消瘀泄?jié)犸媽?duì)慢性環(huán)孢素腎病大鼠ACE2-Ang（1-7）-MAS軸相關(guān)組分表達(dá)的影響

魯科達(dá) 張冰冰 石承乾 張培培 葉黎青

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)

環(huán)孢素A現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于腎、肝、心臟、骨髓等實(shí)體器官移植后免疫排斥反應(yīng)及自身免疫性疾病的治療，但其腎毒性成為限制其運(yùn)用的重要原因[1-3]。環(huán)孢素A具有慢性腎小管間質(zhì)毒性，長(zhǎng)期應(yīng)用可引起慢性環(huán)孢素腎?。╟hronic cyclosporine nephropathy，CCN）。研究發(fā)現(xiàn)，CCN的病理特點(diǎn)是腎小動(dòng)脈玻璃樣變性、間質(zhì)纖維化及腎小球硬化，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并破壞抗氧化系統(tǒng)、激活腎素-血管緊張素系統(tǒng) （reninangiotensin systems，RAS）等是CCN進(jìn)展的重要機(jī)制[4-5]。RAS作為人體的重要體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在CCN發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。研究報(bào)道，針對(duì)RAS的主要活性成分血管緊張素Ⅱ（angiotensionⅡ，AngⅡ）進(jìn)行干預(yù)可有效保護(hù)腎臟[5-6]。近年來(lái)逐漸發(fā)現(xiàn)了RAS的新成員，包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）、血管緊張素（1-7）［angiotension（1-7），Ang（1-7）］及Ang（1-7）受體MAS等，ACE2主要作用是將AngⅡ轉(zhuǎn)化為活性物質(zhì)Ang（1-7），與MAS結(jié)合后發(fā)揮拮抗AngⅡ的效應(yīng)，從而延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展[7-8]。消瘀泄?jié)犸嬍侨珖?guó)名老中醫(yī)李學(xué)銘教授的經(jīng)驗(yàn)方，臨床上廣泛用于慢性腎衰竭的治療。既往研究證實(shí)，消瘀泄?jié)犸媽?duì)單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）、5/6腎切除等多種腎間質(zhì)纖維化模型具有良好的抗纖維化效果[9-10]。本研究通過(guò)建立CCN大鼠模型，觀察消瘀泄?jié)犸媽?duì)CCN大鼠ACE2-Ang（1-7）-MAS軸的影響以及相關(guān)的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2017-0005]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心 [實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)碼：SYXK（浙）2018-0012]。所有大鼠均在全封閉SPF狀態(tài)下隔離飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和藥品 消瘀泄?jié)犸嬘缮S芪30g、制大黃10g、川牛膝12g、桃仁12g、地龍12g、車(chē)前草20g組成，以上中藥均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供，濃縮成濃度為0.96g·mL-1的藥液，4℃保存?zhèn)溆茫畸}酸貝那普利片（商品名：洛汀新）由北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)（規(guī)格：10mg/片，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20030514），按照60kg體質(zhì)量計(jì)算，成人用量10mg·d-1，大鼠的用藥量根據(jù)人與大鼠體表面積的轉(zhuǎn)換系數(shù)6.25計(jì)算得出，即大鼠每kg體質(zhì)量的用藥量為成人的6.25倍，得出大鼠用藥量為1mg/（kg·d）；環(huán)孢素A溶液由杭州中美華東制藥有限公司生產(chǎn) （規(guī)格：5g/50mL，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H10930130），以橄欖油配置成濃度為3mg·mL-1的溶液，棕瓶密封后4℃避光保存，大鼠用藥量為25mg/（kg·d）；低鹽飼料購(gòu)于開(kāi)源動(dòng)物飼料（常州）有限公司（批號(hào)：16091902）；ACE2、Ang（1-7）、腎素酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司 （批號(hào)：F3490-B、F9188-A、F2344-B）；ACE2、Ang（1-7）及Ⅳ型膠原（collagenⅣ，ColⅣ）免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司（批號(hào)：G0815、E2912、13707B03）。

