懸浮態(tài)上皮細(xì)胞粘附的力學(xué)?化學(xué)耦合模型及數(shù)值模擬1)

馮世亮 周呂文 呂守芹?, 龍 勉?,

?(寧波大學(xué)機(jī)械工程與力學(xué)學(xué)院,浙江寧波 315211)

?(中國(guó)科學(xué)院力學(xué)研究所生物力學(xué)與生物工程中心、中國(guó)科學(xué)院微重力重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,工程化構(gòu)建與力學(xué)生物學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190)

??(中國(guó)科學(xué)院大學(xué)工程科學(xué)學(xué)院,北京 100049)

引言

上皮細(xì)胞(epithelial cells)彼此借助粘著連接(adherens junctions,AJs)形成連續(xù)上皮組織,由此發(fā)揮屏障、增殖調(diào)控等生理功能[1-2].上皮性鈣粘附蛋白(Ecadherin,E-cad)作為一種跨膜蛋白,是調(diào)控AJs 形成的核心分子機(jī)制[3].一方面,E-cad 胞外結(jié)構(gòu)域在Ca2+參與下,在胞間或同一細(xì)胞表面分別形成反式/順式二聚體(trans-/cis-dimerization)[4],其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域則借助α,β 連環(huán)蛋白(α-,β-catenin)與肌動(dòng)蛋白(F-actin)錨定[5]; 另一方面,胞間E-cad 成鍵引起Rac,Cdc42等Rho 家族小G 蛋白(Rho GTPase)激活[6],進(jìn)而激活下游F-actin 結(jié)合蛋白(例如:Arp2/3,myosin-II,αactinin),調(diào)控肌球蛋白皮層(actomyosin cortex) 動(dòng)態(tài)重組[7-9],由此將更多E-cad 募集至細(xì)胞接觸區(qū)域,促使AJs 成熟[10].

近年來,隨著體外重構(gòu)(in vitroreconstitution)、活細(xì)胞成像等實(shí)驗(yàn)手段的廣泛應(yīng)用,研究者愈漸認(rèn)識(shí)到皮層張力對(duì)于AJs 建成起整合性調(diào)控作用.Murrell等[11]將F-actin 積簇于脂質(zhì)雙層膜表面,再加入αactinin、myosin-II,由此可體外重構(gòu)出actomyosin 皮層結(jié)構(gòu); 該實(shí)驗(yàn)借助改變F-actin 結(jié)合蛋白的密度控制皮層流變屬性,通過檢測(cè)F-actin 持續(xù)長(zhǎng)度論證了Factin 屈曲及皮層松散結(jié)構(gòu)可有效增強(qiáng)收縮應(yīng)變.Wu等[12]對(duì)AJs 上粘著小帶(zonula adherens,ZA)及側(cè)邊區(qū)域(lateral junctions) 進(jìn)行激光燒灼,觀測(cè)到前者回縮速率明顯高于后者,說明ZA 區(qū)域維持著較高張力.Leerberg 等[9]將myosin 常規(guī)輕鏈基因(MRLCDD)轉(zhuǎn)入Caco-2 細(xì)胞,使之表達(dá)myosin-II 磷酸化突變體以提升皮層張力,最終通過靶向?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了以α-catenin 受力打開VH2 結(jié)構(gòu)域、從而募集vinculin 為主體的張力敏感型F-actin 聚合機(jī)制.Engl 等[13]將懸浮態(tài)S-180 細(xì)胞置入非粘附微井(microwell)之中,采取3D 成像觀測(cè)細(xì)胞接觸區(qū)域E-cad 募集,同時(shí)以Factin 解聚/穩(wěn)定試劑(Latrunculin/Jasplakinolide) 處理細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照組實(shí)驗(yàn); 觀測(cè)到兩類經(jīng)處理細(xì)胞均呈現(xiàn)低張力狀態(tài),Jasplakinolide 對(duì)照組依然發(fā)生E-cad局部募集,說明張力通過降低F-actin 解聚速率調(diào)控E-cad.

