九蒸九制多花黃精炮制過程變化研究

馬佳麗 蔣殷盈 蔣福升 李石清 張 婷 袁 強 張春椿

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)院 3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院

多花黃精（Polygonatum cyrtonema）系百合科黃精屬植物，是中藥材黃精主要基源之一，為一種重要的野生中藥資源。多花黃精為藥食同源的多年生草本植物，其味甘、平，歸脾、肺、腎經(jīng)，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎等功效，主要用于脾胃氣虛、體倦乏力、口干食少、肺虛咳嗽、勞嗽咳血、精血不足、須發(fā)早白、內(nèi)熱消渴等病癥[1]?，F(xiàn)代研究表明，多花黃精主要含有多糖[2-3]、甾體皂苷[4-5]、黃酮、生物堿、木脂素、果糖[6]、氨基酸[7]等化學(xué)成分，具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、改善記憶障礙、保護(hù)腎功能等多種藥理作用[8-13]。

黃精的“九蒸九曬”加工方法始載于《食療本草》：“餌黃精……可取甕子，去底，釜上安置，令得所盛黃精，令滿，密蓋，蒸之，令氣溜，即暴之第一遍，蒸之亦如此，九蒸九曝。”[14]經(jīng)九制的黃精油潤軟糯，味道甘甜，且儲存時間延長，因此，此炮制方法仍延續(xù)至今。但九蒸九制的炮制機理和意義尚未進(jìn)行系統(tǒng)科學(xué)詮釋且其研究較少。本研究通過對多花黃精炮制過程中物理化學(xué)性質(zhì)、物質(zhì)含量等變化規(guī)律的探索，為多花黃精九蒸九制的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 多花黃精，采集于浙江麗水景寧，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張春椿副教授鑒定為百合科黃精屬植物多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua的根莖，樣品采收后除去泥沙及須根、60℃烘干至恒重；九蒸九制多花黃精（自制）；乙醇分析純（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20161105）；蒽酮（上海展云化工有限公司，批號：160115）；硫酸（西隴科學(xué)股份有限公司，批號：161009）；甲酸（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號：090610）；乙腈 （Spectrum Chemical Mfg.Corp，批號：16075051）；5-羥甲基糠醛對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：H12M9Z61023）；娃哈哈純凈水。

1.2 儀器 戴安U3000分析型高效液相（美國賽默飛戴安），Waters XB-C18（250mm×4.6mm，5μm）（JL科技股份有限公司），超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），HC-3618R高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），AL104電子天平 （上海梅特勒-托利多儀器有限公司），UV3300紫外分光光度計 （美國Amersham Biosciences），HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市城東盛聯(lián)實驗儀器廠），SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 （鄭州長城科工貿(mào)有限公司），GZX-970 MBE電熱鼓風(fēng)干烘箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），DJ-04中藥粉碎機 （上海定久中藥機械知道有限公司），F(xiàn)iveEasy Plus pH計（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 九蒸九制多花黃精樣品及其水提液的制備 挑選大小相近的多花黃精切片，置蒸鍋隔層上，多花黃精體質(zhì)量與水量1:1，隔水蒸4h后取出，放入60℃烘箱中干燥12h，此為“一蒸一制”，標(biāo)記為PCH1。在此基礎(chǔ)上重復(fù)循環(huán)，直至 “九蒸九制”并標(biāo)記為多花黃精PCH1-9。同時收集每次蒸制后的剩余水提液，標(biāo)記為S1-9，裝入凍存管中并放至-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 外觀、氣味、水提液pH、干物質(zhì)體質(zhì)量變化結(jié)果 分別取100mL多花黃精S1-9批次水提液放置于常溫解凍，測定水提液的pH值及蒸干后得到的干物質(zhì)體質(zhì)量。隨著多花黃精蒸制次數(shù)的增多，其顏色會由淺黃變?yōu)樯钭厣咏谏湔糁频玫降乃嵋簆H也逐漸減小。不同批次外觀、氣味、水提液pH、干物質(zhì)體質(zhì)量變化結(jié)果見表1、圖1。