1.3 主要儀器 AU640全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)于日本Olympus公司；顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品；Leica彩色病理圖像分析系統(tǒng)購(gòu)于德國(guó)Leica公司；STP12脫水機(jī)、HM335E切片機(jī)及AP280-2包埋機(jī)均為德國(guó)Microm公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組與模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，以隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型組、消瘀泄?jié)犸嫿M和貝那普利組，每組10只?？瞻讓?duì)照組大鼠上午予橄欖油10mL/（kg·d）灌胃，下午予0.9%氯化鈉溶液10mL/（kg·d）灌胃；其他各組上午均予環(huán)孢素A 30mg/（kg·d）灌胃，模型組下午予0.9%氯化鈉溶液10mL/（kg·d）灌胃，貝那普利組下午予貝那普利溶液10mL/（kg·d）灌胃，消瘀泄?jié)犸嫿M下午予消瘀泄?jié)犸?0mL/（kg·d）灌胃。 各組灌胃時(shí)間均為4周。

1.4.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.2.1 各組大鼠一般情況 觀察各組大鼠精神狀態(tài)、進(jìn)食、大小便及體質(zhì)量的變化，同時(shí)觀察記錄死亡情況。

1.4.2.2 腎功能指標(biāo)檢測(cè) 灌胃完成后，各組大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，3 000r/min離心15min后-20℃保存，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。大鼠處死前1d轉(zhuǎn)移至代謝籠，禁食不禁水，至次日8時(shí)收集尿液，記錄24h尿量，并測(cè)定24h尿肌酐水平，計(jì)算肌酐清除率（creatinine clearance rate，Ccr）。

1.4.2.3 腎組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取血后處死大鼠，分離左側(cè)腎臟，取部分腎組織以10%甲醛溶液固定，脫水、石蠟包埋后行2μm切片，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，400倍光鏡下觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)改變；Masson染色后200倍光鏡下觀察腎間質(zhì)纖維化情況。

1.4.2.4 免疫組化檢測(cè)腎組織ACE2、Ang（1-7）及ColⅣ表達(dá) 采用ABC染色法，棕黃色為陽(yáng)性染色區(qū)，每張切片400倍光鏡下隨機(jī)采集5個(gè)不重疊視野，測(cè)量陽(yáng)性染色面積；以德國(guó)Leica彩色病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析，計(jì)算出總光密度=∑陽(yáng)性染色面積（Area）×該部位的平均光密度（Density），以陽(yáng)性染色面積和總光密度為參數(shù)進(jìn)行分析。

1.4.2.5 ELISA法檢測(cè)血清及腎組織ACE2、Ang（1-7）和腎素含量 酶標(biāo)儀于450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（optical density，OD）值，計(jì)算樣品濃度。所有操作依據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，滿(mǎn)足方差齊性則采用LSD-t法；方差不齊則采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，樣本數(shù)不足時(shí)采用Fisher精確檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況和死亡情況觀察 空白對(duì)照組大鼠一般狀況良好，活動(dòng)、精神狀況及飲食無(wú)明顯異常。模型組大鼠飲食減少，大便稀溏，毛發(fā)枯黃，精神萎靡，一般情況較差。消瘀泄?jié)犸嫿M和貝那普利組大鼠毛發(fā)光澤度、精神、飲食情況較模型組有改善。模型組和貝那普利組各死亡4只，消瘀泄?jié)犸嫿M和對(duì)照組各死亡1只，造模動(dòng)物總死亡率25%。

2.2 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠BUN、Scr水平明顯升高（P＜0.01），Ccr水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，消瘀泄?jié)犸嫿M和貝那普利組BUN、Scr水平明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），Ccr水平顯著升高（P＜0.05）；消瘀泄?jié)犸嫿M和貝那普利組腎功能指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)表1。

