高效油脂降解的復(fù)合菌劑構(gòu)建及降解性能優(yōu)化

唐志遠(yuǎn)　王雪玲　劉可星

摘要：為構(gòu)建一種具有高效降解油脂能力的復(fù)合菌劑，以大豆油為唯一碳源，通過(guò)單因素試驗(yàn)，研究接種量、初始pH值、溫度、初始大豆油含量等因素對(duì)復(fù)合菌劑降解油脂性能的影響。結(jié)果表明，以3%的接種量為最佳接種量，復(fù)合菌劑能耐受較大范圍的pH值變化，復(fù)合菌劑降解油脂的最佳溫度為30 ℃，初始含油量為0.10% 時(shí)，油脂降解效率最高。因此，復(fù)合菌劑降解油脂的最佳條件是：接種量為3%、溫度為30 ℃、pH值為7.0、初始含油量為0.1%，在此條件下，油脂降解率為96.43%。

關(guān)鍵詞：復(fù)合菌劑;生物降解;油脂;接種量;含油量;優(yōu)化

中圖分類號(hào)： X703;S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）07-0269-04在我國(guó)居民生活與消費(fèi)水平日益提高的背景下，肉類、牛奶加工業(yè)及餐飲業(yè)快速發(fā)展，但這類產(chǎn)業(yè)引發(fā)的環(huán)境問(wèn)題不容忽視，油性廢水排放是其中較為突出的問(wèn)題。油性廢水的危害主要有直接排放油性廢水會(huì)引發(fā)油脂在水表面上形成一層膜，降低水體的復(fù)氧能力及自凈能力，危害水體生態(tài)環(huán)境[1-2];油性廢水易產(chǎn)生刺激性味道，容易堵塞管道[3];傳統(tǒng)活性污泥法處理含油廢水效果差，主要是由于污泥被油脂包裹，降低了傳質(zhì)效率，進(jìn)而影響對(duì)廢水的處理效果[4-6]。目前，有效解決這一技術(shù)性問(wèn)題的有效途徑是采用除油器將廢水中的大部分油脂分離出來(lái)，進(jìn)行微生物處理。

微生物可將油脂作為碳源與能源物質(zhì)，通過(guò)自身的生長(zhǎng)繁殖消除油脂污染，且利用微生物處理油性廢水具有操作簡(jiǎn)便、成本低和不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)點(diǎn)[7]。相關(guān)研究表明，目前用來(lái)研究微生物處理油性廢水的菌株主要是銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、酵母菌和芽孢桿菌（Bacillus sp.）[8-10]。目前，國(guó)內(nèi)外多采用單一菌株研究微生物降解油性廢水的性能，而關(guān)于復(fù)合菌劑降解油性廢水的研究較少。相關(guān)研究表明，復(fù)合菌劑中的菌株之間具有較好的協(xié)同作用，對(duì)成分復(fù)雜的油脂具有較強(qiáng)的降解能力[11]。本研究以大豆油為唯一碳源，構(gòu)建對(duì)油脂具有較強(qiáng)降解能力的復(fù)合菌劑，并優(yōu)化其降解條件，皆在為復(fù)合菌劑在微生物處理油脂廢水中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

試驗(yàn)用菌種為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、假絲酵母菌（Candida tropicalis）、解朊假絲酵母菌（Candida famata），保藏于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、pH值7.0、蒸餾水1 000 mL，121 ℃下溫?zé)釡缇?0 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、pH值自然、蒸餾水1 000 mL，121 ℃下溫?zé)釡缇?0 min。

降解培養(yǎng)基：（NH4）2SO4 0.2 g、K2HPO4 2.0 g、KH2PO4 2.0 g、NaCl 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、豆油1.0 mL、pH值7.0、蒸餾水1 000 mL，121 ℃下溫?zé)釡缇?0 min。

1.3 種子液培養(yǎng)