2.3 九蒸九制多花黃精多糖含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取在105℃下干燥至恒重的無水葡萄糖對照品33mg，置于100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度線，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液（每1mL溶液中含無水葡萄糖300μg）。

2.3.2 供試品溶液的制備 樣品烘干至恒重，打粉，過60目篩。精密稱取各批次樣品10.0g，加入80%乙醇回流1h抽濾，再加水100mL，回流2h，趁熱抽濾，合并濾液濃縮至50mL，取1mL稀釋至200mL容量瓶中，定容。

2.3.3 波長的選擇 按照2015版《中國藥典》一部黃精多糖檢測項下規(guī)定，黃精多糖在紫外可見光區(qū)582nm處有最大吸收峰[1]，故檢測波長設(shè)定為582nm。

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密移取對照品溶液0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL 于10mL干燥潔凈的具塞刻度試管中，依次加入超純水使溶液的最終體積為2mL，0.2%蒽酮-硫酸溶液緩緩加入到試管至刻度線，搖勻，紫外分光光度計測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程C=39.039x-0.0167（R2=0.9991），表明葡萄糖對照品在0.033～0.0198g·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度考察 精密移取6份0.2mL對照品溶液，按上述方法在波長582nm處測定吸光度。其多糖含量分別為71.13、70.37、71.64、70.88、70.37、71.90mg·g-1，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值為0.90%，表明檢測儀器精密度良好符合試驗要求。

表1 多花黃精外觀、氣味、水提液pH、干物質(zhì)重量Tab.1 Appearance，odor，water extracts pH，dry matter weight of Polygonatum cyrtonema

2.3.6 重復(fù)性考察 精密稱量6份0.25g多花黃精樣品粉末，按照“2.3.2”方法制成樣品溶液，測定吸光度。其多糖提取率分別為7.449%、7.297%、7.362%、7.177%、7.377%、7.444%，計算RSD值為1.39%，表明該測定方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液分別于1、2、3、4、5、6h后測定吸光度。其多糖提取率分別為72.16、71.13、72.67、74.21、74.72、73.69mg·g-1，計算RSD值為1.85%，表明供試品溶液在制備后6h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收考察 取已知含量的多花黃精粉末1.0g，制備成9份供試品溶液，各按照樣品中總多糖含量的80%、100%、120%加入無水葡萄糖對照品，測定吸光度。計算其平均回收率為99.96%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值為0.91%，表明準(zhǔn)確度良好。

2.3.9 九蒸九制多花黃精多糖含量測定結(jié)果 PCH1-9多糖含量分別為11.60%、6.98%、2.99%、3.04%、3.87%、3.40%、2.96%、3.34%、3.99%。

2.4 5-羥甲基糠醛含量變化

2.4.1 色譜條件 色譜柱（Waters XB-C18，250mm×4.6mm，5μm），柱溫為30℃，檢測波長為281nm，流動相為A（乙腈）及B（0.1%甲酸-水溶液），兩相等度（5:95）洗脫，流速為1.0mL·min-1，進(jìn)樣量為10μL，采用UV檢測檢測器。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取5-羥甲基糠醛對照品適量，加甲醇溶解，配成濃度為14.17mg·L-1的母液。采用逐級稀釋的方法，分別得到濃度為0.4427、0.8854、1.771、3.542、7.083、14.17mg·L-1的 對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的制備 取多花黃精粉末約1g（過3號篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入60%乙醇20mL，密塞，稱重，超聲30min，放冷后用60%乙醇補足體質(zhì)量，搖勻后取1.5mL于離心管中，10000轉(zhuǎn)離心10min，將上清液過膜轉(zhuǎn)移至液相瓶中。

2.4.4 線性關(guān)系考察 將“2.4.2”中對照品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀，測得峰面積積分值。以濃度mg·L-1為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程為y=16.456x-5.0144（R2=0.9994），結(jié)果表明5-羥甲基糠醛在0.4427mg·L-1～14.17mg·L-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，符合試驗要求。