2.3 各組大鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)觀察

2.3.1 HE染色 空白對(duì)照組腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，腎小管排列無(wú)紊亂，偶有空泡樣變性及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組腎間質(zhì)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小管上皮細(xì)胞變性、壞死；消瘀泄?jié)犸嫿M炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及腎小管上皮細(xì)胞變性程度較模型組減輕；貝那普利組可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管細(xì)胞變性壞死，但均較模型組減輕。見(jiàn)圖1。

2.3.2 Masson染色 空白對(duì)照組無(wú)明顯膠原纖維沉積，結(jié)構(gòu)清晰；模型組結(jié)構(gòu)腎小管空泡樣變性、壞死，膠原纖維沉積；消瘀泄?jié)犸嫿M和貝那普利組病變較模型組明顯減輕。見(jiàn)圖2。

2.4 各組大鼠腎組織免疫組化檢查結(jié)果

2.4.1 各組大鼠腎組織ColⅣ表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，模型組腎組織ColⅣ陽(yáng)性染色面積、總光密度明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，消瘀泄?jié)犸嫿M和貝那普利組腎組織ColⅣ陽(yáng)性染色面積、總光密度明顯降低（P＜0.01）。消瘀泄?jié)犸嫿M和貝那普利組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)表2、圖3。

表1 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較（±s）Tab.1 Comparison of renal function indexes in each group（±s）

表1 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較（±s）Tab.1 Comparison of renal function indexes in each group（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01Note:Compared with blank control group， **P＜0.01； compared with model group， △P＜0.05， △△P＜0.01

組別 n BUN（mmol·L-1） Scr（μmol·L-1） Ccr（mL·min-1）空白對(duì)照組 9 5.92±1.22 55.82±4.33 0.90±0.21模型組 6 62.61±11.84** 190.19±35.12** 0.18±0.04**消瘀泄?jié)犸嫿M 9 38.33±8.93△△ 114.14±40.19△△ 0.33±0.05△貝那普利組 6 47.91±13.33△ 134.41±57.86△△ 0.31±0.06△

表2 各組大鼠腎組織ColⅣ表達(dá)比較（±s，×104）Tab.2 Comparison of ColⅣ expression of renal tissue in each group(±s,×104)

表2 各組大鼠腎組織ColⅣ表達(dá)比較（±s，×104）Tab.2 Comparison of ColⅣ expression of renal tissue in each group(±s,×104)

注：與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01Note:Compared with blank control group,**P＜0.01;compared with model group, △△P＜0.01

組別 n 陽(yáng)性染色面積 總光密度空白對(duì)照組 9 0.30±0.54 0.10±0.18模型組 6 5.83±5.97** 2.22±2.55**消瘀泄?jié)犸嫿M 9 0.33±0.15△△ 0.13±0.08△△貝那普利組 6 0.93±1.25△△ 0.35±0.57△△

2.4.2 各組大鼠腎組織ACE2、Ang（1-7）表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，模型組腎組織ACE2、Ang（1-7）陽(yáng)性染色面積、總光密度均升高（P＜0.01，P＜0.05）。 與模型組比較，消瘀泄?jié)犸嫿M和貝那普利組腎組織中ACE2、Ang（1-7）陽(yáng)性染色面積、總光密度均明顯升高（P＜0.05）。消瘀泄?jié)犸嫿M和貝那普利組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)表3及圖4、5。

2.5 各組大鼠腎組織及血清腎素、ACE2、Ang（1-7）含量比較

2.5.1 各組大鼠腎組織及血清腎素含量比較 與空白對(duì)照組比較，模型組腎組織中腎素含量明顯上升（P＜0.01）；與模型組比較，消瘀泄?jié)犸嫿M和貝那普利組腎組織中腎素含量下降，其中貝那普利組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對(duì)照組比較，模型組血清中腎素含量明顯上升（P＜0.01）；與模型組比較，消瘀泄?jié)犸嫿M和貝那普利組血清腎素含量均明顯下降（P＜0.05）。 見(jiàn)表 4。

