超高效液相色譜法測定忍冬葉中5種黃酮成分

馬艷妮　李智寧　王韜　王志堯　魏悅　張海艷

摘要：通過超高效液相色譜-二極管陣列檢測法（ultra performance liquid chromatography-diode array detector，簡稱UPLC-DAD）測定忍冬葉中蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素5種黃酮類成分的含量。使用Agilent Elipse plus C18反向色譜柱（4.6 mm 100 mm，3.5 m），用乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）進行梯度洗脫（0～20 min，14%A;20～50 min，14%～17%A;50～60 min，17%～32% A;60～61 min，32%～90%A），流速為0.5 mL/min，進樣體積為4 L，柱溫為30 ℃，檢測波長為350 nm。結(jié)果表明，蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素分別在0.28～27.68、0.43～43.28、0.80～53.27、0.27～27.48、0.16～16.46 μg/mL時與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為97.39%、99.03%、99.19%、98.88%、97.03%，相對標準偏差（RSD）分別為0.96%、0.27%、0.88%、0.64%、1.39%，說明儀器的精密度及方法的重復性均良好，符合定量測定的要求。綜合研究結(jié)果得出，該方法操作簡單、分離效果好、靈敏度高，可為忍冬葉的開發(fā)利用和質(zhì)量控制提供方法學基礎。

關(guān)鍵詞：：忍冬葉;黃酮;超高效液相-二極管陣列檢測法;質(zhì)量控制

中圖分類號：R284文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）07-0226-04

藥用植物忍冬有花（金銀花）、藤（忍冬藤）兩大藥用部位，其中金銀花具有清熱解毒、疏散風熱的功效，忍冬藤具有清熱解毒、疏風通絡的功效。研究發(fā)現(xiàn)，作為非藥用部位的忍冬葉，同樣具有抗菌、抗炎、抗氧化等多種生物活性[1-2]。研究還發(fā)現(xiàn)，忍冬葉中含有有機酸、黃酮和環(huán)烯醚萜苷等多類活性成分[3-4]，并且其綠原酸含量接近金銀花，有時甚至高于金銀花[5];忍冬葉中的黃酮含量則明顯高于金銀花和忍冬藤[6-8]。結(jié)合忍冬葉高產(chǎn)量、低價格的特點[9]來開發(fā)利用忍冬葉具有巨大的經(jīng)濟意義和社會效益。

2015年版《中華人民共和國藥典》中規(guī)定，綠原酸和木犀草苷為金銀花的含量控制指標[10]，可以參照此標準對忍冬葉進行質(zhì)量控制，但是由于指標成分略顯單一，難以全面衡量忍冬葉的質(zhì)量。關(guān)于忍冬葉成分含量檢測的報道較多[11-13]，并且目前的研究已經(jīng)具有同時測定多種活性成分的優(yōu)勢。本試驗首次建立了用超高效液相色譜-二極管陣列檢測法（ultra performance liquid chromatography-diode array detector，簡稱UPLC-DAD）同時測定忍冬葉中蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷及木犀草素5種黃酮類活性成分的檢測方法，以期為忍冬葉的開發(fā)利用和多指標質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器、試劑與材料

1.1.1 儀器 Agilent超高效液相色譜儀（型號6400，配備自動進樣器、四元梯度泵和二極管陣列檢測器）;分析天平（型號為AUW220D），購自SHIMADZU公司。

1.1.2 藥品與試劑 對照品蕓香苷（純度為91.9%，批號為100080-201409），購自中國食品藥品檢定研究院;木犀草苷（純度≥98%，批號為MUST-13060908），購自成都曼斯特生物科技有限公司;野漆樹苷（純度≥98%，批號為wkq916021802）、木犀草素（純度≥98%，批號為wkq916051201）和忍冬苷（純度≥98%，批號為wkq18072701），均購自四川省維克奇生物科技有限公司;甲醇、乙腈、甲酸均為色譜級試劑，購自Thermo Fisher公司。

1.1.3 試驗樣品 6批忍冬葉采自河南省的不同地區(qū)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學陳隨清教授鑒定，這些樣品均為忍冬科忍冬屬忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥葉片，標本存放于河南省科學院天然產(chǎn)物重點實驗室，標本編號依次為150503、170504、170505、170506、170507、170708。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備

1.2.1.1 對照品溶液的制備 分別精確稱取適量蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素對照品，并分別置于5個25 mL棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容，分別制成質(zhì)量濃度為276.80、226.38、532.68、274.79、164.64 μg/mL的對照品儲備液。于4 ℃儲存、備用。

1.2.1.2 供試品溶液的制備 精確稱取約0.15 g忍冬葉粉末，過三號篩，置于25 mL棕色量瓶中，加約24 mL色譜級甲醇，超聲處理1 h，自然冷卻后用甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為Agilent Elipse Plus C18柱（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，14% A;20～50 min，14%～17% A;50～60 min，17%～32% A;60～61 min，32%～90% A），流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為350 nm，進樣體積為4 μL。