綜合上述實(shí)驗(yàn),E-cad 胞間成鍵使細(xì)胞皮層局部張力增強(qiáng),進(jìn)而降低F-actin 解聚速率(亦或提高局部F-actin 聚合速率).考慮到F-actin 局部積聚能錨定更多E-cad,那么由“E-cad →張力→F-actin” 力學(xué)反饋回路所展現(xiàn)出的時(shí)空效應(yīng)是否驅(qū)動(dòng)了E-cad 局部積聚,進(jìn)而調(diào)控AJs 形成動(dòng)力學(xué)? 為此,本文構(gòu)建了懸浮態(tài)上皮細(xì)胞粘附的力學(xué)?化學(xué)耦合模型,并采用格子Boltzmann?粒子(LBP)法開展數(shù)值模擬.模擬獲得了懸浮態(tài)細(xì)胞相互擠壓時(shí)的E-cad,F-actin 等分子時(shí)空調(diào)控特征并與Chu 等[14]實(shí)驗(yàn)對(duì)比,繼而探討了細(xì)胞局部力學(xué)屬性、細(xì)胞間擠壓程度對(duì)于AJs 的調(diào)控作用.

1 模型和方法

整體計(jì)算模型如圖1(a) 所示.考慮細(xì)胞為環(huán)狀結(jié)構(gòu),圓環(huán)代表細(xì)胞膜(指質(zhì)膜及皮層緊密貼合體),內(nèi)部為胞質(zhì)區(qū)域,忽略細(xì)胞核等胞內(nèi)細(xì)胞器;將細(xì)胞膜劃分為非接觸及接觸區(qū)域,前者直接設(shè)定為由黏壺與彈簧并聯(lián)的黏彈性單元,后者需額外考察細(xì)胞間相互作用.為考察分子沿可變形的細(xì)胞膜輸運(yùn)引入了自適應(yīng)性D1Q3 單元,其長(zhǎng)度與力學(xué)單元?jiǎng)討B(tài)匹配;胞質(zhì)內(nèi)分子濃度均一,可由質(zhì)量守恒定律直接獲得.圖1(b)展示皮層張力調(diào)控F-actin 解聚,而F-actin通過錨定E-cad 參與級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo),由此循環(huán)往復(fù)構(gòu)成了力學(xué)反饋回路.圖1(c)展示采用馬達(dá)?離合器(motorclutch)機(jī)制[15]考察細(xì)胞在相互接觸區(qū)的力學(xué)作用.整體數(shù)學(xué)模型由3 個(gè)模塊構(gòu)成:細(xì)胞力學(xué)模塊、Ecad/E-cad?調(diào)控模塊(* 號(hào)表明已與F-actin 錨定) 及F-actin 聚合/解聚模塊.各模塊的基本假設(shè)及控制方程如下.

圖1 (a)細(xì)胞離散模型.黏彈性單元與D1Q3 單元(1 維LBM 單元,包含3 個(gè)速度分量)動(dòng)態(tài)匹配.(b)力學(xué)反饋回路示意圖.(c)馬達(dá)?離合器機(jī)制[15]Fig.1 (a)Discrete cell model.Each visco-elastic element is co-localized with a D1Q3 element(a)1D LBM element with 3 discrete velocity components).(b)Schematic of mechanical feedback loop.(c)Motor-clutch mechanism [15]

1.1 細(xì)胞力學(xué)模塊

考察懸浮態(tài)上皮細(xì)胞具有均勻的力學(xué)屬性,離散細(xì)胞模型上任意單元節(jié)點(diǎn)i的受力滿足以下平衡微分方程

上式中,第一項(xiàng)是保守力,由能量函數(shù)(Ev)對(duì)位置坐標(biāo)(X)求偏導(dǎo)獲得

式(2a)計(jì)算拉伸勢(shì)能(El),li是i單元實(shí)際長(zhǎng)度,l0是平衡長(zhǎng)度,K1是彈簧剛度系數(shù);式(2b)計(jì)算彎曲勢(shì)能(Eb),θi是第i個(gè)彈簧角度,θ0是平衡角度,Kb是彈簧彎曲剛度;式(2c)計(jì)算面積約束勢(shì)能(Es),s和se分別是細(xì)胞當(dāng)前面積及平衡面積,Ks是罰系數(shù)(penalty coefficient),取Ks?max(K1,Kb),將細(xì)胞面積變化控制在1%.第二項(xiàng)考察單元節(jié)點(diǎn)i和j受到與節(jié)點(diǎn)相對(duì)速度相反的黏性力,Fvis,i=?γ(vi?vj),γ 是黏性系數(shù).第三項(xiàng)是細(xì)胞接觸區(qū)摩擦阻力,Fdrag,i=?μvi,μ為動(dòng)摩擦系數(shù),第四項(xiàng)即為外力項(xiàng).

