鉛脅迫對垂柳生長和光合生理特性的影響

薛文秀，尚曉碩，蔣 藝，鄒金華

（1.天津師范大學生命科學學院，天津300387；2.天津師范大學 天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

土壤污染中，鉛是傳播最廣且污染最為嚴重的重金屬污染物之一.當鉛在土壤或水中積累到一定程度時，就會通過食物鏈進入到人體內(nèi)，影響人體健康.關于鉛脅迫對植物產(chǎn)生毒害作用的研究已有一些報道：如Hou 等[1]通過測量葉綠素熒光、抗氧化酶活性、有機酸含量和Pb 含量等指標探究了金絲草對鉛的響應機制；王穎等[2]通過研究不同濃度的鉛對水稻分蘗情況、植株高度、生物量分配、不同部位鉛含量的影響，分析了鉛對水稻生長的脅迫作用.

植物修復是使用綠色植物提取和去除土壤中重金屬污染物的技術，具有高效和低成本的特點，適用于大面積重金屬污染土壤的凈化.目前已知的超富集草本植物有虉草（Phalaris arundinacea）、蘆葦（Phragmites australis）、香蒲（Typha orientalis）等[3]. 草本植物由于生長矮小、生物量低，在植物修復中往往只作為科學研究的對象.速生木本植物由于具有生物量大、根系較深而發(fā)達、易繁殖、不與食物鏈相連等特性在植物修復中備受關注.如歐美國家廣泛種植短輪伐期柳樹人工林用于廢水更新和土壤修復，同時其生物量轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)能源，兼具生態(tài)效益和經(jīng)濟效益[4].

垂柳（Salix babylonica）是我國重要的綠化樹種，具有傳播廣、適應性強、生長快等特點，是一種鉛高富集和高耐受性植物[5]. 本研究用不同濃度的Pb（NO3）2溶液處理垂柳水培枝條，測試不同程度的鉛脅迫下垂柳植株生長、光合色素合成以及光合生理特性的變化，以此探究垂柳在生長和光合作用方面對鉛脅迫做出的響應.

1 材料和方法

1.1 實驗材料

在天津師范大學校園內(nèi)選取長勢較好的垂柳，剪取長度約為15 cm 的枝條.

1.1.1 試劑

硝酸鉛（Pb（NO3）2）、丙酮（CH3COCH3）、Hoagland營養(yǎng)液（5 mmol/L Ca（NO3）2、5 mmol/L KNO3、1 mmol/L KH2PO4、50 μmol/L H3BO3、1 mmol/L MgSO4、4.5 μmol/L MnCl2、3.8 μmol/L ZnSO4、0.3 μmol/L CuSO4、0.1 μmol/L（NH4）6Mo7O24、10 μmol/L Fe-EDTA）.

1.1.2 儀器

Lambda35 紫外可見分光光度計, 美國Perkin Elmer 公司；DUAL-PAM/F 便攜式PAM 熒光儀，德國WALZ 公司.

1.2 方法

1.2.1 植物培養(yǎng)與處理

選取直徑相近的垂柳枝條，將其剪成長度約為15 cm 的短枝并分成5 組，每組24 枝，把短枝固定在紙板上，分別放置于5個相同容量的盛有自來水的盆中進行生根培養(yǎng)，每隔1 周更換1 次自來水.水培2 周后，再使用Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)1 周. 之后，在5個盆中加入同等體積的蒸餾水，再分別加入不同量的Pb（NO3）2，使其濃度分別為0、1、10、50、100 μmol/L.用氣泵通氣，每天觀察垂柳生長情況，定期換水.

1.2.2 垂柳插條根長和株高的測量

Pb（NO3）2溶液處理垂柳插條28 d 后，隨機測量5組插條的根長和新生枝條的株高，分別記錄15個數(shù)據(jù).

1.2.3 葉綠素的提取和測定

Pb（NO3）2溶液處理28 d 后，在5個處理組中分別取0.2 g 葉片，沖洗干凈，放進研缽中，加入5 mL 80%的丙酮溶液在避光條件下研磨，研磨充分后倒入錐形瓶中并封緊，避光過夜.次日早上，在避光條件下，將錐形瓶中的液體倒入15 mL 離心管中，在4 ℃、4000 r/min的條件下離心20 min.離心后將上清液轉(zhuǎn)入到平底試管中并使用80%的丙酮溶液定容至10 mL.搖勻后倒入比色皿中，用分光光度計分別測量波長為663、646、470 nm 時的吸光度值，將數(shù)值帶入公式中分別計算葉綠素a（Ca）、葉綠素b（Cb）和類胡蘿卜素（Cc）的含量，單位均為mg/g[6].

式中：A663、A646、A646分別為波長663、646、470 nm時測量的吸光度值；mf為樣品的鮮重（g）.