2.5.2 各組大鼠腎組織及血清ACE2、Ang（1-7）含量比較 與空白對(duì)照組比較，模型組腎組織中ACE2含量顯著上升（P＜0.05），而Ang（1-7）含量顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，消瘀泄?jié)犸嫿M和貝那普利組腎組織中ACE2、Ang（1-7）含量均明顯上升（P＜0.05）。與空白對(duì)照組比較，模型組血清ACE2、Ang（1-7）含量明顯上升（P＜0.01）；與模型組比較，消瘀泄?jié)犸嫿M和貝那普利組血清ACE2含量下降（P＜0.01），而Ang（1-7）含量上升（P＜0.05）。 見(jiàn)表5。

表3 各組大鼠腎組織ACE2、Ang(1-7)表達(dá)比較（±s，×105）Tab.3 Comparison of ACE2,Ang(1-7)expression of renal tissues in each group(±s, ×105)

表3 各組大鼠腎組織ACE2、Ang(1-7)表達(dá)比較（±s，×105）Tab.3 Comparison of ACE2,Ang(1-7)expression of renal tissues in each group(±s, ×105)

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05,**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05Note:Compared with blank control group,*P＜0.05，**P＜0.01;compared with model group, △P＜0.05

ACE2 Ang(1-7)陽(yáng)性染色面積 總光密度 陽(yáng)性染色面積 總光密度空白對(duì)照組 9 0.93±0.62 0.26±0.13 0.004±0.002 0.001±0.000模型組 6 3.18±0.99** 0.66±0.13* 0.043±0.028** 0.013±0.008**消瘀泄?jié)犸嫿M 9 9.80±3.48△ 1.74±0.55△ 0.351±0.196△ 0.087±0.049△貝那普利組 6 12.19±2.51△ 2.02±0.34△ 0.216±0.065△ 0.049±0.013△組別 n images/BZ_11_1558_1188_1573_1240.png

表4 各組大鼠腎組織及血清中腎素含量比較（±s，ng·L-1）Tab.4 Comparison of renin content of renal tissues and serum in each group(±s,ng·L-1)

表4 各組大鼠腎組織及血清中腎素含量比較（±s，ng·L-1）Tab.4 Comparison of renin content of renal tissues and serum in each group(±s,ng·L-1)

注：與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05Note:Compared with blank control group,**P＜0.01;compared with model group, △P＜0.05

組別 n 腎組織腎素含量 血清腎素含量空白對(duì)照組 9 66.38±4.12 420.65±74.03模型組 6 80.59±3.45** 751.56±103.67**消瘀泄?jié)犸嫿M 9 76.40±3.58 516.78±106.82△貝那普利組 6 73.75±3.31△ 518.34±168.79△

表5 各組大鼠腎組織及血清中ACE2、Ang(1-7)含量比較（±s）Tab.5 Comparison of ACE2 and Ang(1-7)content of renal tissue and serum in each group(±s)

表5 各組大鼠腎組織及血清中ACE2、Ang(1-7)含量比較（±s）Tab.5 Comparison of ACE2 and Ang(1-7)content of renal tissue and serum in each group(±s)

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.05Note:Compared with blank control group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with model group, △P＜0.05, △△P＜0.05

組別空白對(duì)照組n 9腎組織ACE2含量（ng·g-1）7.85±0.71腎組織Ang(1-7)含量（pg·g-1）274.16±14.56血清ACE2含量（ng·mL-1）32.28±10.30血清Ang(1-7)含量（ng·L-1）934.39±188.31模型組 6 10.22±0.93* 196.40±31.53* 62.85±25.95** 1 213.71±298.71**消瘀泄?jié)犸嫿M 9 13.94±1.27△ 225.85±26.68△ 40.18±13.16△△ 1 492.32±268.79△貝那普利組 6 13.01±0.70△ 235.58±22.01△ 37.71±6.68△△ 1 563.92±281.08△