1.2 E-cad/E-cad?調(diào)控模塊

E-cad (Em) 沿細(xì)胞膜擴(kuò)散并借助F-actin 錨定為E-cad?(EI),E-cad?又可局部形成順式二聚體.該過程可通過非線性反應(yīng)?擴(kuò)散方程組描述為

式(3a)中,右側(cè)第一項(xiàng)是擴(kuò)散項(xiàng),DI是E-cad?在細(xì)胞膜上擴(kuò)散系數(shù);第二項(xiàng)體現(xiàn)F-actin 介導(dǎo)E-cad、E-cad?相互轉(zhuǎn)化源項(xiàng),w是F-actin 密度,α 及β 分別為E-cad與F-actin 結(jié)合及E-cad?還原成E-cad 速率; 第三項(xiàng)體現(xiàn)E-cad?通過形成順式二聚體對(duì)自身密度反饋,?是反饋速率,KE是飽和系數(shù).式(3b)中,Dm是E-cad擴(kuò)散系數(shù)(Dm>DI),后兩項(xiàng)與式(3a)符號(hào)相反是基于E-cad?與E-cad 總質(zhì)量守恒.E-cad?在胞間成鍵可采用受體-配體結(jié)合方程予以描述.

式中,R和L分別代表受體、配體,RL為受配體復(fù)合物.

依據(jù)馬達(dá)?離合器機(jī)制[15],單個(gè)馬達(dá)分子與Factin 結(jié)合可施加的力為Fm,驅(qū)動(dòng)F-actin 以速率vm回縮,同時(shí)引起E-cad?成鍵受拉.t0時(shí)刻,假設(shè)節(jié)點(diǎn)j上有nc,j個(gè)E-cad?成鍵、nm,j個(gè)與F-actin 結(jié)合的myosin-II,該節(jié)點(diǎn)所受力FC,j滿足

式中,Fc,i是第i個(gè)鍵上的拉伸力,等于該鍵凈拉伸量(xi)與鍵剛度(Kc)乘積;FC,j與此處皮層張力平衡,可由節(jié)點(diǎn)位移xs,j、皮層剛度K1計(jì)算.t0+1 時(shí)刻,根據(jù)Bell 模型更新第i個(gè)鍵的解離系數(shù)

式中,Fb是特征斷裂力,是0 載荷時(shí)的解離系數(shù).隨后依據(jù)力?速度(force-velocity)關(guān)系[15]更新回縮速率

1.3 F-actin 聚合/解聚模塊

單根F-actin 在刺端(pointed end)解聚為單體Gactin,用以供給鉤端(barbed end) 聚合,從而以“踏車”(treadmilling)的方式更新[16-17].細(xì)胞接觸區(qū)域Rac信號(hào)增強(qiáng),通過激活A(yù)rp2/3 產(chǎn)生新的鉤端,使得接觸區(qū)F-actin 聚合速率加快,由此將單根F-actin 的“踏車” 行為擴(kuò)展至全局.簡(jiǎn)便起見,將活性態(tài)Rac 信號(hào)(?R)考慮為以接觸中心(Ct)起始,呈指數(shù)衰減函數(shù),即

式中,Rh,Rr分別為細(xì)胞前端、后部Rac 活性系數(shù),xi為i節(jié)點(diǎn)到細(xì)胞前部水平距離.

F-actin(w)、鉤端(B)密度隨時(shí)空調(diào)控可描述為

式(9a)中,右側(cè)第一項(xiàng)表征F-actin 在細(xì)胞膜上緩慢擴(kuò)散,第二項(xiàng)為F-actin 聚合反應(yīng)項(xiàng),v是單個(gè)鉤端聚合G-actin (密度為g) 速率; 第三項(xiàng)是受張力調(diào)控Factin 解聚,取dF=dmax?dτ,dmax為最大解聚速率.Fτ≈0 時(shí),dF≈dmax;Fτ?Fhalf時(shí),dF≈dmax?dτ.式(9b)中,am是細(xì)胞膜上Arp2/3 密度,即表征由Rac 調(diào)控鉤端生成.am與胞質(zhì)游離態(tài)Arp2/3 (ac) 相互轉(zhuǎn)化過程由式(4) 描述,即:am,B,ac分別對(duì)應(yīng)于RL,R,L.后兩項(xiàng)中,kb,c分別是鉤端生成及移除的基準(zhǔn)速率.