分別挑取枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，接種到LB培養(yǎng)基中，分別挑取假絲酵母菌、解阮假絲酵母菌，接種到PDA培養(yǎng)基中，在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)24 h后，各發(fā)酵液中菌種數(shù)量均高于1×107 CFU/mL。

1.4 單一菌種油脂降解能力試驗(yàn)

分別將種子液以1%的接種量接種至降解培養(yǎng)基中，以不加種子液的降解培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min搖床中培養(yǎng)72 h后，測(cè)定油脂濃度并計(jì)算降解率。

1.5 復(fù)合菌劑的構(gòu)建

用平板測(cè)定法測(cè)定上述4種菌株間的拮抗作用[12]。

1.6 優(yōu)化復(fù)合菌劑降解油脂的條件

將“1.3”節(jié)中的4種種子液等比例混合制成復(fù)合菌劑。按以下條件進(jìn)行油脂降解性能優(yōu)化試驗(yàn)：將復(fù)合菌劑按0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、7.0%的接種量接種至降解培養(yǎng)基中，置于30 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)72 h 后，測(cè)定油脂濃度并計(jì)算降解率;將復(fù)合菌劑以最佳接種量接種至初始pH值分別為5、6、7、8、9的降解培養(yǎng)基中，置于溫度為30 ℃、150 r/min 搖床中培養(yǎng)72 h后，測(cè)定油脂濃度并計(jì)算降解率;將復(fù)合菌劑以最佳接種量接種至降解培養(yǎng)基中，分別置于溫度為20、25、30、35、40 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min搖床中培養(yǎng)72 h后，測(cè)定油脂濃度并計(jì)算降解率;將復(fù)合菌劑以最佳接種量接種至具有最佳初始pH值的降解培養(yǎng)基中，分別添加0.01%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%大豆油作為唯一碳源，在最佳培養(yǎng)溫度下150 r/min培養(yǎng)72 h后，測(cè)定油脂濃度并計(jì)算降解率。

1.7 測(cè)定方法

采用紫外分光光度法[13]測(cè)定油脂含量，并計(jì)算油脂降解率。以大豆油為溶質(zhì)，經(jīng)純化的石油醚為溶劑，準(zhǔn)確地配制濃度依次為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)樣品，用紫外分光光度計(jì)，在225 nm處，依次測(cè)定上述系列標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)以下公式計(jì)算油脂降解率。

油脂降解率=（C0-C）/C0×100%。

式中：C0為培養(yǎng)基的原始含油量;C為油脂降解后的培養(yǎng)基含油量。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行處理，采用SPSS 19.0進(jìn)行Duncans多重比較分析，并采用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一菌種油脂降解能力

分別將4個(gè)菌種的種子液接種至降解培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，測(cè)定含油量，計(jì)算油脂降解率。大豆油標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，回歸方程為y=0.442x+0.006，r2=0.999 3。大豆油標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程滿足檢測(cè)要求，因此可定量測(cè)定廢水中油脂的含量。不同菌種間對(duì)大豆油的降解能力有差異（表1）。與對(duì)照（CK）相比， 4個(gè)菌種的油脂降解率達(dá)到顯著性差異水平，降解率均在60%以上，表明4個(gè)菌種均對(duì)大豆油具有降解能力。

2.2 復(fù)合菌劑的構(gòu)建

拮抗試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，4個(gè)菌種間無(wú)明顯拮抗作用。在實(shí)際應(yīng)用中，復(fù)合菌劑的抗干擾能力較強(qiáng)，可以在環(huán)境中形成優(yōu)勢(shì)菌群，提高對(duì)油脂的降解能力。因此本試驗(yàn)利用4個(gè)菌種構(gòu)建復(fù)合菌劑。

2.3 不同接種量對(duì)油脂降解的影響

合適的菌劑投加量，可在節(jié)省資源的同時(shí)，提高對(duì)油脂的降解效率和降解能力。從圖2可以看出， 在一定范圍內(nèi)接種量與油脂的降解率呈顯著性相關(guān)關(guān)系，表明油脂降能力與接種量有關(guān)。在0.5%接種量處理?xiàng)l件下，復(fù)合菌劑降解油脂的效率比較緩慢，隨著接種量的增加，油脂降解率顯著增加，但當(dāng)接種量超過(guò)3%后，油脂降解率沒(méi)有顯著增加。由此可見，最優(yōu)接種量為3%，此時(shí)油脂降解率為81.97%。