3 討論

環(huán)孢素A是臨床上廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)免疫抑制劑，但長(zhǎng)期使用后容易發(fā)生CCN，從而嚴(yán)重影響腎臟功能。CCN以腎小管毒性損害、腎小動(dòng)脈玻璃樣變性、腎間質(zhì)纖維化及腎小球硬化為主要病理表現(xiàn)[4-5]，其相關(guān)病理機(jī)制尚不明確，但眾多研究指出RAS激活在CCN發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用[5，11-12]。腎素是RAS起始的特異性限速酶，通過(guò)作用于其唯一底物血管緊張素原（angiotensinogen，AGT）而激活RAS，因此可作為體內(nèi)RAS激活的標(biāo)記物[13]。RAS系統(tǒng)激活后隨之產(chǎn)生的核心成分AngⅡ則通過(guò)一系列途徑刺激成纖維細(xì)胞增生，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）生成及在腎間質(zhì)內(nèi)的過(guò)度沉積，加速CCN的進(jìn)展[14]，故拮抗AngⅡ是延緩CCN進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的RAS新成員ACE2能夠?qū)ngⅡ轉(zhuǎn)化為ACE2-Ang（1-7）-MAS軸的主要活性物質(zhì)Ang（1-7），發(fā)揮拮抗AngⅡ的效應(yīng)，從而延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展。因此新的通路與傳統(tǒng)的RAS通路在很多功能上相互拮抗和對(duì)立，影響著腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑 （angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）和血管緊張素受體阻滯劑（angiotensin receptor blocker，ARB）是當(dāng)前臨床上拮抗AngⅡ的兩大類(lèi)主流藥物，抗腎間質(zhì)纖維化作用確切，因此本研究以ACEI類(lèi)藥物貝那普利為陽(yáng)性對(duì)照。ACEI和ARB類(lèi)藥物很多時(shí)候無(wú)法將蛋白尿控制在理想水平，而且在嚴(yán)重腎功能衰竭、高鉀血癥、腎動(dòng)脈狹窄等情況時(shí)禁用，其中ACEI類(lèi)藥物臨床上還存在明顯干咳等不良反應(yīng)，這些不良反應(yīng)以及禁忌證限制了ACEI和ARB的臨床應(yīng)用，因此挖掘療效確切、禁忌證少、不良反應(yīng)輕的新型AngⅡ拮抗劑具有十分重大的意義。中醫(yī)藥防治腎間質(zhì)纖維化近年來(lái)取得了較好的療效，特別是中醫(yī)藥專(zhuān)方專(zhuān)藥的研究和應(yīng)用，充分顯示了中醫(yī)藥在抗腎間質(zhì)纖維化方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

消瘀泄?jié)犸嬍侨珖?guó)名老中醫(yī)李學(xué)銘教授由《醫(yī)林改錯(cuò)》“補(bǔ)陽(yáng)還五湯”化裁而來(lái)的經(jīng)驗(yàn)方。全方由黃芪、川牛膝、桃仁、地龍、制大黃、車(chē)前草組成，以祛瘀泄?jié)釣樘攸c(diǎn)，具有瘀祛絡(luò)通、水行濁泄之效，兼能益氣扶正化瘀、協(xié)同補(bǔ)氣，臨床上廣泛應(yīng)用于慢性腎功能衰竭氣虛夾瘀濁證的治療[15]。本課題組通過(guò)臨床觀察發(fā)現(xiàn)，消瘀泄?jié)犸嬆軌蛎黠@改善慢性腎功能衰竭患者的臨床癥狀，降低BUN、Scr水平，提高Ccr[16]。進(jìn)一步開(kāi)展的一系列基礎(chǔ)研究提示，消瘀泄?jié)犸嬁上抡{(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）表達(dá)，抑制α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 （α-smooth muscle actin，α-SMA）表達(dá)，減輕腎小管間質(zhì)損害，有效延緩UUO大鼠模型腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程；并可調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9） 和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1，TIMP-1）之間的平衡，減少纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、ColⅣ等ECM在腎組織中的沉積，從而能夠保護(hù)5/6腎切除大鼠模型的殘腎功能[9-10，17]。腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟病包括CCN等終末期的共同表現(xiàn)，以大量成纖維細(xì)胞增生和ECM沉積為特征，ColⅣ高表達(dá)則說(shuō)明腎間質(zhì)纖維化加重。本研究構(gòu)建了環(huán)孢素A所致的腎間質(zhì)纖維化模型，從ACE2-Ang（1-7）-MAS軸入手，進(jìn)一步研究消瘀泄?jié)犸媽?duì)延緩CCN腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。

