Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選紅景天苷乳劑凝膠處方工藝并研究其對燙傷的治療作用△

李越，吳中寶，楊艷玲，胡等慧，王秀麗*

1.北京中醫(yī)藥大學，北京 102488；2.重慶市藥物種植研究所，重慶 408435

創(chuàng)面是正常皮膚組織在某些外界因素的作用下所導致的損害，如高溫導致的燒燙傷、機械性損害導致的皮膚創(chuàng)傷、低溫導致的凍傷等[1]。其中燙傷發(fā)生頻率不僅高，而且較機械創(chuàng)傷更為復(fù)雜，治療難度大。

紅景天苷(salidroside)來源于景天科植物紅景天，具有抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等作用，目前國內(nèi)外對紅景天的藥理作用研究主要集中在心血管疾病、預(yù)防衰老、抗腫瘤、改善糖尿病癥狀、保護肺纖維化等疾病的治療上[2-3]，暫未檢索到對燙傷的治療，但有研究表明，紅景天苷可通過多種途徑發(fā)揮抗炎作用[4]。目前紅景天主要成分紅景天苷制劑暫無外用制劑，而紅景天作為傳統(tǒng)中藥，在許多典籍中均有活血通瘀、強健機體的記載。因此本研究試圖開拓紅景天苷的治療領(lǐng)域及給藥形式，將紅景天苷承載于便于創(chuàng)面涂抹、透氣、溫和不刺激的乳劑凝膠，建立大鼠Ⅱ度燙傷的創(chuàng)傷模型，以紅景天苷乳劑凝膠外敷，通過檢測治療效果，考察紅景天苷對Ⅱ度燙傷的愈合作用，并探究其作用機制，為擴展紅景天苷的應(yīng)用范圍提供參考。

1 材料

1.1 儀器

OLYMPUS BX51型顯微鏡(北京銳馳恒業(yè)儀器科技有限公司)；FA1204B型分析天平(上海精密儀器儀表有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；3-18N臺式高速離心機(湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司)；超聲波細胞粉碎機(寧波新芝科技股份有限公司)。

1.2 動物

SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為200～220 g。合格證號 SCXK(京)2016-0002，購于北京斯貝福實驗動物科技有限公司，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物房。

1.3 試藥

紅景天苷乳劑、復(fù)合乳化劑(實驗室自制)；京萬紅軟膏(天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司)；10%中性福爾馬林固定液(北京益利精細化學品有限公司)；卡波姆、甘油、EGF抗體、bFGF抗體(上海源葉生物有限公司)；水合氯醛(天津市福晨化學試劑廠)；注射用青霉素鈉(江西省科達動物藥業(yè)有限公司)；絡(luò)合碘消毒液(湖南省廣盛源醫(yī)藥科技有限公司)；0.9%氯化鈉溶液(江西科達衛(wèi)生用品有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅景天苷乳劑的制備

將處方量油相中加入復(fù)合乳化劑，超聲使其分散均勻，水浴60 ℃保溫，作為油相溶液；另取處方量紅景天苷溶于純水中，溶解后60 ℃保溫，作為水相溶液；兩相均保溫至60 ℃時，立即將水相加入至油相中，攪拌得初乳，置于高速均質(zhì)分散機中，11 000 r·min-1均質(zhì)5 min即得終乳。

2.2 紅景天苷乳劑凝膠的制備

稱取卡波姆與甘油適量，研勻后充分溶脹；取2.1方法下制成的紅景天苷乳劑10 mL，稀釋后滴加至溶脹的凝膠中；調(diào)整pH，并加溶脹液至100 g，攪勻，于4 ℃密閉貯存。

2.3 紅景天苷乳劑凝膠的處方工藝優(yōu)化

2.3.1乳劑凝膠成形評分標準 以凝膠的外觀、延展性、均勻度、離心性的綜合評分為考察指標，篩選適宜的凝膠制備處方[5-6]。評分標準見公式(1)，具體評分標準見表1。

綜合評分(100分)=外觀評價(25分)+ 延展性(25分)+均勻度(25分)+離心性(25分) (1)

2.3.2Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化處方工藝 根據(jù)2.2的制備方法制備乳劑凝膠，對卡波姆的用量、乳劑用量、甘油用量及pH等因素進行考察。預(yù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對乳劑凝膠的理化性質(zhì)影響較大的3個因素分別是卡波姆用量、甘油用量及pH。因此，本研究將卡波姆用量(A)、甘油用量(B)、pH(C)3個因素設(shè)為自變量，以乳劑凝膠成形綜合評分Y為評價指標，考察各因素對乳劑凝膠的影響，每個因素選取低、中、高3個水平，設(shè)計因素水平見表2，實驗安排及結(jié)果見表3。