1.2.4 葉綠素熒光參數(shù)的測定

Pb（NO3）2溶液處理28 d 后，將5個處理組的垂柳枝條分別黑暗處理30 min，之后選取生長良好的葉片，使用便攜式PAM 熒光儀測量葉綠素熒光參數(shù)，包括初始熒光（F0）、最大熒光（Fm）、PSⅡ最大光化學量子效率（Fv/Fm）、光化學淬滅系數(shù)（qP）、非光化學淬滅系數(shù)（qN 或NPQ）、PSⅡ光化學能量轉(zhuǎn)化的有效量子產(chǎn)量（Y（Ⅱ））[7].根據(jù)數(shù)據(jù)計算可變熒光（Fv=Fm-F0）和PSⅡ潛在活性（Fv/F0）.

F0是PSⅡ反應中心處于完全開放時的熒光產(chǎn)量，反映了PSⅡ光反應中心的活性.Fv/Fm是PSⅡ最大光化學量子產(chǎn)量，反映PSⅡ反應中心的內(nèi)稟光能轉(zhuǎn)換效率，脅迫條件下該參數(shù)明顯下降[8].qP 反映PSⅡ原初電子受體質(zhì)體醌A（QA）的還原狀態(tài)[9].qN 或NPQ 是指熱耗散引起的熒光猝滅，qN 為NPQ 的總系數(shù)，它是植物在光照過強時的一種自我保護機制，反映植物耗散過剩光能為熱的能力，NPQ 表示光適應下的非光化學猝滅，也是植物的一種自我保護機制，它反映的是PSⅡ天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散的部分.

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用SigmaPlot 13.0 和Photoshop CS6 作圖，采用SPSS 17.0 對數(shù)據(jù)進行差異統(tǒng)計學檢驗.

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb 脅迫對垂柳根長和株高的影響

不同濃度的Pb（NO3）2溶液處理28 d 后垂柳的形態(tài)如圖1 所示，株高和根長情況如圖2 所示.

圖1 不同處理組中垂柳的形態(tài)Fig.1 Morphology of S.babylonica with different treatments

圖2 不同處理組中垂柳的株高和根長Fig.2 Shoot height and root length of S.babylonica with different treatments

由圖1 可以看出，1 μmol/L Pb（NO3）2處理組的垂柳形態(tài)與對照組相近；10 μmol/L 處理組中株高明顯降低，根長和側(cè)根數(shù)量下降，但地上分枝數(shù)并未減少且葉片無異常情況；50 μmol/L 和100 μmol/L 處理組中垂柳株高進一步降低，根的茂盛程度下降，分枝數(shù)減少，部分葉片變黃甚至脫落.由圖2 可以看出，與對照組相比，1 μmol/L 的Pb（NO3）2處理組中，垂柳的株高和根長均增加（P ＜0.05）；10、50 和100 μmol/L 處理組中垂柳的株高和根長均顯著降低，且溶液濃度越大，垂柳的株高和根長越小.

2.2 Pb 脅迫對垂柳葉片光合色素含量的影響

不同濃度的Pb（NO3）2溶液處理后垂柳葉片的光合色素含量變化如圖3 所示.

圖3 不同處理組中垂柳的光合色素含量Fig.3 Photosynthetic pigment content of S.babylonica with different treatments

由圖3 可以看出，與對照組相比，在濃度為1 μmol/L的Pb（NO3）2溶液的處理下，垂柳葉片中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b、類胡蘿卜素的含量均有所增加，但與對照組的差異不具有統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）.隨著Pb（NO3）2溶液濃度的進一步增加，垂柳葉片光合色素含量呈下降趨勢，10、50 和100 μmol/L 濃度處理下葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b、類胡蘿卜素的含量均低于對照組，尤其是50 μmol/L 和100 μmol/L 處理組中，垂柳葉片的光合色素含量同對照組的差異均具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）. 由此可見，低濃度的鉛脅迫（1 μmol/L）對垂柳葉片的光合色素含量具有輕微促進作用，這可能是植物對重金屬脅迫作出的應激反應，即一定范圍內(nèi)的重金屬脅迫會刺激植物增加光合色素的合成.鉛脅迫超過一定程度時（≥10 μmol/L），垂柳葉片的光合色素生成受到抑制.

2.3 Pb 脅迫對垂柳葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

不同濃度的Pb（NO3）2溶液處理下，垂柳葉片的葉綠素熒光參數(shù)如表1 所示.

