乳鐵蛋白抑制常見(jiàn)口腔及腸道致病菌的體外活性研究

黃增穎,賴偉偉,戴亞妮,徐鳳蓮,馮 鑫,張輝華,劉 燊*

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 佛山 528000；2. 無(wú)錫科捷諾生物科技有限責(zé)任公司，江蘇 無(wú)錫 214145)

乳鐵蛋白(Lactoferrin)是動(dòng)物乳汁中一種非血紅素鐵結(jié)合的糖蛋白，也是中性粒細(xì)胞顆粒中具有殺菌活性的單體糖蛋白，具有廣譜抑菌劑，既抑制需鐵革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、牙齦卟啉單胞菌等)，也抑制革蘭氏陽(yáng)性菌(如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和單細(xì)胞李斯特菌等)，但對(duì)需鐵少的微生物(如乳酸桿菌、雙歧桿菌)則不抑制[1-3]。同時(shí)，乳鐵蛋白還是一種無(wú)副作用、無(wú)耐藥性的抗菌、抗病毒、抗傳染、免疫調(diào)節(jié)和消炎等活性物質(zhì)[4]，是哺乳類動(dòng)物免疫系統(tǒng)的重要組成部分[5]。因此， 乳鐵蛋白在功能營(yíng)養(yǎng)食品和醫(yī)療保健方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

本文采用了一種由Yang等[6]研究的奶牛乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的重組人乳鐵蛋白(rhLF)和普通牛乳鐵蛋白(bLF)進(jìn)行試驗(yàn)，探討乳鐵蛋白對(duì)口腔/腸道致病菌的抑制和細(xì)菌生物膜清除作用，為新型動(dòng)物飼料添加劑開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

重組人乳鐵蛋白rhLF(無(wú)錫科捷諾生物科技有限責(zé)任公司)；牛乳鐵蛋白bLF(Miragen公司)；溶菌酶(杭州伊杰斯生物科技有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 抑菌性菌種選擇 金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、嗜酸乳桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、牙齦卟啉單胞菌、白色念珠菌(白色假絲酵母菌)，由江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.2 菌種的活化 活化菌種將7種供試菌種接入相對(duì)應(yīng)的斜面培養(yǎng)基(蛋白胨牛肉膏瓊脂)進(jìn)行活化培養(yǎng)(細(xì)菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h)，連續(xù)接種兩代。接種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、沙門氏菌于瓊脂平板培養(yǎng)基表面；接種牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌于斯氏血瓊脂培養(yǎng)基表面；接種嗜酸性乳桿菌于MRS培養(yǎng)基表面。

1.2.3 指示菌制備 制備菌懸液將已接種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、沙門氏菌的瓊脂平板放入37 ℃普通培養(yǎng)箱，孵育24 h；將已接種白色念珠菌的瓊脂平板放入28 ℃普通培養(yǎng)箱，孵育48 h；將已接種變形鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌的斯氏血瓊脂培養(yǎng)基放入?yún)捬醮?7 ℃孵育48 h；將已接種嗜酸性乳桿菌接種MRS平板放入37 ℃普通培養(yǎng)箱，孵育24 h。分別用接種針挑取少量已活化好的供試菌菌絲體放入裝有無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩搖勾，制成一系列菌懸液，并以細(xì)胞計(jì)數(shù)板確定菌懸液濃度約為107cfu/mL，備用。

1.2.4 抑菌試驗(yàn) 將已滅菌的固體培養(yǎng)基溶化(45 ℃)后倒入培養(yǎng)皿中，將供試菌懸液與其混合均勻，待其冷卻。用無(wú)菌鑷子夾取滅菌的牛津杯，以一定間隔距離輕放在含菌平板上，加入100 μL 40 mg/mL的乳鐵蛋白、溶菌酶和沖劑溶液，并以加入100 μL無(wú)菌水作為空白對(duì)照組。每種菌3個(gè)平行。然后將已接種完成的平板倒置于適宜溫度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。按上述各個(gè)菌培養(yǎng)適宜時(shí)間后，取出，測(cè)量抑菌圈大小。選出上述樣品敏感的菌種，確定下一步MIC要培養(yǎng)的菌種。