2 數(shù)值方法

整體數(shù)學(xué)模型由平衡微分方程及反應(yīng)?擴(kuò)散方程組構(gòu)成,屬于力學(xué)?化學(xué)耦合問題,可采取LBP 法求解[18].LBP 是將LBM 與粒子(particle)法耦合,其中LBM 程序計(jì)算的基本內(nèi)容是令“遷移”和“碰撞”兩個(gè)步驟交替循環(huán)進(jìn)行.

(1)碰撞

(2)遷移

式(10)中,fv,α(x,t)是定義在離散速度方向集{eα}上的瞬時(shí)粒子分布函數(shù);D1Q3 單元的eα取為

? 是碰撞算符,由反應(yīng)項(xiàng)(?R) 及非反應(yīng)項(xiàng)(?NR) 構(gòu)成,即:?=?R+?NR.?NR采用單松弛模型

(x,t)是平衡函數(shù)

式中,ρv是宏觀密度,wα是粒子速度權(quán)系數(shù).

LBM 具有格式簡(jiǎn)單、便于并行計(jì)算、處理幾何邊界靈活等優(yōu)點(diǎn),適合求解固定邊界下的反應(yīng)?擴(kuò)散方程組[19-20],前期工作是在計(jì)算反應(yīng)源項(xiàng)時(shí)調(diào)用Monte-Carlo (MC) 法,從而保留系統(tǒng)噪音[21].LBPD1Q3 將D1Q3 單元與力學(xué)單元?jiǎng)討B(tài)匹配,即由歐拉法獲取粒子位移以更新單元長(zhǎng)度,之后對(duì)fv,α({xi+eα?t},t+?t) 在網(wǎng)格節(jié)點(diǎn){xi} 上進(jìn)行3 次樣條插值,由此獲得fv,α({xi},t+?t).為保證插值前、后總量守恒,設(shè)定分布函數(shù)為

3 結(jié)果

3.1 AJs 形成動(dòng)力學(xué)

考察兩懸浮態(tài)細(xì)胞接觸后E-cad?,F-actin 在接觸區(qū)域募集的時(shí)空動(dòng)力學(xué),以此表征AJs 形成.此前Bangasser 等針對(duì)馬達(dá)?離合器機(jī)制開展參數(shù)分析[22],本文據(jù)此將“馬達(dá)” 參數(shù)設(shè)定為:Fm=2 pN,vm=120 nm/s,“離合器” 參數(shù)為:k?=0.1 s?1,k+=0.3 s?1.鉤端、E-cad?及Arp2/3 初始值設(shè)定為:B=50 μm?1[17],EI=32 μm?1[17],[Arp2/3]=0.05μM[23].細(xì)胞力學(xué)及F-actin 聚合/解聚模塊參數(shù)見表1.

表1 模型參數(shù)Table 1 Model parameters

圖2(a) 是t=20 (上)、50 s (下) 時(shí)細(xì)胞形態(tài)及E-cad?分布圖.兩細(xì)胞在t=0 s 接觸,此時(shí)E-cad?均勻分布; 至t=20 s,兩細(xì)胞因受到外力(Fext,i) 發(fā)生顯著擠壓,接觸區(qū)域Rac 梯度信號(hào)令A(yù)rp2/3 局部激活進(jìn)而產(chǎn)生少量鉤端,F-actin 聚合速率提升即將少量E-cad?錨定于此; 至t=50 s,細(xì)胞已到達(dá)平衡位置,觀察到E-cad?積聚在接觸區(qū)域,而Ct 點(diǎn)E-cad?密度由初始約0.3μM 提升至約0.8μM.由于擴(kuò)散速率低(DI=0.1μm2/s),E-cad?在接觸/非接觸交界區(qū)呈現(xiàn)陡峭梯度.

圖2(b) 是E-cad?時(shí)空調(diào)控圖,[?π/3,π/3] 是平衡時(shí)細(xì)胞接觸區(qū)域.觀察到50 s 后E-cad?依然持續(xù)募集至該區(qū)域,直至約6 min 達(dá)到穩(wěn)態(tài).E-cad?募集與兩細(xì)胞接觸后產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)張力信號(hào)密切相關(guān),即由myosin-II 持續(xù)地驅(qū)動(dòng)F-actin 負(fù)向尾流(retrograde flow)引起胞間E-cad?成鍵受拉、傳導(dǎo)皮層張力.張力隨著E-cad?成鍵數(shù)增多而增強(qiáng),繼續(xù)通過減慢Factin 解聚錨定E-cad?,直至E-cad?與E-cad 相互轉(zhuǎn)化速率動(dòng)態(tài)平衡.

