基于PCR快速檢測(cè)分析某院ICU患者中CRE菌株耐藥特點(diǎn)

花鴻燕，包海林，戴繪芬

(江蘇省海安市中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 海安 226600)

抗碳青霉烯類腸桿菌(carbapenem-resistant enterobacter，CRE)作為一組腸道桿菌，包含70多種細(xì)菌，如大腸埃希菌、產(chǎn)氣腸桿菌、肺炎克雷伯菌等，常導(dǎo)致免疫力低下或受重大感染的患者形成由切口、泌尿道等部位的感染[1]。近年來(lái)隨著CRE抗菌藥物在臨床中的大量應(yīng)用，CRE的檢出率也不斷上升，且由于CRE菌株對(duì)CRE廣譜抗生素具有極強(qiáng)的耐藥性，因此感染CRE的患者病死率非常高[2]。有研究表明，在CRE菌株中檢測(cè)到Ⅰ型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase 1,NDM-1)基因，而NDM-1具有使碳青霉烯類或其他β-內(nèi)酰胺抗生素功效降低甚至喪失的特點(diǎn)，因此含有NDM-1基因的CRE菌株會(huì)對(duì)大多數(shù)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，從而限制臨床治療，導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床感染，影響患者的生命健康[3]。有數(shù)據(jù)顯示對(duì)含NDM-1基因的CRE菌株易感人群主要包括重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit，ICU)患者、行機(jī)械通氣者及長(zhǎng)期服用抗菌類藥物者，因此，在臨床上若對(duì)CRE感染者使用抗菌藥物效果不顯著時(shí)，應(yīng)考慮其感染的細(xì)菌否含有NDM-1基因[4]?，F(xiàn)階段針對(duì)CRE治療的方式非常有限，且不同地區(qū)CRE感染所含基因型也各不相同，醫(yī)院作為大型醫(yī)療場(chǎng)所，若不及時(shí)控制CRE散播，則可能造成嚴(yán)重的院內(nèi)感染[5]。因此本研究通過(guò)對(duì)某院ICU患者進(jìn)行相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查，并進(jìn)一步分析CRE感染及耐藥情況，為預(yù)防CRE大面積傳播提供科學(xué)參考依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料及菌株來(lái)源 選取2020年3月—2021年5月江蘇省海安市中醫(yī)院收治的ICU患者150例，其中男性87例，女性63例，年齡53～68歲，平均(64.31±3.31)歲，進(jìn)ICU時(shí)間2～8 d，平均(4.24±1.52)d，檢測(cè)菌株來(lái)源主要包括尿液、血液、痰液等標(biāo)本，剔除同一患者相同部位分離出的同種菌株。

1.2儀器與試劑 SPUBACT細(xì)菌培養(yǎng)基(型號(hào)為Ⅲ-3)由武漢迪艾斯科技有限公司提供；全自動(dòng)微生物測(cè)定儀(型號(hào)為Walk Away-96 Plus)由西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司提供；細(xì)菌鑒定及藥敏測(cè)試卡由法國(guó)生物梅里埃公司提供；電泳儀由美國(guó)Bio-Rad公司提供；聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增儀由美國(guó)Bio-Rad公司提供；細(xì)菌DNA提取試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供；PCR試劑由上海生物工程有限公司提供。質(zhì)控菌株包括大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、金黃色葡萄球菌ATCC25922。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)菌培養(yǎng)及CRE提取方法 對(duì)ICU患者無(wú)菌操作獲取標(biāo)本后，立即送往微生物室進(jìn)行鑒定，按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)范》對(duì)所采集到的臨床標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，使用全自動(dòng)微生物測(cè)定儀對(duì)菌種進(jìn)行鑒定，采用紙片擴(kuò)撒法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)并根據(jù)食品藥品監(jiān)督管理局所頒布的判定標(biāo)準(zhǔn)確定藥敏結(jié)果，挑取過(guò)夜培養(yǎng)后的單個(gè)純菌落，通過(guò)VITEK-2系統(tǒng)配套的GN鑒定卡和AST-GN14藥敏卡完成CRE菌株的篩選。采用改良Hodge試驗(yàn)檢測(cè)碳青霉烯酶：將生理鹽水與將大腸埃希菌ATCC 25922菌懸液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，并稀釋生理鹽水(1∶10)；棉簽蘸取稀釋后的菌液均勻涂于MH瓊脂皿上，干燥5 min；將美羅培南紙片置于MH瓊脂皿上；挑取3～5個(gè)過(guò)夜生長(zhǎng)菌落﹐垂直于藥敏紙片﹐從紙片邊緣開(kāi)始劃長(zhǎng)度20～25 mm的直線線并進(jìn)行細(xì)胞培育，20 h后如果在被測(cè)菌株與大腸埃希菌ATCC25922抑菌圈交匯處，大腸埃希菌生長(zhǎng)增強(qiáng)，即為產(chǎn)碳青霉烯酶。

