大工作量的取樣，進而影響制備切片樣品的策略和工作量。因此，對后者樣本設(shè)計的探討有利于實踐工作。

皮膚氣體交換主要發(fā)生于表皮下毛細血管，其密度為衡量呼吸能力的一項重要參數(shù)(Krogh，1904；Feder & Burggren，1985；Malvin，1988，1993)。通過向兩棲動物活體心臟注射墨水，可染色毛細血管并測量其單位面積內(nèi)的長度(Czopek，1965；de Saint-Aubain，1982)。但基于動物倫理的考量，該方法近年來已罕有使用，現(xiàn)常用石蠟切片計數(shù)評估皮膚毛細血管豐富度?；诿氀苡嫈?shù)和切面長度，單條切片僅可提供一個豐富度值。為獲得有代表性的結(jié)果，需要相當(dāng)?shù)臉颖玖?。在長時間完全沒入水中的情況下，一些蛙類有戰(zhàn)斗和鳴叫等依賴于高效率皮膚呼吸的行為，但其相應(yīng)皮膚毛細血管特征尚待研究。這些蛙類中生活史和行為學(xué)研究開展較多的物種之一為峨眉髭蟾Leptobrachiumboringii(Zhengetal.，2011；Hudson & Fu，2013)。本研究以峨眉髭蟾10個部位表皮下毛細血管豐富度為例，通過對樣本進行重抽樣，探討取樣與結(jié)果穩(wěn)定性的關(guān)系，以期為兩棲類皮膚切片的樣品制備策略提供參考。

1 材料與方法

峨眉髭蟾隸屬角蟾科Megophryidae，主要分布于四川盆地周邊山地，每年2—4月于溪流中繁殖，其余時間陸棲。2只峨眉髭蟾標本于2019年5、6月采自四川省峨眉山，均為非繁殖季節(jié)雄性成體，編號為IOZCAS09432(吻肛距=80.6 mm，大個體)、IOZCAS09433(吻肛距=72.2 mm，小個體)。該物種非繁殖季節(jié)時活動隱秘，陸棲個體多年來少有獲取，對其陸棲個體皮膚毛細血管豐富度的報道有利于國內(nèi)外同行據(jù)此進行對比分析。氣體交換是蛙類皮膚的重要功能，體型較大的個體因其體表面積/體質(zhì)量比較小，毛細血管豐富度較高。2只個體體型大小不同，若符合該預(yù)期則支持實測結(jié)果的可靠性。麻醉采用低于5%乙醇以減小刺激，固定液為8%甲醛，固定后流水置換甲醛24 h再轉(zhuǎn)70%乙醇長期保存。切片前，每只蛙取頭背部、軀干背部、前肢背側(cè)、后肢背側(cè)、體側(cè)、下頜、胸部、下腹、前肢腹側(cè)、后肢腹側(cè)10個身體右側(cè)部位皮膚，均為5 mm×6 mm長方形。對皮膚組織進行常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚度6 μm。每塊皮膚盡量獲得約15張載玻片的連續(xù)切片，每張載玻片上為3列、每列15條切片。蘇木精-伊紅染色(Preece，1965)，樹膠封片。

編寫R腳本對30個樣本值無放回抽樣，模擬1載玻片×1圖像、1載玻片×2圖像、……、1載玻片×6圖像、2載玻片×1圖像、……、5載玻片×5圖像共29種樣本設(shè)計，每種設(shè)計1 000次重復(fù)。不同設(shè)計的樣本大小共16種情況，包括1、2、3、4、5、6、8、9、10、12、15、16、18、20、24、25。不同載玻片被抽取的皮膚切片/圖像位置相同，以契合常見的等距取樣策略(曹燕等，2011；Brunettietal.，2012；Pratesetal.，2012)。1 000個模擬結(jié)果的均值幾等于真實結(jié)果。以真實結(jié)果的5%為評判閾值，即樣本均值×0.05，若其大于1 000個模擬結(jié)果的標準差，則大多數(shù)模擬結(jié)果和真實結(jié)果的相似性高于95%、該模擬設(shè)計可靠。以此相似性標準，統(tǒng)計各部位獲得接近真實結(jié)果所需樣本量，記錄滿足該標準的3個最小樣本量的中位數(shù)。為比較相同樣本量、不同工作量的設(shè)計，對“1載玻片×5圖像、5載玻片×1圖像”和“2載玻片×5圖像、5載玻片×2圖像”這2對設(shè)計的模擬結(jié)果標準差進行配對t檢驗。對毛細血管豐富度和可靠設(shè)計數(shù)量進行Pearson相關(guān)檢驗，以探索前者對所需樣本量的影響。各檢驗在SPSS 11.0中進行，數(shù)據(jù)處理前用Kolmogorov-Smirnov檢驗確認用于配對t檢驗的變量的差值和用于Pearson檢驗的變量不顯著偏離正態(tài)分布(P值均大于0.05)。

2 結(jié)果

2只個體表皮下毛細血管豐富度分布模式基本一致。與其理論上較低的體表面積/體質(zhì)量比值相符，大個體各部位毛細血管豐富度多高于小個體(圖1)。兩者在體側(cè)和后肢腹側(cè)都有較高密度的毛細血管，為10.5～15.3條/mm；而頭背部是毛細血管密度均較低的部位，分別為4.6條/mm和6.1條/mm。

