阿膠強(qiáng)骨口服液連續(xù)逆流提取工藝研究

古孜麗阿依·庫(kù)爾班，黃 卉，陳 偉，朱倩蘭，武嘉林,*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830011； 2.新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司，新疆 烏魯木齊830011； 3.新疆華世丹藥物研究有限責(zé)任公司，新疆 烏魯木齊830011)

阿膠強(qiáng)骨口服液是新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的復(fù)方制劑，由熟地黃、黃芪、黨參、枸杞、阿膠、牡蠣等6味藥材組成。目前，阿膠強(qiáng)骨口服液采用傳統(tǒng)的加熱回流提取技術(shù)，存在提取時(shí)間長(zhǎng)、能耗大、溶劑用量大和回收率低等缺點(diǎn)。連續(xù)逆流提取技術(shù)是使溶劑和藥材反方向流動(dòng)，兩者逆流接觸，濃度梯度可以始終保持在較高水平，確保連續(xù)而充分的接觸提取，具有浸出速度快、提取效率高、能耗小等特點(diǎn)[1-4]。作者采用連續(xù)逆流提取技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的加熱回流提取工藝，以毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、總多糖含量和提取率為考察指標(biāo)，采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化阿膠強(qiáng)骨口服液連續(xù)逆流提取工藝。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

黃芪(批號(hào)190802，哈巴河)、黨參(批號(hào)190808，甘肅)、枸杞子(批號(hào)190801，精河)、熟地黃(批號(hào)190401，河南)、阿膠(批號(hào)19030112，山東)、牡蠣(批號(hào)1908001，東北)，百草堂公司；阿膠強(qiáng)骨口服液(批號(hào)18101402、18100501)，新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司；黃芪甲苷(110781-201717)、毛蕊花糖苷(111530-2017-13)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(111920-201606)、D-無水葡萄糖(110833-201707)，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

三氯甲烷，分析純，天津北聯(lián)精細(xì)化學(xué)開發(fā)有限公司；正丁醇、硫酸，分析純，成都科隆化學(xué)品有限公司；氨水，分析純，四川西隴科技有限公司；甲醇、乙腈，色譜級(jí)，賽默飛世爾科技有限公司；甲酸，分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠；冰乙酸，分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司；苯酚、無水乙醇，分析純，天津百世化工有限公司。

LC-20AD型高效液相色譜儀、UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津；蒸發(fā)光散射器，天津埃文森；CPA225D型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Smart-S15UV型超純水器，上海和泰儀器有限公司；SK3300LHC型超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；連續(xù)逆流提取小機(jī)，江蘇沙家浜醫(yī)藥化工裝備股份有限公司；XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；GENIUS 4K型臺(tái)式低速離心機(jī)，長(zhǎng)沙鑫奧儀器儀表有限公司。

1.2 毛蕊花糖苷含量測(cè)定[5-6]

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取適量毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇溶解，搖勻，制成0.268 mg·mL-1的毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，冷藏，備用。

1.2.2 供試溶液的制備

精密量取10 mL阿膠強(qiáng)骨口服液置于具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇，超聲10 min后，冷卻，過濾；濾液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試溶液。

1.2.3 色譜條件

Welch Ultimate XB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%醋酸溶液(16∶84，體積比，下同)，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm。

1.3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定[7]

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取適量毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇溶解，搖勻，制成0.251 5 mg·mL-1的毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，冷藏，備用。

1.3.2 供試溶液的制備

精密量取5 mL阿膠強(qiáng)骨口服液置于25 mL容量瓶中，加入甲醇，定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試溶液。

1.3.3 色譜條件

Welch Ultimate XB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.2%甲酸溶液(B)，流速1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。梯度洗脫條件見表1。

表1梯度洗脫條件

Tab.1 Gradient elution conditions

1.4 黃芪甲苷含量測(cè)定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，充分混勻，制成0.5 mg·mL-1的黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.2 供試溶液的制備

精密吸取阿膠強(qiáng)骨口服液10 mL置于分液漏斗中，分別用40 mL、30 mL三氯甲烷萃取2次，棄去下層；分別用40 mL、40 mL、30 mL、20 mL水飽和的正丁醇萃取4次，收集合并正丁醇液(上層)；再分別用50 mL、40 mL氨試液洗滌2次，棄去氨水層(下層)；正丁醇液減壓回流，濃縮至干，冷卻，殘?jiān)蛹状既芙猓ㄈ葜? mL容量瓶中，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試溶液。