1.2.5 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 將上述樣品溶液的母液1 mL分別加入至含有8 mL已滅菌的蛋白胨水培養(yǎng)基和1 mL菌濃(cfu)為107的菌懸液中使得LF和溶菌酶的終濃度為80 mg/mL、40 mg/mL、20 mg/mL、10.0 mg/mL、5.0 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.5 mg/mL、0 mg/mL，然后每管加入待檢菌液50 μL，混勻，每個(gè)菌種重復(fù)4組，每組均有陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。需氧菌取營(yíng)養(yǎng)肉湯，白色念珠菌取沙保羅氏肉湯，厭氧菌取TSB肉湯培養(yǎng)。需氧菌于培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)，厭氧菌于厭氧產(chǎn)氣袋中37 ℃恒溫培養(yǎng)9 h，測(cè)定OD560，觀察細(xì)菌和厭氧菌等生長(zhǎng)情況并記錄，然后將肉眼觀察未長(zhǎng)菌的試管中溶液劃線接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基上，最終未長(zhǎng)菌的最低藥液濃度為最低抑菌濃度(MIC)。

1.2.6 LF對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌細(xì)菌生物膜形成的影響 采用結(jié)晶紫染色法。在超凈工作臺(tái)上，分別加菌液(對(duì)數(shù)期細(xì)菌，細(xì)菌濃度調(diào)整為106CFU/mL)及LF、溶菌酶于24孔PVC板并做4個(gè)平行，同時(shí)設(shè)LB培養(yǎng)基空白對(duì)照和不加抑菌成分的陰性對(duì)照組，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸掉培養(yǎng)物，用無(wú)菌PBS洗去浮游菌，向各孔中加入1 mL無(wú)水甲醇固定生物膜15 min，將培養(yǎng)板在50 ℃下晾干，加入500 μL 1%的結(jié)晶紫于各孔中染色10 min，之后用PBS緩沖液進(jìn)行沖洗，加入95%的乙醇進(jìn)行脫色，并將溶液移至另一塊96孔酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀570 nm進(jìn)行檢測(cè)。抑制率=(1-試驗(yàn)組A570/陰性對(duì)照組A570) ×100%。

1.2.7 LF對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌細(xì)菌生物膜的清除作用 用24孔板培養(yǎng)細(xì)菌12 h以形成生物膜，生物膜形成后棄去菌液，向培養(yǎng)板每孔加入系列濃度的抑菌劑溶液，37℃孵育24 h，用1.2.5中的方法染色檢測(cè)，每株菌設(shè)4個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值，以不經(jīng)抑菌劑處理的孔為對(duì)照組。生物膜清除率=(1-試驗(yàn)組A570/對(duì)照組A570)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較分析(Duncan法)，以P<0.05作為顯著性差異，P<0.01作為極顯著性差異的判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低抑菌濃度(MIC)

由表1可見(jiàn)，溶菌酶對(duì)金黃色葡萄球菌和牙齦卟啉單胞菌的抑制活性較強(qiáng)，MIC為2.5 mg/mL；溶菌酶和rhLF對(duì)大腸桿菌的抑制活性相對(duì)較弱，MIC為40.0 mg/mL；rhLF對(duì)金黃色葡萄球菌、嗜酸乳桿菌、沙門氏菌的抑制活性較強(qiáng)，MIC為5.0 mg/mL；bLF對(duì)嗜酸乳桿菌、沙門氏菌的抑制活性較強(qiáng)，MIC為5.0 mg/mL。

表1 bLF、rhLF和溶菌酶對(duì)7種菌的最低抑菌濃度Table 1 Minimum inhibitory concentration of bLF, rhLF and lysozyme

2.2 抑菌圈試驗(yàn)

由表2可見(jiàn)，bLF對(duì)嗜酸乳桿菌抑制效果最佳，沙門氏菌、牙齦卟啉單胞菌次之，效果最差是變形鏈球菌；rhLF對(duì)嗜酸乳桿菌抑制效果最佳，金黃色葡萄球菌、白色念珠菌次之，效果最差是牙齦卟啉單胞菌。兩種LF相比，rhLF對(duì)金黃色葡萄球菌、嗜酸乳桿菌的抑制效果優(yōu)于bLF(P<0.05)，而bLF對(duì)沙門氏菌、牙齦卟啉單胞菌的抑制效果優(yōu)于rhLF(P<0.05)。