2.4.5 精密度考察 取5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，進(jìn)樣6次，每次10μL，測定峰面積并計算RSD為0.82%，表明儀器的精密度良好。

2.4.6 重復(fù)性考察 平行稱取PCH7的多花黃精粉末6份，按“2.4.3”方法制成樣品溶液，精密吸取10μL，在上述色譜條件下進(jìn)行分析，測定峰面積并計算RSD為0.67%，表明可重復(fù)性良好。

2.4.7 穩(wěn)定性考察 取PCH9的供試品溶液10μL分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測定5-羥甲基糠醛的峰面積并計算RSD為0.41%，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8 加樣回收考察 精密稱取已知含量的多花黃精樣品粉末，制備成9份供試品溶液，各按照樣品中5-HMF含量的80%、100%、120%加入5-羥甲基糠醛對照品，測定峰面積。計算其平均回收率為100.49%，RSD為0.98%，表明準(zhǔn)確度良好。

2.4.9 5-羥甲基糠醛含量測定結(jié)果 PCH1-9中5-羥甲基糠醛含量分別為0.00619、0.00714、0.00964、0.0180、0.0602、0.109、0.205、0.214、0.277mg·g-1。 5-HMF標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖（High Performance Liquid Chromatograph，HPLC）見圖2，不同蒸制次數(shù)的多花黃精樣品HPLC色譜圖見圖3。

3 分析與討論

隨著多花黃精蒸制次數(shù)的增加、時間的延長，外觀顏色由淺轉(zhuǎn)深，九蒸九曬的多花黃精呈烏黑色，且微有光澤，質(zhì)堅且柔軟，氣味香甜醇厚，表明炮制過程中多花黃精可能發(fā)生較為復(fù)雜的物理化學(xué)變化。文獻(xiàn)報道美拉德反應(yīng)過程中產(chǎn)生新的有色化合物（如類黑素）[15-16]，多花黃精水提液呈弱酸性，九次蒸制后，水提液pH值由5.81下降為3.72，可能原因是美拉德反應(yīng)會產(chǎn)生的甲酸和乙酸，因此導(dǎo)致水提液酸性增強[17-19]。多花黃精的干物質(zhì)量在第一次蒸制時含量最多，后面趨于平緩，可能是由于第一次蒸制，細(xì)胞吸水膨脹，細(xì)胞壁破裂嚴(yán)重，導(dǎo)致開始析出的物質(zhì)較多，隨后幾次蒸制逐漸趨于平穩(wěn)。多糖大都存在于植物細(xì)胞壁或細(xì)胞內(nèi)部，隨著蒸制時間加長，高溫炮制導(dǎo)致細(xì)胞中核膜和液泡膜的破裂[28]，也可能是由于黃精炮制后的糖類成分和氨基酸多肽蛋白類成分在高溫下發(fā)生了十分復(fù)雜的美拉德反應(yīng)所致[20]。七次蒸制的多花黃精的多糖含量達(dá)13.51%，而隨著繼續(xù)蒸制，多糖易流失，因此七蒸之后的多糖提取率呈下降趨勢[21]。

每一蒸制的多花黃精樣品中都檢測到5-HMF，且隨著蒸制次數(shù)變多，其含量逐漸上升。研究表明，5-羥甲基糠醛具有防治神經(jīng)退行性疾病和抗心肌缺血等作用，但也對黏膜、眼睛、皮膚有刺激性，可與人體蛋白質(zhì)結(jié)合而引起毒性，造成橫紋肌麻痹和內(nèi)臟損害，并且具有神經(jīng)毒性和潛在的遺傳及生殖毒性[22-23]。故通過對九蒸九制過程中5-HMF的含量進(jìn)行測定，可為多花黃精九蒸九制的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

七蒸七制時，多糖含量較高且外觀、氣味、水提液pH與八蒸八制、九蒸九制時基本無異，同時5-HMF含量也相對較高，這為多花黃精九蒸九制的必要性提供了參考，且為多花黃精發(fā)揮最佳功效蒸制次數(shù)試驗提供了新思路。