圖2 (a)t=20、50 s 時(shí)細(xì)胞形變及E-cad*分布.Fext,i 是沿水平方向施加的節(jié)點(diǎn)外力.(b)E-cad*時(shí)空調(diào)控圖.縱坐標(biāo)0 點(diǎn)是細(xì)胞相互接觸中心位置Fig.2 (a)Snapshots of cell shape and the distribution patterns of E-cad*at t=20 and 50 s. Fext,iis the external nodal force exerted alone horizontal direction.(b)Spatiotemporal regulation of E-cad*.Point 0 indicates the position of contact center

圖3(a) 是Ct點(diǎn)處F-actin 密度時(shí)程曲線圖.觀察到正常情況下(ctrl 組),活性態(tài)Rac 梯度促進(jìn)Factin 聚合同時(shí)張力抑制F-actin 解聚,由此產(chǎn)生互補(bǔ)效果即將F-actin 密度提高至約16 μM,接近初始時(shí)2 倍.在force?對(duì)照組中,令dτ=0 s?1以消除張力對(duì)F-actin 調(diào)控,觀察到由Rac 梯度單獨(dú)作用僅使得F-actin 積聚密度為約12μM;在cis?對(duì)照組中,令?=0 s?1以取消E-cad?的成束效應(yīng),此時(shí)F-actin 借助少量E-cad?介導(dǎo)的張力信號(hào)將自身穩(wěn)態(tài)密度恢復(fù)到約14μM.

圖3(b)是相應(yīng)的E-cad?密度時(shí)程曲線圖.觀察到,ctrl 組中E-cad?在F-actin 錨定及自身成束的雙重反饋下產(chǎn)生積聚,其密度增長(zhǎng)曲線呈現(xiàn)起始(0～30 s)、快速增長(zhǎng)(0.5～5 min)及緩慢增長(zhǎng)(5～8 min)三階段.

圖3 Ct 點(diǎn)處F-actin(a)和E-cad*(b)時(shí)程曲線圖Fig.3 Temporal evolutions of F-actin(a)and E-cad*(b)at Ct point

3.2 細(xì)胞皮層力學(xué)屬性調(diào)控粘著連接形成

此前,盡管Murrell 等[11]觀測(cè)到皮層呈現(xiàn)松散的非肌節(jié)元(nonsarcomeric) 結(jié)構(gòu)可大幅提高馬達(dá)分子收縮應(yīng)變,但并未闡述皮層力學(xué)屬性將如何調(diào)控AJs 建成.本節(jié)即著眼于力學(xué)反饋回路啟動(dòng)機(jī)制,繼續(xù)探究這一問題.

首先取消Rac 梯度(即設(shè)定Rh=Rr=0.1),考察單獨(dú)由張力各向異性是否可引起E-cad?局部積聚.圖4(a)是取K1=1,10 pN/nm 時(shí)獲得的Ct點(diǎn)處Fτ時(shí)程曲線圖.K1=10 pN/nm 時(shí)表征皮層呈緊密結(jié)構(gòu),觀察到起始階段(0～100 s),皮層張力(Fτ)峰值始終較低(約75 pN).這是由于K1過大導(dǎo)致E-cad?鍵力(Fc,i)快速增長(zhǎng),鍵的最概然壽命僅為約1 s(圖4(b)),同時(shí)由于鍵的反復(fù)形成與斷裂造成Fτ波動(dòng).Kc=1 pN/nm時(shí)可指皮層呈松散結(jié)構(gòu).較小的K1使Fc,i增長(zhǎng)較慢,鍵的最概然壽命延長(zhǎng)為約3 s(圖4(b)),觀察到Fτ峰值為約100 pN.由馬達(dá)分子持續(xù)收縮引起E-cad?成鍵受拉使得Fc,i逐漸增大,直至斷裂后由其它鍵分擔(dān),造成鍵的連鎖斷裂,觀察到Fτ呈現(xiàn)出周期性“加載?失效”(load-and-fail)現(xiàn)象[15].隨著模擬持續(xù),400～500 s 階段“K1=10 pN/nm”與初期相比未發(fā)生顯著變化,“K1=1 pN/nm”則呈現(xiàn)階梯式上升,Fτ峰值約為150 pN.由此可見,皮層為松散結(jié)構(gòu)更加有利于提升皮層張力,并由此啟動(dòng)力學(xué)反饋回路驅(qū)動(dòng)Ecad?積聚,最終形成AJs.在force?組中,F-actin 密度最低,因此對(duì)E-cad?錨定量最少,E-cad?依靠成束將F-actin 賦予的初始極性放大,最終達(dá)到約0.6 μM; 在cis?組中,E-cad?僅依賴與F-actin 錨定產(chǎn)生積聚,穩(wěn)態(tài)時(shí)僅為約0.3μM.