2.3 乳鐵蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌細(xì)菌生物膜形成及清除作用

由表3可以看出，當(dāng)濃度達(dá)到了5 mg/mL時(shí)，rhLF對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果為99%，但與溶菌酶的效果沒(méi)顯著性差異；隨著濃度降低，rhLF的抑菌效果則不如溶菌酶 (P<0.05)； 三者中，bLF的抑制效果最弱。金黃色葡萄球細(xì)菌生物膜抑制率的大小關(guān)系為：溶菌酶> rhLF >bLF。

表2 牛乳鐵蛋白(BLF)、重組人乳鐵蛋白(rhLF)、溶菌酶對(duì)不同細(xì)菌和真菌的抑菌效果Table 2 Inhibitory effect of bLF, rhLF and lysozyme on different bacteria and fungus

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase superscripts in the same row show significant difference (P<0.05).The same below.

表3 bLF、rhLF白和溶菌酶對(duì)金黃色葡萄球菌沙門氏菌生物膜形成及清除作用結(jié)果Table 3 bLF,rhLF and lysozyme on biofilm formation and clearance of Salmonella aureus

在沙門氏菌方面，當(dāng)濃度為2.5 mg/mL時(shí)，bLF抑制金黃色葡萄菌的抑制率為83%，顯著高于rhLF和溶菌酶的76%和70% (P<0.05)；當(dāng)它們的濃度到達(dá)5 mg/mL時(shí)，三種抑菌物質(zhì)對(duì)沙門氏菌的抑制率達(dá)到了96%，但沒(méi)有顯著性差異；生物膜形成抑制率的大小關(guān)系為：bLF> rhLF >溶菌酶。

三種抑菌物質(zhì)的抑菌效果與濃度呈正相關(guān)，當(dāng)rhLF濃度達(dá)到5 mg/mL，rhLF對(duì)金黃色葡萄菌的清除率達(dá)到56%；但濃度少于5 mg/mL時(shí)，rhLF效果不如溶菌酶；bLF在三者中效果最差。

當(dāng)rhLF和bLF濃度達(dá)到5 mg/mL，對(duì)沙門氏菌的清除率達(dá)到53%～55%，效果遠(yuǎn)大于溶菌酶的41%，說(shuō)明了rhLF與bLF之間差異不顯著，與溶菌酶差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

乳鐵蛋白是一種安全可靠的天然物質(zhì)，隨著作用機(jī)制的不斷闡明和開(kāi)發(fā)應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，在疾病防治、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充、食品和藥品防腐、化妝品等方面有廣闊的應(yīng)用前途，可作為一種無(wú)耐藥性、抗菌效果好、無(wú)產(chǎn)生副作用等新型飼料添加劑使用。乳鐵蛋白發(fā)揮抗菌功能主要是與它的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，結(jié)合Fe3+限制細(xì)菌的生長(zhǎng)、與細(xì)菌其他部位非特異結(jié)合阻斷細(xì)菌毒性蛋白的分泌和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分泌、發(fā)揮蛋白水解酶活性降解細(xì)菌黏附蛋白等是其幾種重要抗菌機(jī)制[7]。文獻(xiàn)已證實(shí)，乳鐵蛋白在人體和動(dòng)物體內(nèi)的免疫防御起到重要作用。王中強(qiáng)等應(yīng)用天然bLF測(cè)定其對(duì)多種細(xì)菌的MIC試驗(yàn)表明，對(duì)大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)[8]。羅紅霞等對(duì)魯西黃bLF在大腸桿菌中的融合表達(dá)及其抗菌的研究結(jié)果顯示，rhLF對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和變形鏈球菌均有抑菌活性[9]。姚望等[3]乳鐵蛋白抑菌試驗(yàn)表明，乳鐵蛋白對(duì)牙齦卟啉單胞菌的生長(zhǎng)有抑制作用。Wang等[10]在早期斷奶仔豬添加1%的乳鐵蛋白能能顯著性地減少大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)，顯著增加乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)。上述研究表明，乳鐵蛋白對(duì)動(dòng)物抑菌和增強(qiáng)免疫方面起到重要作用。