1.4.3 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，蒸發(fā)光散射器檢測(cè)，流動(dòng)相為乙腈-水(38∶62)，漂移管溫度105 ℃，流速3.0 L·min-1，撞擊器關(guān)閉，理論塔板數(shù)按黃芪甲苷計(jì)算不低于4 000，進(jìn)樣量10 μL。

1.5 總多糖含量測(cè)定[8-12]

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取10 mg D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品置于100 mL容量瓶中，加水溶解，并定容至刻度，搖勻，即得0.1 mg·mL-1的D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，冷藏，備用。

1.5.2 供試溶液的制備

精密吸取阿膠強(qiáng)骨口服液1 mL置于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取0.5 mL，加無水乙醇9.5 mL，4 000 r·min-1離心15 min，傾去上清液，加純化水溶解沉淀，并定容至25 mL容量瓶中，即得供試溶液。

1.5.3 5%苯酚溶液的配制

精密稱取苯酚固體5.0 g，加水溶解，定容至100 mL棕色容量瓶中，搖勻，即得5%苯酚溶液。

1.5.4 測(cè)定方法

精密吸取供試溶液2.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻；迅速加入硫酸5.0 mL，搖勻，靜置10 min；40 ℃水浴鍋中保溫15 min，取出，迅速置于冷水中冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度。

1.6 連續(xù)逆流提取工藝正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化[13-15]

在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)以及原工藝的基礎(chǔ)上，以料液比(g∶mL，下同)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間及提取溫度為考察因素，以毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、總多糖含量和提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，設(shè)定其加權(quán)平均數(shù)均0.2，采用綜合加權(quán)評(píng)分法，優(yōu)化阿膠強(qiáng)骨口服液連續(xù)逆流提取工藝。正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表2。

表 2正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiments

2 結(jié)果與討論

2.1 毛蕊花糖苷含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.1.1 高效液相色譜圖

取毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試溶液按1.2.3色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見圖1。

圖1 毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)及供試溶液(b)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC spectra of verbascoside standard solution(a) and test solution(b)

2.1.2 線性關(guān)系

分別取268 μg·mL-1、134 μg·mL-1、67 μg·mL-1、33.5 μg·mL-1、16.75 μg·mL-1、8.375 μg·mL-1的毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以毛蕊花糖苷濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性方程為：y=13088x+6196.3(R=0.9995)。表明毛蕊花糖苷濃度在8.375～268 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 精密度

精密吸取134 μg·mL-1毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.3色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.24%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性

取阿膠強(qiáng)骨口服液(18101402)6份，按1.2.2方法制備供試溶液，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷峰面積的RSD為1.47%，表明該方法重復(fù)性好。

2.1.5 穩(wěn)定性

取阿膠強(qiáng)骨口服液(18101402)，按1.2.2方法制備供試溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h按1.2.3色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷峰面積的RSD為1.63%，表明供試溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 加標(biāo)回收率

取已知含量的阿膠強(qiáng)骨口服液(18101402)6份，加入一定量的毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2方法制備供試溶液，按1.2.3色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果顯示，平均加標(biāo)回收率為105.17%，RSD為1.11%。

2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.2.1 高效液相色譜圖

取毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試溶液按1.3.3色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見圖2。

圖2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)及供試溶液(b)的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC spectra of calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside standard solution(a) and test solution(b)

2.2.2 線性關(guān)系

分別取125.75 μg·mL-1、62.88 μg·mL-1、31.44 μg·mL-1、15.72 μg·mL-1、7.86 μg·mL-1、3.93 μg·mL-1的毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性方程y=45232x+18634(R=0.9996)。表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度在3.93～125.75 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度

精密吸取50.3 μg·mL-1的毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為0.55%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性

取阿膠強(qiáng)骨口服液(18100501)6份，按1.3.2方法制備供試溶液，按1.3.3色譜條件進(jìn)樣,測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為1.43%，表明該方法重復(fù)性好。

2.2.5 穩(wěn)定性

取阿膠強(qiáng)骨口服液(18100501)，按1.3.2方法制備供試溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h按1.3.3色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為1.92%，表明供試溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 加標(biāo)回收率