綜上所述并參考迄今少有爭(zhēng)議的真核細(xì)胞極化理論[27-30],針對(duì)懸浮態(tài)細(xì)胞粘附的動(dòng)力學(xué)過程亦可分為“方向感知”與“極化”.細(xì)胞接觸初期,接觸區(qū)域Rac 活性及皮層張力的提升為E-cad?募集指明方向.兩類信號(hào)的起效方式不同:Rac 信號(hào)受制于Arp2/3 總量,它從起效到飽和的周期短,而張力信號(hào)受制于Ecad?密度,初始較弱但借助力學(xué)反饋回路持續(xù)增強(qiáng).E-cad?初始極性分布改變了順式二聚體成束的局部速率,后者即為“極化”機(jī)制,可引起E-cad 向E-cad?加速轉(zhuǎn)化,直至E-cad 大量消耗而達(dá)到穩(wěn)態(tài).為定量化兩類信號(hào)對(duì)AJs 的調(diào)控作用,后續(xù)將改變模型初始條件(Rac 活性或皮層張力)考察最終E-cad?信號(hào)輸出.

圖4 (a)Kl 取1,10 pN/nm 時(shí)的Ct 點(diǎn)張力時(shí)程曲線圖.(b)E-cad*成鍵最概然壽命直方圖.(c)單獨(dú)張力調(diào)控下E-cad*時(shí)空調(diào)控圖Fig.4 (a)Time courses of the tension at Point Ct at Kl=1 and 10 pN/nm.(b)Distribution patterns of the lifetimes of E-cad?bonds.(c)Spatiotemporal regulation of E-cad?in the presence of the tension alone

圖4 (a)Kl 取1,10 pN/nm 時(shí)的Ct 點(diǎn)張力時(shí)程曲線圖.(b)E-cad*成鍵最概然壽命直方圖.(c)單獨(dú)張力調(diào)控下E-cad*時(shí)空調(diào)控圖(續(xù))Fig.4 (a)Time courses of the tension at Point Ct at Kl=1 and 10 pN/nm.(b)Distribution patterns of the lifetimes of E-cad?bonds.(c)Spatiotemporal regulation of E-cad?in the presence of the tension alone(continued)

圖4(c) 是K1=1 pN/nm 時(shí)E-cad?時(shí)空調(diào)控圖.與圖2(b)對(duì)比,由于缺少活性態(tài)Rac 梯度,E-cad?的初始積聚位置并不位于接觸中心.這是由于該階段張力各向異性程度較低,不具有明確的E-cad?積聚信號(hào),E-cad?通過自身成束效應(yīng)制造了隨機(jī)高點(diǎn).隨著模擬時(shí)間推進(jìn),力學(xué)反饋回路逐漸開啟,E-cad?積聚方位逐漸向接觸中心偏移(圖中白色線).

3.3 細(xì)胞接觸長(zhǎng)度調(diào)控AJs 形成

實(shí)驗(yàn)中通過調(diào)節(jié)雙微吸管間距來控制細(xì)胞擠壓程度[14],模擬時(shí)施加不同擠壓力(Fext,i)即可達(dá)到相同效果.圖5(a)即考察缺少Rac 梯度時(shí),細(xì)接觸區(qū)弧度由2π/9 擴(kuò)大至8π/9 時(shí)獲得的穩(wěn)態(tài)E-cad?分布.隨著接觸區(qū)擴(kuò)大,細(xì)胞后部的E-cad?密度降低.弧度為2π/5 時(shí),E-cad?峰值最高(達(dá)到約0.90μM),說明中等長(zhǎng)度的接觸區(qū)促進(jìn)AJs 成熟.接觸區(qū)過小時(shí)輸入的張力信號(hào)較弱,從而限制整體力學(xué)反饋回路強(qiáng)度;接觸區(qū)過大時(shí)高密度E-cad?分配范圍過大導(dǎo)致峰值降低,同樣會(huì)限制AJs 成熟.圖5(b) 是加入Rac 梯度信號(hào)(Rh=0.3)后的E-cad?分布.與圖5(a)對(duì)比,細(xì)胞前、后部密度與接觸區(qū)弧度關(guān)系依然存在,但分布更為陡峭.圖5(b)插入圖是令接觸區(qū)在[0,2.7]弧度變化時(shí)獲得的Ct點(diǎn)處E-cad*峰值濃度曲線圖.觀察到該曲線呈現(xiàn)雙相性,E-cad*最高峰值濃度發(fā)生在1.2 接觸弧度附近.