本試驗(yàn)研究的體外抑菌試驗(yàn)中，bLF與rhLF都與上述研究相有相似的效果。bLF對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制效果及細(xì)胞膜形成比革蘭氏陽(yáng)性強(qiáng)，而rhLF對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制效果及細(xì)胞膜形成比革蘭氏陰性強(qiáng)，兩者差別經(jīng)查找文獻(xiàn)有以下說(shuō)法：從乳鐵蛋白本身來(lái)說(shuō)，(1)bLF跟rhLF的二級(jí)結(jié)構(gòu)不同。rhLF比牛乳鐵蛋白在α-螺旋多于β-折疊[11]，并在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上折疊兩個(gè)對(duì)稱的具有相似結(jié)構(gòu)的球狀葉(N-葉和 C-葉)，兩葉氨基酸序列具有40%的同源性，同時(shí)各具有一個(gè)鐵離子結(jié)合位點(diǎn)[12-13]，說(shuō)明可能是結(jié)合Fe3+的能力不同導(dǎo)致；(2)人乳和牛乳的最大差別之一就是溶菌酶的含量[14]；(3)LF與細(xì)菌脂多糖(LPS)的互相交叉作用下也增強(qiáng)了溶酶菌抗菌劑的抗菌性等[15]。從抑菌的菌種來(lái)說(shuō)，(1)可能的原因是不同細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)上的差異，這種差異不僅是肽聚糖和非肽聚糖的比例，而且肽聚糖層的結(jié)構(gòu)組成也很大程度上影響著細(xì)菌對(duì)于抑菌成分的敏感性；(2)這些抑菌物質(zhì)對(duì)各種菌類抑菌方式有所差異。如LF對(duì)菌的抑制大多數(shù)是通過(guò)抑制Fe3+，但也有研究證實(shí)，如革蘭氏陰性菌 沙門氏菌、克雷白氏桿菌屬和奈瑟菌屬等通過(guò)表達(dá)鐵載體蛋白，與LF競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Fe3+以滿足自身的需要[16]。具體的抑菌機(jī)制本試驗(yàn)因試驗(yàn)局限性，有待更多進(jìn)一步深入研究。

在免疫調(diào)節(jié)和抑制細(xì)菌生物膜方面，抑制細(xì)菌的生物膜的生成和消除能增強(qiáng)免疫反應(yīng)系統(tǒng)免疫力，防止細(xì)菌等微生物的進(jìn)一步繁殖生長(zhǎng)，以達(dá)到增強(qiáng)免疫力的目的。Sing等[17]證明，高濃度 Fe3+有助于細(xì)菌間黏附形成生物膜；缺鐵乳鐵蛋白與Fe3+的螯合結(jié)合，從而減少環(huán)境中Fe3+的濃度，抑制細(xì)菌的黏附和生物膜的形成。也有研究表明，在病患者的唾液中當(dāng)Fe3+的濃度小于0.1 μmol/L時(shí)，在口腔里變形鏈球菌更容易發(fā)生細(xì)胞凝集，但Fe3+的濃度大于0.1 μmol/L時(shí)，則抑制變形鏈球菌生物膜的生成，證明了LF抑菌的作用在免疫防御第一道防線起到重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)rhLF的濃度為5 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的生物膜的抑制率達(dá)到97%以上，生物膜的清除率為53%以上。這些結(jié)果說(shuō)明bLF、rhLF和溶菌酶對(duì)細(xì)菌生物膜具有顯著抑制和清除作用，能夠有效對(duì)抗細(xì)菌及其生物膜的危害，這對(duì)于維護(hù)口腔健康和腸道健康都具有重要意義。

我國(guó)預(yù)計(jì)2020年全面禁止抗生素，畜牧業(yè)向著無(wú)抗養(yǎng)殖的趨勢(shì)，當(dāng)今減抗、限抗、替抗的時(shí)代背景下，人乳鐵蛋白在未來(lái)食品、藥品、飼料等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。除了廣譜抗菌之外，乳鐵蛋白還具有預(yù)防動(dòng)物腹瀉、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、防止飼料給氧化等多重作用，進(jìn)一步加速其在畜禽養(yǎng)殖上的應(yīng)用。

4 結(jié) 論

乳鐵蛋白對(duì)常見(jiàn)口腔/腸道致病菌均具有一定的抑制作用，尤其對(duì)金黃色葡萄球菌、嗜酸乳桿菌、沙門氏菌、牙齦卟啉單胞菌的抑制效果最強(qiáng)；同時(shí)，LF還能抑制細(xì)菌生物膜形成和清除已形成的細(xì)菌生物膜，在新型動(dòng)物飼料添加劑及保健產(chǎn)品方面表現(xiàn)出潛在的開(kāi)發(fā)價(jià)值。