取阿膠強(qiáng)骨口服液(18100501)6份，每份加入一定量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.2方法制備供試溶液，按1.3.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果顯示，平均加標(biāo)回收率為96.23%，RSD為2.9%。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取4 000支阿膠強(qiáng)骨口服液處方量的熟地黃、黨參、黃芪、枸杞、阿膠、牡蠣，置于連續(xù)逆流提取設(shè)備中提取，收集提取液，減壓回收乙醇，濃縮至一定比重的浸膏，其余步驟按原工藝進(jìn)行配制口服液。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

以綜合評(píng)分為考察指標(biāo)，采用極差直觀分析4個(gè)因素對(duì)提取效果的影響大小依次為D>C>B>A；方差分析結(jié)果顯示，D因素有極顯著性差異，C因素有顯著性差異。結(jié)合直觀分析，確定連續(xù)逆流最佳提取工藝為A1B1C2D3，即料液比1∶6、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、提取時(shí)間120 min、提取溫度80 ℃。

表 3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

Tab.3 Results and analysis of orthogonal experiments

表 4方差分析

Tab.4 Variance analysis

注：F0.05(2，2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00。

2.4 提取工藝驗(yàn)證

稱取處方量的各個(gè)藥材，按最佳提取條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得毛蕊花糖苷含量分別為25.75 μg、22.24 μg、28.05 μg；毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量分別為87.9 μg、70.84 μg、92.21 μg；黃芪甲苷含量分別為111.34 μg、94.58μg、121.26 μg；總多糖含量分別為15.41 mg、13.35 mg、17.93 mg。表明該提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.5 討論

阿膠強(qiáng)骨口服液(國(guó)藥準(zhǔn)字Z2000039)是由新疆華世丹藥業(yè)股份有限公司研發(fā)的治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥及小兒佝僂病的一款經(jīng)典中藥制劑，其以獨(dú)特的作用機(jī)理和顯著的臨床療效廣受患者青睞。作者所在課題組擬對(duì)阿膠強(qiáng)骨口服液進(jìn)行創(chuàng)新再評(píng)價(jià)研究。將從藥物生產(chǎn)工藝、藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(雜皮膠源阿膠質(zhì)量監(jiān)控)等方面對(duì)阿膠強(qiáng)骨口服液進(jìn)行再評(píng)價(jià)研究，以期對(duì)該口服液進(jìn)行守正創(chuàng)新，獲得一款療效確切、質(zhì)量可靠、技術(shù)工藝先進(jìn)的新型阿膠強(qiáng)骨口服液。

根據(jù)新頒中醫(yī)藥法中藥再評(píng)價(jià)是作為打破傳統(tǒng)中藥品種多、小、散、亂、全格局的必要途徑。目前我國(guó)中藥品種9 000多種，批號(hào)近6萬個(gè)，生產(chǎn)廠家近4 000家，行業(yè)集中度低，低水平重復(fù)，產(chǎn)品缺少深入研發(fā)。改變這種格局需要設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)、實(shí)施嚴(yán)格、結(jié)果可信的上市后的藥物再評(píng)價(jià)研究，需要經(jīng)得起考驗(yàn)的再評(píng)價(jià)循證證據(jù)。相比于傳統(tǒng)的加熱回流提取方式，新型連續(xù)逆流提取顯著改善了阿膠強(qiáng)骨口服液提取效率及提取溶劑的回收率，提取工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的改善是我國(guó)中藥做強(qiáng)做大的主攻方向。

本研究新增4種質(zhì)控指標(biāo)作為阿膠強(qiáng)骨口服液新型連續(xù)逆流提取工藝的監(jiān)控指標(biāo)，不僅對(duì)產(chǎn)品的生產(chǎn)和藥效具有指導(dǎo)作用，還給我國(guó)已上市產(chǎn)品再評(píng)價(jià)給出了參考。

3 結(jié)論

以毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、總多糖含量和提取率為考察指標(biāo)，采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化阿膠強(qiáng)骨口服液連續(xù)逆流提取工藝。結(jié)果表明，4個(gè)因素對(duì)提取效果的影響大小依次為：提取溫度>提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比，確定最佳提取工藝為：料液比1∶6(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、提取時(shí)間120 min、提取溫度80 ℃。