圖5 Rh=0.1(a)或0.3(b)時(shí)不同接觸長(zhǎng)度下的E-cad*穩(wěn)態(tài)分布圖.(b)中的插圖顯示E-cad*峰值濃度隨接觸區(qū)長(zhǎng)度呈雙相性變化Fig.5 Profiles of E-cad*at Rh=0.1(a)and 0.3(b)upon different extrusion deformations.Inserted panel in(b)shows the dependence of maximum E-cad*concentration with the contact length

圖6 是將Rh和K1進(jìn)行參數(shù)組合獲得的E-cad?穩(wěn)態(tài)分布.取K1=1,5,10 pN/nm,同時(shí)取Rh=0.1,0.3,0.5,由此獲得9 組(K1,Rh).由于Fext,i為常量,細(xì)胞擠壓程度由K1控制,K1越大則擠壓程度越低.觀察到(1,0.5)組合下E-cad?呈現(xiàn)顯著積聚,這是由于Rac 梯度信號(hào)最強(qiáng),而K1低可引起接觸區(qū)擴(kuò)大、Ecad?成鍵壽命延長(zhǎng);相反取(10,0.1)時(shí),力學(xué)、化學(xué)信號(hào)均最弱,使得E-cad?積聚程度最低.取(1,0.1)、(10,0.5) 時(shí),E-cad?積聚程度接近,說明當(dāng)張力信號(hào)較弱時(shí)可由增強(qiáng)局部Rac 信號(hào)予以補(bǔ)償,反之亦然.

圖6 Kl 與Rh 進(jìn)行參數(shù)組合所獲得的E-cad*穩(wěn)態(tài)分布圖Fig.6 Stable distribution patterns of E-cad*derived from different combinations of Kland Rh

4 討論

生物化學(xué)學(xué)者開展懸浮態(tài)細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)往往配合分子抑制/過表達(dá)對(duì)照組實(shí)驗(yàn).分子間級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)如何調(diào)控分子在細(xì)胞局部積聚動(dòng)力學(xué)?對(duì)于這一細(xì)胞?分子“跨尺度”問題需要借助構(gòu)建力學(xué)?化學(xué)耦合模型予以回答.此前Chu 等[14]采用轉(zhuǎn)染E-cad 的懸浮態(tài)S180 細(xì)胞開展粘附實(shí)驗(yàn),通過控制兩細(xì)胞接觸時(shí)間并測(cè)算分離力(與E-cad?積聚程度正相關(guān))將AJs的建立過程劃分為:起始、快速增長(zhǎng)及緩慢增長(zhǎng)階段.本文數(shù)值模擬獲得E-cad?調(diào)控空間分布特征及演化趨勢(shì)與該實(shí)驗(yàn)一致,但達(dá)到穩(wěn)態(tài)所需時(shí)間較Chu 實(shí)驗(yàn)快(約5 min vs.約30 min),原因之一是忽略了G-actin自身調(diào)控,即G-actin 主要以ADP 結(jié)合態(tài)存在,需要與捕獲蛋白ADF/cofilin,profilin,Thymosin 發(fā)生交換成為ATP 結(jié)合態(tài)方能供給鉤端聚合[17].Chu 等[14]所開展的對(duì)照組實(shí)驗(yàn)包括有:(1)采用Latrunculin 抑制F-actin 聚合后,觀測(cè)到AJs 無法形成;(2)表達(dá)Rac 顯性失活突變體后,AJs 成熟度降低了35%.參照本文圖6 可對(duì)上述觀測(cè)結(jié)果作如下解讀:盡管F-actin,Rac都參與E-cad 力學(xué)反饋回路,但Rac 位于F-actin 上游,其促進(jìn)F-actin 聚合的作用可由張力降低F-actin 解聚予以補(bǔ)償,因而Rac 失活只會(huì)削弱但并不阻止AJs建成.

