珍稀藥用真菌桑黃菌絲體粉中黃酮含量測定

李劍梅 張疏雨 于廣豐 柴林山

（遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽122000）

桑黃（Phellinus igniariu）屬多孔菌科（Polyporaceae），是一種極名貴的藥用真菌（圖1、圖2），在我國、韓國有著悠久的應(yīng)用歷史[1-2]。野生桑黃子實體稀少，且需要多年才可長成可用子實體，而人工栽培桑黃子實體，也存在生產(chǎn)周期長，成本高，勞動強度大問題。因此，液體深層發(fā)酵技術(shù)，以其生產(chǎn)成本低、周期短、易控制等特點，成為研究生產(chǎn)富含黃酮桑黃菌絲體的一個熱點。研究表明：桑黃菌絲體除含有豐富的菌絲體蛋白外，還含有多糖、黃酮、萜類等生理活性成分，對動物機體具有免疫調(diào)節(jié)、抗發(fā)炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種藥理作用，具有廣闊的應(yīng)用前景［3-8］。研究以蘆丁為標準品，采用NaNO2-Al3+-NaOH體系吸光光度法，測定桑黃菌絲體粉中總黃酮的含量，為桑黃菌絲體蛋白產(chǎn)品的研發(fā)質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

（1）桑黃菌絲體粉：供試桑黃菌絲體由桑黃菌株S-1（lnonotus linteu）發(fā)酵培養(yǎng)獲得，供試菌株來源于遼寧省微生物科學(xué)研究院。

（2）主要試劑：蘆丁標準品（純度98%，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇（天津市匯航化工公司）；葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaOH、Al（NO3）3、NaNO2（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠），用水為蒸餾水。

（3）主要儀器：723分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司），SL-H-4水浴鍋（江蘇榮華儀器制造有限公司），AL 204型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），BHC-1300IIA/B2生物安全柜（上海立申科學(xué)儀器有限公司），立式恒溫搖床（上海世平儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，瓊 脂 1.5%，1 000 mL培養(yǎng)基加VB11片，pH 6。121℃條件下滅菌20 min。

（2）液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，玉米粉0.5%，葡萄糖2%，蛋白胨0.8%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，1 000 mL培養(yǎng)基加 VB11片，pH 6。121℃條件下滅菌20 min。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉2%，桑葉粉0.5%，葡萄糖3%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，1 000 mL培養(yǎng)基加VB11片，pH 5.5。121℃條件下滅菌20 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試桑黃菌絲體粉制備

將保存的桑黃菌種接入PDA斜面培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培養(yǎng)10 d，無菌挑取直徑約1 cm2斜面培養(yǎng)基上的新鮮桑黃菌塊4～5塊，轉(zhuǎn)入裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5 d；將上述已培養(yǎng)好的液體菌種按體積比8%的接種量接入裝有300 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1 000 mL三角瓶中，溫度28℃，搖床轉(zhuǎn)數(shù)180 r/min，培養(yǎng)82 h。將發(fā)酵液用兩層紗布過濾，用蒸餾水沖洗菌絲體3次，于恒重的稱量瓶中，60℃干燥至恒重，粉碎，過60目篩，備用。

圖1 野生桑黃

圖2 人工栽培桑黃

1.3.2 桑黃菌絲體粉黃酮粗提液的制備

精確稱量桑黃菌絲體粉0.5 g，加70%的乙醇30 mL，于70℃水浴回流，每次提取3 h，過濾，用70%的乙醇定容至100 mL，備用。

1.3.3 蘆丁標準品溶液配制

精密稱取蘆丁標準品10.0 mg，使用70%乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，配制成濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液，備用。

1.3.4 標準曲線的繪制

采用NaNO2-Al3+-NaOH體系吸光光度法。分別精密吸取 0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL蘆丁標準品溶液，各置于25 mL容量瓶中，分別加入 70% 乙醇 5 mL、4.5 mL、4.0 mL、3.0 mL、2.0 mL、1.0 mL、0.0 mL搖勻；然后分別加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，靜置6 min；分別加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL搖勻，靜置6 min；再分別加4%氫氧化鈉溶液10 mL，放置10 min后，用70%乙醇稀釋至25 mL，置比色皿中，在波長510 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，蘆丁濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.5 桑黃菌絲體粉中黃酮含量的測定