1.3.2PCR擴(kuò)增測(cè)定CRE菌種基因型 采用PCR擴(kuò)增測(cè)定CRE菌種中耐藥基因型，并采用煮沸法提取細(xì)菌DNA模板。具體內(nèi)容包括：①PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25 μL，其中包括2 μL模板DNA、2 μL dNTP混合物、2 μL Mg2+plus緩沖液、2 μL引物(引物序列為F：5′-GAGATTGCCGAGCGAC-TTC-3′；R：5′-TACCGCCTGGACCGATGAC-3′)、0.3 μL rTap，使用16.7 μL實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌水調(diào)配至25 μL反應(yīng)體系；②在94 ℃條件下進(jìn)行5 min預(yù)變性反應(yīng)，94 ℃條件下進(jìn)行40 s變性反應(yīng)；在52～58 ℃條件下進(jìn)行40 s退火處理，在72 ℃下進(jìn)行5 min伸延處理，共30個(gè)循環(huán)，再經(jīng)72 ℃終延伸10 min，所測(cè)序列在GenBank中通過(guò)BLAST程序進(jìn)行序列比對(duì)，確定所測(cè)細(xì)菌的基因型；③經(jīng)電泳成像結(jié)果進(jìn)一步確定基因型。

1.4觀察指標(biāo) ①分析ICU患者CRE菌種在不同標(biāo)本中的檢出情況；②分析CRE菌株對(duì)臨床中常用抗生素的敏感性與耐藥性；③觀察不同基因型在CRE菌種中的檢出率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CRE菌種在ICU患者標(biāo)本中的檢出及分布情況 在150例患者中共分離出643株腸桿菌，其中痰液中存在腸桿菌及CRE菌種占比最高，分別為41.06%及44.85%，在分離出的165株CRE菌株中，主要以黏質(zhì)沙雷菌為主，占26.06%，其次為肺炎克雷伯菌(23.64%)及陰溝腸桿菌(20.00%)，見(jiàn)表1～2。

表1 CRE菌株在不同標(biāo)本中分布情況Table 1 Distribution of CRE strains in different specimens

表2 CRE種類分布及構(gòu)成比Table 2 CRE species distribution and composition ratio

2.2主要CRE對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況 CRE菌株對(duì)大部分β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥度較高，而敏感度越高藥效越好，其中敏感程度最高的為替加環(huán)素(100%)，其次為環(huán)丙沙星(80.00%)及阿米卡星(74.55%)，見(jiàn)表3。

表3 主要CRE菌種對(duì)常用抗菌藥物的耐藥情況Table 3 Resistance of main CRE strains to commonly used antibiotics (例數(shù)，%)

2.3CRE菌株的不同基因型 在165株CRE菌株中產(chǎn)DNM-1基因的菌株數(shù)量最多，占58.79%，其次為KPC與VIM，分別為23.03%及18.18%，見(jiàn)表4、圖1、2。

表4 CRE菌株基因型統(tǒng)計(jì)Table 4 Genotype statistics of CRE strains

圖1 NDM-1基因在CRE菌株中測(cè)序圖)