表1 不同處理組中垂柳的葉綠素熒光參數(shù)Tab.1 Chlorophyll fluorescence parameters of S.babylonica with different treatments

由表1 可以看出，隨著Pb（NO3）2濃度的增加，垂柳葉片的初始熒光F0、最大熒光Fm、PSⅡ最大光化學量子效率Fv/Fm、PSⅡ光化學能量轉(zhuǎn)化的有效量子產(chǎn)量Y（Ⅱ）、光化學猝滅系數(shù)qP 均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，Pb（NO3）2溶液的濃度為1 μmol/L 時達到最大值，Pb（NO3）2溶液超過10 μmol/L 時垂柳葉片的葉綠素熒光效率則受到抑制，且隨著Pb（NO3）2濃度的增加抑制作用增強.非光化學猝滅系數(shù)qN 和NPQ隨Pb（NO3）2濃度增加的變化趨勢則相反.

3 討論

本研究對垂柳水培枝條施加不同程度的鉛脅迫，觀察鉛脅迫對垂柳生長和光合生理特性的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度（1 μmol/L）的Pb（NO3）2溶液對垂柳生長具有一定的促進作用，高濃度的Pb（NO3）2溶液（10、50和100 μmol/L）對垂柳生長則具有明顯的抑制作用，且隨著濃度增加，抑制作用增強.鉛脅迫下，垂柳地上和地下部分的生長均受到抑制，但根部受抑制的程度明顯高于地上部分. Zou 等[10]研究了不同程度的鎘脅迫對旱柳生長的影響，發(fā)現(xiàn)根部是鎘吸收和積累的主要部位；王曉娟等[11]也認為，植物根部是重金屬污染最敏感的部位，這是因為根部與重金屬直接接觸，使得重金屬在根部積累較多，為了避免重金屬對植物的危害，植物體產(chǎn)生了多種限制重金屬吸收和轉(zhuǎn)移的生理生化機制，因此相比于根部，地上部分所受抑制較小.

光合作用和新陳代謝能否正常進行與光合色素的含量密切相關[12].與對照組相比，在低濃度（1 μmol/L）的鉛脅迫下，垂柳的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b、類胡蘿卜素的含量均增加，而在高濃度（10、50 和100 μmol/L）的鉛脅迫下，光合色素含量隨鉛脅迫程度的增加降低.王婭玲等[13]認為低濃度的鉛脅迫可以增強植物體內(nèi)葉綠體的酶活性，促進葉綠素的合成，從而使葉綠素含量增加；高濃度的鉛可能會導致葉綠體酶活性失調(diào)，從而加快葉綠素分解. 鄒洪梅等[14]也指出，高濃度的金屬離子會抑制某些酶的活性，而這些酶與葉綠素生物合成密切相關，導致葉綠素合成受阻，葉綠素含量下降.

葉綠素熒光動力學反映了環(huán)境因子對植物光合作用的影響，因此常用于檢測環(huán)境脅迫對植物的影響以及植物對環(huán)境脅迫的響應機制[15].本研究中，在高濃度（10、50 和100 μmol/L）Pb（NO3）2溶液的處理下，隨處理濃度的增加，F(xiàn)0、Fm、Fv/Fm、Y（Ⅱ）、qP 的數(shù)值逐漸減小，qN、NPQ 的數(shù)值則逐漸增大，這與黃軒等[8]的研究結(jié)果相似.在高濃度Pb（NO3）2溶液的處理下，F(xiàn)v/Fm值和Y（Ⅱ）值的降低說明鉛脅迫下垂柳葉片的光合機構受到了一定程度的傷害，PSⅡ反應中心的活性被抑制，因而葉片對光能的吸收和轉(zhuǎn)化效率明顯下降，暗反應中光合碳同化所需的能量積累被阻礙[16].qP 為光化學淬滅系數(shù)，在一定程度上反映了該反應中心的開放度高低，而非光化學猝滅系數(shù)qN 是指葉片吸收的光能以熱量形式耗散的程度，qN 為NPQ 的總系數(shù)，NPQ數(shù)值大小反映的是植物對光合機構的保護程度[8].在高濃度Pb（NO3）2溶液的處理下，qP 的下降和qN 的上升說明反應中心的開放度逐漸降低，葉片吸收的光能更多的以熱能形式耗散，熱耗散可以抵御光抑制帶來的破壞，并且保護PSⅡ反應中心免受損傷.相反，在低濃度的Pb（NO3）2溶液（1 μmol/L）處理下，與對照組組相比，垂柳葉片的F0、Fm、Fv/Fm、Y（Ⅱ）、qP 數(shù)值均顯著增加，qN、NPQ 的數(shù)值則有所減小，說明環(huán)境中少量的鉛會促進植物的光合作用，提高光能的吸收和轉(zhuǎn)化效率，增大反應中心的開放程度.

總的來看，培養(yǎng)基質(zhì)中鉛的含量較低時，垂柳的生長、光合色素生成及光合生理均得到促進，鉛含量較高時，垂柳生長和光合色素合成均受到抑制，葉片光合機構受到傷害，PSⅡ反應中心的開放度降低，葉片吸收的光能更多地以熱能形式釋放出去以減少重金屬鉛的傷害.