2.4 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)油脂降解的影響

微生物的生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境的pH值有一定的要求，偏酸或偏堿都會(huì)對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生影響。不同初始pH值對(duì)復(fù)合菌劑降解油脂的影響見圖3，可以看出，pH值變化對(duì)復(fù)合菌劑降解油脂的能力影響較弱，在不同pH值條件下，復(fù)合菌劑的油脂降解率均在81%～83%之間，且差異較小，表明復(fù)合菌劑能耐受較大范圍的pH值變化，因此降解培養(yǎng)基的初始pH值選擇7.0。

2.5 溫度對(duì)復(fù)合菌劑降解油脂的影響

溫度是影響微生物生長(zhǎng)繁殖的主要因素之一，在合適的條件下，微生物生長(zhǎng)繁殖的速度能夠加快。從圖4可以看出，在不同溫度條件下，復(fù)合菌劑降解油脂的能力具有顯著性差異。當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，復(fù)合菌劑降解油脂的能力最強(qiáng)，油脂降解率為82.57%，表明該溫度是復(fù)合菌劑生長(zhǎng)繁殖的最適溫度，因此選擇最適溫度為30 ℃。

2.6 初始含油量對(duì)復(fù)合菌劑降解油脂的影響

合適的碳氮比能加快微生物的生長(zhǎng)，提高微生物利用碳源的能力。從圖5可以看出，當(dāng)初始含油量高于0.10%時(shí)，油脂降解率出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，表明初始含油量為0.10% 時(shí)，復(fù)合菌劑利用碳源的能力最強(qiáng)，對(duì)應(yīng)油脂降解率為96.43%，因此選擇合適初始含油量為0.10%。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)單一菌種的油脂降解與拮抗試驗(yàn)成功構(gòu)建出一種復(fù)合菌劑，并以大豆油為唯一碳源進(jìn)行單因素試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合菌劑的最佳降解油脂的最佳條件是：接種量為3%、溫度為30 ℃、pH值為7.0、初始含油量為0.10%，在此條件下，油脂降解率為96.43%。

[CM（20]目前，對(duì)油性廢水采用的處理方法主要有物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法和生物方法。微生物菌劑處理是一種高效處理油性廢水的工藝，通過(guò)直接向油性廢水中投加微生物來(lái)降解油脂。油性廢水性質(zhì)復(fù)雜，水質(zhì)變化較大，因此投加的菌劑需要有較強(qiáng)的耐受能力。與單一菌劑相比，投加復(fù)合菌劑在油性廢水中具有更好的優(yōu)勢(shì)。復(fù)合菌劑能夠提高自身的競(jìng)爭(zhēng)力，成為優(yōu)勢(shì)菌群，且可通過(guò)不同微生物的協(xié)調(diào)作用，提高對(duì)油脂的降解能力[14-15]。但油性廢水理化性質(zhì)復(fù)雜，不同環(huán)境條件可對(duì)復(fù)合菌劑降解油脂的能力造成影響。

本研究構(gòu)建的復(fù)合菌劑具有高效的油脂降解能力，在最佳降解條件下培養(yǎng)72 h后油脂降解率高于90%。不同單一菌種降解油脂的能力有較大區(qū)別，游游等篩選得到的菌株，在一定條件下的油脂降解率為87.55%[6]。張印等篩選得到的菌種，在一定條件下對(duì)油脂的降解率僅為68.2%[16]。李文君等篩選得到的菌株JZZ2對(duì)不同類型的油脂表現(xiàn)出不同的降解能力[17]。在污水處理中投加單一菌種具有較大的局限性，而投加復(fù)合菌劑在污水處理中具有更好的處理效果。

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