本研究顯示模型組BUN、Scr升高，Ccr下降，腎間質(zhì)纖維化程度增高，證實(shí)了CCN模型成功建立。腎組織病理形態(tài)學(xué)、ColⅣ免疫組化結(jié)果顯示貝那普利、消瘀泄?jié)犸嬀哂辛己每估w維化效果，而貝那普利和消瘀泄?jié)犸嬜饔脽o(wú)明顯差異。既往研究中筆者發(fā)現(xiàn)，在CCN模型中腎組織AngⅡ表達(dá)明顯升高[18]。本研究ELISA法檢測(cè)顯示模型組血清和腎組織腎素含量較空白對(duì)照組明顯升高，證實(shí)CCN中經(jīng)典RAS被激活，而貝那普利、消瘀泄?jié)犸嫿M血清和腎組織腎素含量均較模型組下降，但只有貝那普利組的腎組織和血清腎素含量以及消瘀泄?jié)犸嫿M的血清腎素含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明貝那普利能抑制RAS的激活；消瘀泄?jié)犸嫿M與貝那普利組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此消瘀泄?jié)犸嬆芊褚种芌AS的激活尚有待于證實(shí)。

進(jìn)一步采用免疫組化和ELISA法對(duì)ACE2-Ang（1-7）-MAS軸相關(guān)組分表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，免疫組化結(jié)果提示，與模型組比較，消瘀泄?jié)犸嫿M及貝那普利組腎組織中ACE2、Ang（1-7）表達(dá)均明顯升高，而消瘀泄?jié)犸嫿M及貝那普利組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示貝那普利組和消瘀泄?jié)犸嫿M腎組織ACE2、Ang（1-7）的含量較模型組明顯升高；兩組血清Ang（1-7）的含量較模型組明顯升高，ACE2含量則較模型組明顯下降，而貝那普利組和消瘀泄?jié)犸嫿M以上指標(biāo)的含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上研究結(jié)果表明貝那普利和消瘀泄?jié)犸嬀軌蛏险{(diào)ACE2-Ang（1-7）-MAS軸相關(guān)組分的表達(dá)，而貝那普利組和消瘀泄?jié)犸嫿M血清ACE2的含量較模型組明顯下降，與兩組腎組織ACE2的表達(dá)均升高的結(jié)果并不一致，有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果提示在CCN動(dòng)物模型中，經(jīng)典的RAS被激活，腎組織中ACE2-Ang（1-7）-MAS軸核心活性物質(zhì)Ang（1-7）表達(dá)下降，提示在CCN中該軸受到抑制，消瘀泄?jié)犸嫼拓惸瞧绽芴岣逜ng（1-7）水平，從而減輕CCN腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展，表明中藥消瘀泄?jié)犸嬁烧{(diào)節(jié)ACE2-Ang（1-7）-MAS而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，本研究結(jié)果為中醫(yī)藥防治腎間質(zhì)纖維化提供了新的方向和思路。