圖1 2只雄性峨眉髭蟾身體右側(cè)10個部位表皮下毛細血管豐富度Fig. 1 Densities of capillaries beneath the epidermis in 10 parts on the right side of 2 male Leptobrachium boringii

和預(yù)期相符，模擬結(jié)果隨著樣本量的增加趨近實測值(圖2：A)。各部位模擬結(jié)果有差異(表1)：體側(cè)、下頜、下腹、后肢腹側(cè)獲得接近真實結(jié)果所需最小樣本量約為8，密度較低的頭背部則需20或25，密度最低的小個體胸部無法獲得接近真實值的模擬結(jié)果。大個體所需樣本量更小、可靠樣本設(shè)計共95個，小個體為46個；除前肢背側(cè)相同外，大個體各部位可靠樣本設(shè)計均多于小個體。Pearson相關(guān)檢驗表明，2只個體各部位毛細血管豐富度和可靠設(shè)計數(shù)量均呈顯著正相關(guān)(圖2：B，C)，大、小個體相關(guān)系數(shù)分別為0.855和0.874(P值均小于0.01，n=10)。配對t檢驗顯示，當(dāng)樣本量固定為5或10時，不同工作量的抽樣設(shè)計對結(jié)果影響不明顯，模擬結(jié)果標準差之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均大于0.1，n=10)。

表1 可靠模擬設(shè)計Table 1 Successfully simulated sampling designs

注：*可靠模擬設(shè)計數(shù)小于3時， 直接列出樣本量

Note：*When there are less than 3 successfully simulated sampling designs， the sample size of each design is listed

3 討論

本研究系統(tǒng)中，對一些部位如頭背部、前肢背側(cè)表皮下毛細血管豐富度的量化需要較多的切片。對比大、小個體，各部位表皮下毛細血管相對豐富度分布基本一致，有較小體表面積/體質(zhì)量比的大個體毛細血管豐富度更高。兩者體側(cè)和后肢腹側(cè)較高的毛細血管密度與在蛙類中已觀察到的模式相同(Czopek，1965；Toledo & Jared，1993)。無尾兩棲類后肢腹側(cè)是皮膚水、氣交換的關(guān)鍵部位，毛細血管密度一般較高(Roth，1973；Bentley & Yorio，1979)。這些一致性提示本工作的實測結(jié)果可靠?；趯崪y數(shù)據(jù)的模擬顯示，小個體雄性多數(shù)部位需要接近20條組織或更高的樣本量，大個體多數(shù)部位需要接近15條或更高的樣本量。對比相同樣本量、不同工作量的取樣設(shè)計，基于較大工作量即更多制片的取樣未得到顯著理想的結(jié)果。但2對設(shè)計的樣本量均較小，分別為5和10，不足以支持較少制片的策略，有待于在更合適的研究系統(tǒng)中探討。一套皮膚石蠟切片可用于不同特征的量化，實際工作中也常如此，制片量不能僅針對需少量樣本即可準確量化的特征。常規(guī)石蠟切片實驗周期較長，但更多的展片、染色、封片并不會大幅增加工作量。相反，如果后期發(fā)現(xiàn)樣本量不夠、追加取樣則會成倍耗費時間。另外，以毛細血管密度為例，一些特征在兩棲動物皮膚不同部位的分布很不均一(Moallietal.，1980)，追加取樣可能難以對應(yīng)部位、無法補救。因此，建議在兩棲類皮膚石蠟切片工作中對全部有效切片進行制片，以滿足不同特征對樣本量的要求。

對比不同個體相同部位以及同一個體不同部位，表皮下毛細血管豐富度與所需樣本量呈負相關(guān)。這顯示來自高血管豐富度部位的測量值方差更小，這些部位的血管分布可能更均勻。這樣的規(guī)律是否在其他兩棲動物中存在、在什么樣的毛細血管豐富度范圍內(nèi)存在，仍需考查。如有其普遍性，則對實際工作有指導(dǎo)意義。如前所述，同一物種的較小個體一般有更高的皮膚面積/體質(zhì)量比，故可能有較低的毛細血管密度。兩棲動物皮膚毛細血管豐富度分布有一定規(guī)律可循，部分物種的該特征已有量化(Czopek，1965；de Saint-Aubain，1982；Malvin，1988；Toledo & Jared，1993)。某些生活史特征如陸棲、水棲與該特征關(guān)聯(lián)(耿欣蓮，1959；唐以杰等，1999；Barejetal.，2010)。這些已有信息可否用于抽樣策略的制定，有待在其他兩棲動物類群中進行與本工作類似的相關(guān)性分析。需要指出的是，本工作以模擬結(jié)果的標準差是否小于實測結(jié)果值的5%為判斷依據(jù)，該閾值在低豐富度部位顯然更小，但這樣的設(shè)定更符合以相似性評判結(jié)果穩(wěn)定性的實踐標準。

圖2 模擬結(jié)果示例和毛細血管豐富度對所需樣本量的影響Fig.2 An example of the simulation results and the relationship between capillary densities and sample sizes required

致謝：衷心感謝中國科學(xué)院成都生物研究所曾一唯師姐、周星梅老師、曾曉茂老師的幫助與建議。