準確吸取供試樣品溶液3 mL，置于25 mL容量瓶中，加入70%乙醇2.0 mL，搖勻后，同1.2.4標準曲線繪制的方法進行供試樣品溶液的顯色，并在波長510 nm處測定吸光度。通過回歸方程及樣品稀釋倍數(shù)，計算出樣品中總黃酮含量（mg/g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

結(jié)果顯示（圖3）：采用NaNO2-Al3+-NaOH比色法獲得的蘆丁的標準曲線在0～0.04 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，線性方程為：y=0.010x-0.016，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.994。

圖3 蘆丁的標準曲線

2.2 樣品測定結(jié)果

按1.2.1方法液體培養(yǎng)桑黃絲體，共做5次重復(fù)試驗，所獲菌絲體粉呈淡土黃色粉末，具有桑黃菌絲體粉特有的香氣（圖4）。5批桑黃菌絲體粉中黃酮含量的測定結(jié)果分別為：8.363 mg/g、6.236 mg/g、8.761 mg/g、7.532 mg/g、6.851 mg/g，樣品中黃酮含量平均值（x）為7.549 mg/g，相對標準差RSD為13.8%。

圖4 桑黃菌株S-1菌絲體粉

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗

精密吸取樣品溶液5份，按1.2.4方法在510 nm處測定樣品吸光度值，吸光度值分別為0.303、0.332、0.321、0.326、0.330，平均為0.322，相對標準偏差RSD為3.67%（n=5），相對標準誤差小于8%，表明該比色法能較精密地測定樣品的吸光度值。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗

精密吸取樣品液1份，按照1.2.4方法顯色后，在510 nm處，每隔10 min測定其吸光度值，連續(xù)測定40 min，結(jié)果分別為0.238、0.237、0.238、0.235，相對標準偏差RSD=0.60%（n=4）。由此可以看出，在測定40 min內(nèi)，該比色法具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.3 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批次桑黃菌絲體粉5份，每份0.5 g，按照1.2.5方法測定黃酮含量，結(jié)果分別為：8.761 mg/g、8.807 mg/g、8.724 mg/g、8.695 mg/g、8.752 mg/g，相對標準偏差RSD為0.48%（n=5），表明該方法方法重復(fù)性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗

在已經(jīng)測定出含量的5份桑黃菌絲體黃酮提取液中，分別加入一定濃度的標準對照品后測定樣品中黃酮含量。由表1可以看出，在試驗范圍內(nèi)，加樣回收率在98.04%～101.93%，平均回收率為99.95%，RSD為1.41%（n=5），表明該方法回收良好。

表1 桑黃菌絲體黃酮檢測加樣回收率試驗結(jié)果

3 小結(jié)

以NaNO2-Al3+-NaOH比色法測定桑黃菌絲體粉中黃酮含量。在試驗條件下，該方法回收率良好，且專屬性更強、精密度高、重復(fù)性好，可作為桑黃菌絲體粉中黃酮含量測定方法。5批桑黃菌絲體粉中黃酮含量均在6.2 mg/g以上，考慮該產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的特性，將桑黃菌絲體粉中黃酮含量的限度定不少于6.0 mg/g。

近年來，我國在桑黃菌人工栽培、液體發(fā)酵培養(yǎng)、活性物質(zhì)研究等方面雖然取得較大的研究進展，但仍然存在著人工栽培周期長、成本高、菌種代謝產(chǎn)物中桑黃黃酮等活性成分含量低、菌種質(zhì)量認定標準缺乏等產(chǎn)業(yè)發(fā)展瓶頸。因此，加強桑黃種質(zhì)資源及優(yōu)良菌種選育創(chuàng)新技術(shù)研究、提升功效成分含量及質(zhì)量標準研究，對提升桑黃資源應(yīng)用價值，促進我國桑黃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。