表2 乳劑凝膠處方篩選設(shè)計試驗因素與水平

表3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選紅景天苷乳劑凝膠 處方工藝試驗設(shè)計及其結(jié)果

2.3.3模型擬合 采用Design-Expert 對上面數(shù)據(jù)進行分析，以Y對自變量進行模型擬合，并通過r等對擬合模型進行評價，通過比較各擬合方程的擬合度，得到二次多項式回歸方程Y=81.40-11.12A+9.13B+1.50C+2.00AB-2.75AC-1.25BC-1.95A2-0.45B2-18.20C2，r=0.991 3，P<0.001，F(xiàn)=88.15，表明模型差異有統(tǒng)計學意義；失擬項P=0.345 1>0.05，失擬項不顯著，說明該模型擬合度和可信度均有效，試驗誤差小，可以用此模型對紅景天苷乳劑凝膠的處方優(yōu)化進行分析和預(yù)測。具體結(jié)果見表4。

表4 二次多項式方程模型方差分析

2.3.4響應(yīng)面優(yōu)化分析 根據(jù)擬合方程，通過Design-Expert 8.0.6軟件繪制評價指標綜合評分隨因素變化的等高線圖和響應(yīng)面圖，具體結(jié)果見圖1～6。

圖2 卡波姆用量-甘油用量響應(yīng)面圖

圖3 卡波姆用量-pH等高線圖

由圖1和2可以看出，卡波姆用量和綜合評分呈負相關(guān)，甘油用量和綜合評分呈正相關(guān)，即隨著卡波姆用量的減少和甘油用量的增加，綜合評分在一定范圍內(nèi)增加；由圖3和4可以看出，pH對綜合評分的影響成拋物線形，即隨著pH的升高，綜合評分呈先增大后降低的趨勢，但pH對于綜合評分的影響差異無統(tǒng)計學意義；由圖5和6可以看出，在選定范圍內(nèi)的pH對于綜合評分幾乎沒有影響，但隨著甘油用量的的提高，綜合評分達到最大值，當甘油用量繼續(xù)升高時，綜合評分緩慢降低。因此，在實際生產(chǎn)中應(yīng)控制pH在最佳范圍。

圖4 卡波姆用量-pH響應(yīng)面圖

圖5 甘油用量-pH等高線圖

圖6 甘油用量-pH響應(yīng)面圖

2.3.5響應(yīng)面預(yù)測和驗證 利用Design-Expert 8.0.6版軟件優(yōu)化處方，得到紅景天苷乳劑凝膠的最優(yōu)處方：卡波姆用量為0.5%，甘油用量為15 g，pH為6.5，此時綜合評分為97.37分。按照優(yōu)化的處方劑量制備3批紅景天苷乳劑凝膠樣品進行綜合評分，與預(yù)測值的RSD<5%，說明所得實驗結(jié)果重現(xiàn)性好，制備工藝穩(wěn)定。

2.4 大鼠Ⅱ度燙傷藥效實驗

2.4.1造模及給藥 將大鼠常規(guī)飼養(yǎng)3 d后，用剃毛刀剃去背部長毛，再涂上脫毛膏，3 min后脫去后背部區(qū)域的毛發(fā)，溫水清洗拭干，適應(yīng)喂養(yǎng)24 h，避免大鼠背部皮膚對脫毛膏過敏。實驗組大鼠用10%水合氯醛麻醉[用量0.3 mL·(100 g)-1]，用乙醇消毒脫毛區(qū)域，然后在背部脊柱左右兩邊各1 cm處，以自制的直徑18 mm的離心管注入15 mL 100 ℃熱水，在大鼠背部持續(xù)燙8 s，制成對稱的2個圓形深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面[7-8]，術(shù)中注意保暖，大鼠側(cè)身放置，避免大鼠窒息死亡。

造模成功后，將大鼠隨機分為3組，大鼠燙傷模型組(A組)：常規(guī)飼養(yǎng)，不給藥，涂碘伏消毒；乳劑凝膠組(B組)：給予紅景天苷乳劑凝膠外敷，每天1次；陽性藥組(C組)：常規(guī)飼養(yǎng)，給予京萬紅軟膏外敷，每天1次，每個燙傷創(chuàng)面用量約為0.05 g·min-1。每組大鼠在3、6、11、15、21 d觀察狀態(tài)并取材。