圖2 CRE菌株中不同基因型泳道

3 討 論

腸桿菌在臨床上常引起泌尿道、呼吸道等感染通常使用抗生素進(jìn)行抗菌治療與此同時(shí)，細(xì)菌的耐藥性也不斷增強(qiáng)[6]，嚴(yán)重阻礙臨床治療。研究表明，CRE的耐藥機(jī)制主要有以下幾個(gè)方面，首先是菌體產(chǎn)生抗生素滅活酶，即碳青霉烯酶，這是目前臨床中多數(shù)學(xué)者認(rèn)同的CRE耐藥機(jī)制[7]。碳青霉烯酶作為B類金屬酶的一種，還包括常見(jiàn)的ESBL、AmpC酶等，其形成會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)大多數(shù)抗生素形成耐藥性[8]。其次，由于產(chǎn)ESBL、Ampc酶過(guò)多合并孔道蛋白缺失或機(jī)體外排泵功能失衡，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性降低，也會(huì)增強(qiáng)CRE的耐藥性[9]。另外，有學(xué)者指出，抗生素作用靶點(diǎn)PBPs出現(xiàn)異常，也會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)[10]。本研究結(jié)果顯示，CRE菌種在黏質(zhì)沙雷菌及肺炎克雷伯菌中檢出率最高，分別為26.06%及23.64%，說(shuō)明某院內(nèi)CRE流行的主要致病菌為黏質(zhì)沙雷菌及肺炎克雷伯菌，同時(shí)本研究顯示CRE菌株對(duì)頭孢類藥物及美羅培南存在較高的耐藥性，但對(duì)替加環(huán)素的敏感度較高，與Alizadeh等[11]研究結(jié)果一致。提示當(dāng)臨床中應(yīng)用新型抗菌藥物，細(xì)菌耐藥性也伴隨產(chǎn)生，在抗生素初始應(yīng)用階段，細(xì)菌對(duì)不同抗菌藥物的的耐藥性處于極低水平，且對(duì)常見(jiàn)病原菌的敏感率較高，與臨床中常見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺類藥物一致，CRE類在臨床應(yīng)用后也會(huì)相應(yīng)的出現(xiàn)CRE菌株[12]。由于頭孢類抗生素在臨床上已應(yīng)用多年，因此臨床中大部分致病菌對(duì)其耐藥性偏高，但主要致病菌對(duì)碳青霉烯類的耐藥較低，其耐藥機(jī)制主要有青霉素與蛋白結(jié)合程度降低；Ⅰ型β-內(nèi)酰胺酶水解碳青霉烯類的微弱活性伴隨細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類通透性下降，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)，常見(jiàn)于腸桿菌或綠膿桿菌等菌株；菌株產(chǎn)生含鋅β-內(nèi)酰胺酶水解碳青霉烯類[13-14]。提示在對(duì)ICU患者用藥過(guò)程中，避免長(zhǎng)期使用同一種抗生素，使細(xì)菌耐藥性上升。

此外，本研究還對(duì)CRE菌種中含有的基因型進(jìn)行PCR快速檢測(cè)分析，結(jié)果顯示含NDM-1基因的CRE菌株比例最高，可達(dá)58.79%。由于NDM-1基因位于質(zhì)粒，因此其可在質(zhì)粒的介導(dǎo)下在多種細(xì)菌之間進(jìn)行傳播，引起如腹膜炎、肺部感染等多種感染性疾病[15]。研究表明，含有NDM-1基因的CRE菌株含有更強(qiáng)的耐藥性，其原因之一是由于多數(shù)具有活性的NDM-1主要以單鏈狀態(tài)存在于機(jī)體水液中，但當(dāng)部分NDM-1的疏水性及范德華力產(chǎn)生差異時(shí)，其在液體中的呈現(xiàn)方式從單鏈狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槎垠w狀態(tài)，因此當(dāng)其以二聚體狀態(tài)嵌入細(xì)菌細(xì)胞膜時(shí)，會(huì)使細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)[16]。還有學(xué)者指出NDM-1中的二價(jià)鋅離子能夠與不同His配位呈ZN1及ZN2，并嵌于蛋白表明，與周圍溶劑充分接觸，并表現(xiàn)出更強(qiáng)的底物結(jié)合力，從而提高細(xì)菌的耐藥機(jī)制，但此機(jī)制尚未需進(jìn)一步論證[17]。本研究表明，攜帶DNM-1基因的細(xì)菌在臨床中表現(xiàn)為耐藥性較廣的特點(diǎn)，其作為一種高效酶，能夠水解大部分β-內(nèi)酰胺類藥物，且本研究檢測(cè)出NDM-1基因型的細(xì)菌表現(xiàn)對(duì)多數(shù)頭孢菌素類藥物及美羅培南具有較高耐藥性，而其他細(xì)菌表現(xiàn)出多重耐藥性推測(cè)與DNM-1基因表達(dá)較低有關(guān)[18]。因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)ICU患者用藥管理，盡量選取替加環(huán)素等敏感度較高的抗生素，控制院內(nèi)CRE菌種的傳播。

綜上所述，某院ICU患者所感染的CRE桿菌多為黏質(zhì)沙雷菌，其次為肺炎克雷伯菌及陰溝腸桿菌，經(jīng)過(guò)PCR快速檢測(cè)分析出CRE菌種中主要基因型為NDM-1，但據(jù)研究顯示，改良Hodge試驗(yàn)雖具有較高敏感度，但臨床檢測(cè)中易出現(xiàn)假陽(yáng)性，提示本研究結(jié)果或許存在一定偏差，需進(jìn)一步對(duì)其監(jiān)測(cè)，為臨床用藥提供可靠依據(jù)。