本文為構(gòu)建整體數(shù)學(xué)模型采取了必要的假設(shè)及簡(jiǎn)化,今后可繼續(xù)開展以下工作.

首先,模型假設(shè)Rac 活性系數(shù)由細(xì)胞接觸區(qū)以指數(shù)形式衰減,未引入Rac 自身調(diào)控機(jī)制.此前Mori 等針對(duì)Rac (或Cdc42) 調(diào)控提出了波樁(wave-pinning)模型[31],即考察Rac 失活/活性態(tài)轉(zhuǎn)化,活性態(tài)Rac擴(kuò)散較慢并正向調(diào)控自身生成,由此造成了其在一側(cè)激活即以波的形式向?qū)?cè)傳播,最終受到失活/活性態(tài)總體質(zhì)量守恒限制達(dá)到穩(wěn)定的極性分布.已證實(shí)E-cad 與整合素(integrin)通過Rho GTPase 發(fā)生交互式調(diào)控[32-33],繼續(xù)引入Rho GTPase 調(diào)控模塊可將懸浮態(tài)細(xì)胞粘附模型拓展至貼壁細(xì)胞[34].

其次,模型對(duì)E-cad,F-actin 力學(xué)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)是采取“最弱結(jié)合點(diǎn)”假設(shè)[15],將胞間E-cad?成鍵作為一系列“串聯(lián)彈簧”的失效點(diǎn),將其考慮為滑移鍵(slip bond).此前原子力顯微鏡、光鑷等單分子實(shí)驗(yàn)證實(shí)了cadherin-catenin 復(fù)合體與F-actin 或是胞間E-cad?成鍵均存在逆鎖鍵(catch bond)[35-36].基于本文力學(xué)?化學(xué)耦合體系,后續(xù)可從力學(xué)反饋回路的啟動(dòng)機(jī)制出發(fā),探討逆鎖鍵對(duì)AJs 的調(diào)控作用.

最后,本文通過LBP 法求解包含級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞力學(xué)問題,未考察細(xì)胞與環(huán)境流體間相互作用.此前Dallon 等[25]基于浸入式邊界法(immersed boundary method,IBM) 構(gòu)建了懸浮態(tài)細(xì)胞粘附的流體?固體耦合模型; Tanaka 等[37]將IBM 與LBM 結(jié)合并應(yīng)用于組織形態(tài)發(fā)生(morphogen)領(lǐng)域.受此啟發(fā),今后可發(fā)展IB-LBP 法.

5 結(jié)論

本文考察胞間E-cad?成鍵介導(dǎo)actomyosin 皮層上的Rac 活性及張力信號(hào)反作用于E-cad 級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo),由此構(gòu)建了懸浮態(tài)上皮細(xì)胞粘附的力學(xué)?化學(xué)耦合模型,并通過自行發(fā)展的LBP-D1Q3 法予以數(shù)值求解.正常組數(shù)值模擬首先重現(xiàn)了細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)中觀測(cè)到E-cad?和F-actin 在細(xì)胞接觸區(qū)持續(xù)募集的現(xiàn)象,繼而結(jié)合對(duì)照組獲得了以下3 方面主要結(jié)論.

(1)局部活性態(tài)Rac、張力信號(hào)分別調(diào)控F-actin聚合、解聚,由此發(fā)揮互補(bǔ)效應(yīng)造成F-actin 在細(xì)胞接觸區(qū)域富集,通過錨定作用幫助E-cad?建立初始極性; E-cad?通過形成順式二聚體將初始極性放大,由此E-cad?時(shí)程曲線呈現(xiàn)起始、快速增長(zhǎng)及緩慢增長(zhǎng)階段.

(2) 單獨(dú)張力各向異性經(jīng) “E-cad →張力→Factin” 力學(xué)反饋回路放大即可造成E-cad?積聚; 在馬達(dá)分子拉動(dòng)下,E-cad?成鍵壽命與皮層剛度相關(guān),而松散的皮層結(jié)構(gòu)具有較小剛度,E-cad?成鍵壽命延長(zhǎng)、張力提升,有利于力學(xué)反饋回路的啟動(dòng).

(3)細(xì)胞接觸區(qū)長(zhǎng)度適中時(shí),整體張力輸入信號(hào)經(jīng)力學(xué)反饋回路放大使得E-cad?局部積聚最為顯著,因此接觸區(qū)長(zhǎng)度可作為控制粘著連接成熟度的有效手段.