2.4.2大鼠形態(tài)觀察 于燙傷造模后大鼠復(fù)蘇時肉眼觀察，并于燙傷后1、3、6、9、11、15、21 d觀察創(chuàng)面狀態(tài)，記錄滲出物、感染、結(jié)痂紅腫等情況，并拍照。

實驗結(jié)果顯示，大鼠背部皮膚燙傷后，燙傷面為白色，小部分為紫紅色，有輕微水腫，燙傷面質(zhì)地變硬，無感染現(xiàn)象。燙傷面肉眼觀察符合燙傷后深Ⅱ度燙傷的外觀表現(xiàn)。在后續(xù)觀察中，各組均有不同程度的愈合，其中模型組恢復(fù)最慢，直至給藥后第11 d才有較明顯愈合趨勢；給藥組恢復(fù)效果較好，給藥后第6天，給藥組燙傷面已經(jīng)開始脫痂；給藥后第15天，給藥組燙傷面細皮較多，且未再次形成痂皮；給藥后第21天，乳劑凝膠組大鼠背部燙傷面己完全被上皮覆蓋，毛發(fā)生長較多，皮膚組織及功能均已恢復(fù)正常，陽性藥組大鼠背部燙傷面大部分已愈合，但仍有小部分燙傷面的痂皮未脫落，且皮膚有輕微癬痕，而模型組燙傷面仍有較為明顯的燙痕，且愈合率較低。

2.4.3燙傷創(chuàng)面愈合率 用透明硫酸紙描下燙傷輪廓，將所描的透明硫酸紙剪下，然后用萬分之一天平稱定其質(zhì)量，以質(zhì)量代替面積。將燙傷造模后1 d的面積作為原始面積，計算燙傷6、11、15、21 d的愈合率，具體結(jié)果見表5。與模型組相比，給藥3 d后，各組大鼠燙傷面面積無明顯變化；在第6、11、15、21天燙傷面愈合率明顯增加，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。此結(jié)果表明，紅景天苷乳劑凝膠對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面具有修復(fù)作用。

燙傷創(chuàng)面愈合率=(原始燙傷面積- 各時間點未愈合面積)/原始燙傷面積×100%

(2)

2.4.4HE染色觀察 實驗結(jié)束后處死動物，取每組大鼠第3、6、11、15、21天時的局部燙傷皮膚HE染色(蘇木素染細胞核，伊紅染細胞質(zhì))，觀察不同時間點的表皮再生、真皮中炎癥細胞、成纖維細胞、膠原纖維的生長情況，具體結(jié)果見圖7。

表5 燙傷后不同時間各組燙傷面愈合率的比較 %

注：與模型組相比，☆P<0.05；與紅景天苷乳劑凝膠組相比，▽P<0.05，其余P>0.05。

由圖7可知，各組3 d時，可見表皮層及毛囊、皮脂腺被嚴重破壞，組織排列紊亂，有炎性細胞浸潤；6 d時，模型組表皮層結(jié)構(gòu)壞死，無膠原細胞生成，真皮層有大量炎細胞浸潤；11 d時，與模型組相比，給藥組組織排列趨于均勻，炎性細胞浸潤減少，成纖維細胞數(shù)量增加，有少量毛囊及皮脂腺出現(xiàn)，其中紅景天苷乳劑凝膠組更明顯；15 d時，模型組表皮層結(jié)構(gòu)形成，真皮層大量炎癥細胞浸潤，可見少量成纖維細胞；陽性對照組與乳劑凝膠組新生表皮層組織結(jié)構(gòu)分明，膠原纖維密集，毛囊密集清晰可見，間質(zhì)中有少量炎性細胞浸潤。21 d時，模型組可見表皮結(jié)構(gòu)，僅有少量炎癥細胞；陽性對照組與乳劑凝膠組可見完整的表皮層，真皮層可見新鮮毛囊組織。

2.4.5表皮性長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)陽性細胞檢測 實驗結(jié)束后處死動物，取每組大鼠第3、6、11、15、21 d時的局部燙傷皮膚，免疫組化染色后，檢測燙傷肉芽組織中EGF、bFGF陽性細胞，利用image-pro plus 6.0圖像分析系統(tǒng)觀察分析結(jié)果，結(jié)果用平均光密度表示。由實驗結(jié)果可知，各組實驗大鼠在燙傷愈合的過程中，第6、11、15、21天紅景天苷乳劑凝膠組與陽性對照組肉芽組織中bFGF和EGF表達量都明顯高于模型組，且兩者與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。具體結(jié)果見表6～7。

表6 不同時期肉芽組織中bFGF的表達

注：與模型組比較，*P<0.05；與紅景天苷乳劑凝膠組比較，△P<0.05。下同。

表7 各組大鼠燙傷面愈合過程中不同時期肉芽組織中 EGF的表達

3 討論

臨床上外用制劑常用的有膏劑、洗劑、搽劑等，但這些傳統(tǒng)劑型易造成涂布不均、污染衣物，有的還具有易揮發(fā)的缺點，因此臨床應(yīng)用具有一定的局限性。而外用凝膠是藥物與輔料制成的均一、混懸的稠厚液體或半固體制劑。其局部給藥后，患處表面皮膚吸收良好，可以避免口服給藥存在的肝臟首過效應(yīng)和胃腸道的破壞，降低藥物的不良反應(yīng)，除此之外，凝膠劑還有使用舒適、生物利用度高、易清潔等優(yōu)點。本研究選取的凝膠基質(zhì)為卡波姆，其具有釋藥快、易涂展、對皮膚無刺激性和過敏性等優(yōu)點，非常適合作為創(chuàng)傷的外用制劑。因此，本研究將乳劑和凝膠相結(jié)合，制備了乳劑型凝膠，結(jié)果顯示乳劑型凝膠適用于燙傷創(chuàng)面的治療。

本研究優(yōu)化紅景天苷乳劑凝膠處方時采用的是Box-Behnken響應(yīng)面法，目前國內(nèi)篩選處方多采用單因素考察、正交設(shè)計或均勻設(shè)計法尋求最佳的因素水平組合，但不能在給出的整個區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個明確的函數(shù)表達式，從而無法找到整個區(qū)域上因素間的最佳組合和響應(yīng)最優(yōu)值。而本研究采用的Box-Behnken響應(yīng)面法是通過表2～3的設(shè)計得到一定的實驗數(shù)據(jù)，然后采用多元二次方程來擬合因素和效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)(見表4)，是解決多變量問題的一種高效的統(tǒng)計方法。驗證實驗結(jié)果也顯示，本研究理論優(yōu)化結(jié)果與試驗值差異較小，采用的非線性擬合模型接近客觀事實，同時通過圖1～6的響應(yīng)面三維圖也將各因素對指標的影響作用更為直觀、方便地表現(xiàn)出來。

關(guān)于治療效果，根據(jù)表5的實驗結(jié)果可以看出，給藥后21 d，給藥組創(chuàng)面均已基本愈合，傷口愈合率自給藥后均明顯高于模型組(P<0.05)，且在相同時段內(nèi)，乳劑凝膠組較陽性對照組愈合率明顯更高(P<0.05)。說明紅景天苷乳劑凝膠可加快燙傷創(chuàng)面的愈合速度，減小創(chuàng)面面積，與陽性藥相比，肉眼觀察效果大致相當。從圖7 HE染色切片的結(jié)果中可以看出，前3 d各組組織結(jié)構(gòu)不清晰，且炎性細胞浸潤明顯。自第6天起，給藥組鏡下可見新生表皮和新生纖維分化良好，排列整齊，愈合趨勢明顯。

燙傷有凝血期、炎癥期、組織生成期、組織塑形階段等過程，在這些過程中發(fā)揮作用的有中性粒細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、角質(zhì)細胞等[9]。凝血期最先發(fā)生，主要是止血的過程。炎癥期持續(xù)時間較長，一般為3～5 d，分為炎癥早期與炎癥后期，炎癥早期主要是清除微生物，后期主要是形成焦痂，清除炎癥細胞，同時在缺氧環(huán)境下產(chǎn)生大量生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、EGF、bFGF、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)等[10-11]。表6～7的結(jié)果表明，紅景天苷乳劑凝膠組從第6天開始到第21天，EGF與bFGF的表達都顯著增加，說明了紅景天苷乳劑凝膠在一定程度上加快了發(fā)生創(chuàng)面的愈合速度，其原因可能是促進了EGF與bFGF的表達。

綜上所述，本研究采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選的紅景天苷乳劑凝膠的處方工藝，操作簡單、質(zhì)量穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。且其對大鼠Ⅱ度燙傷模型有良好的治療作用，其作用機制可能是提高創(chuàng)面EGF和bFGF的表達而實現(xiàn)的。因此，本研究對擴展紅景天苷治療領(lǐng)域及新給藥形式的進一步開發(fā)與利用提供了新思路。