1.2.3 方法學考察

1.2.3.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限[14]的考察 精確吸取各2.5 mL蕓香苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素對照品溶液及5 mL木犀草苷對照品溶液，置于25 mL棕色量瓶中，用含量≥99.5%的甲醇溶液溶解，定容，制成蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素質(zhì)量濃度分別為27.68、45.28、53.27、27.48、16.46 μg/mL的混合對照品溶液。分別吸取2、1.6、1.2、0.8、0.4、0.1、0.05、0.02 mL混合對照品溶液置于2 mL棕色量瓶中，用甲醇定容。按照“1.2.2”節(jié)的色譜條件進行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸分析，并計算各對照品的檢出限[信噪比（S/N）=3 ∶1]和定量限（S/N=10 ∶1）。

1.2.3.2 精密度試驗 取適量稀釋后的混合對照品溶液，按照“1.2.2”節(jié)的色譜條件進行檢測，連續(xù)進樣6次，記錄各峰面積。

1.2.3.3 重復性試驗 取任一忍冬葉樣品6份，按照“1.2.1.2”節(jié)的方法制備6份供試品溶液，按照“1.2.2”節(jié)的色譜條件進行檢測，記錄各峰面積。

1.2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取任一忍冬葉的同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48、72 h進樣，記錄各峰面積。

1.2.3.5 加樣回收率試驗 精確稱取9份已知黃酮含量的忍冬葉樣品，隨機分為3組，分別加入高、中、低3個濃度的蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素對照品溶液，先按照“1.2.1.2”節(jié)的方法制備9份供試品溶液，再按照“1.2.2”節(jié)的色譜條件進行檢測，計錄各峰面積，計算回收率及相對標準偏差（RSD）。

1.2.4 樣品測定與數(shù)據(jù)分析 取不同產(chǎn)地或批次的忍冬葉，按照“1.2.1.2”節(jié)的方法分別平行制備3份供試品溶液，按照“1.2.2”節(jié)的色譜條件進行檢測。根據(jù)不同樣品檢測結(jié)果中各個化合物的峰面積，用線性方程計算出所檢測溶液中各個化合物的濃度，再結(jié)合檢測過程中稀釋倍數(shù)等其他因素，最終求得待測樣品中各個化合物的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

依據(jù)“1.2.3.1”節(jié)的不同對照品溶液濃度對檢測結(jié)果進行線性回歸，得到5種待測黃酮化合物的回歸方程，并計算其檢出限與定量限，結(jié)果見表1。

2.2 方法學考察結(jié)果

2.2.1 精密度試驗 通過計算得出，標準品溶液中蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素峰面積的RSD（n=6）分別為1.12%、0.70%、0.78%、0.76%、0.73%，表明儀器的精密度良好，符合定量測定要求。

2.2.2 重復性試驗 取6份忍冬葉170708樣品，制成供試品溶液后進行檢測，計算得出蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素含量分別為406.7、1 475.0、7 060.4、577.6、174.0 μg/g，RSD（n=6）分別為2.89%、1.88%、2.87%、1.15%、2.33%。說明該方法的重復性良好，符合定量測定的要求。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 取忍冬葉170708的同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48、72 h進樣，計算得出， 蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素含量的RSD（n=7）分別為0.98%、1.24%、0.69%、1.20%、0.33%，表明所測5種黃酮成分在72 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗 精確稱取9份已知含量的忍冬葉樣品（忍冬葉170708），隨機分為3組后，在每組中分別加入高、中、低3個濃度的混合對照品溶液，制成9份供試品溶液后進行檢測。由表2可以看出，該檢測方法的準確度較高。

2.3 樣品測定結(jié)果

6份不同產(chǎn)地或批次的忍冬葉的液相色譜結(jié)果見圖1，計算結(jié)果見表3?？梢钥闯?，忍冬葉中這5種黃酮含量差別較大，其中蕓香苷和木犀草素的含量較低，木犀草苷、忍冬苷和野漆樹苷的含量較高，而且不同產(chǎn)地的每種黃酮成分的含量差異也較大。

3 討論與結(jié)論

在對流動相體系進行篩選的過程中[15-16]，筆者先后考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液4種體系，結(jié)果表明，乙腈-0.1%甲酸水溶液體系下的色譜峰分離度較好，基線也較穩(wěn)定。采用二極管陣列檢測器對5個黃酮成分在波長為190～400 nm的范圍內(nèi)進行掃描，發(fā)現(xiàn)蕓香苷分別在256、353 nm處有最大、較大吸收，而木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷、木犀草素依次在347、350、340、350 nm處有最大吸收。分析比較得出，在350 nm波長下得到的色譜峰較好且檢測結(jié)果穩(wěn)定，因此統(tǒng)一選擇350 nm作為檢測波長。對提取溶劑（甲醇、50%甲醇、70%乙醇）的考察結(jié)果表明，用甲醇超聲提取1 h后，待測化合物的色譜峰響應值相對較大。

對忍冬葉中5種黃酮類成分（蕓香苷、木犀草苷、忍冬苷、野漆樹苷和木犀草素）含量的測定結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地或批次的忍冬葉中5種黃酮類成分含量不一。總體來說，木犀草苷和忍冬苷的含量相對較高，蕓香苷和木犀草素的含量相對較低。本檢測方法操作簡單，分離效果好，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可以為忍冬葉的進一步開發(fā)利用及質(zhì)量控制提供試驗依據(jù)。

參考文獻：

[1]馬俊利，商克勇，周艷紅. 忍冬葉總黃酮對四氯化碳致急性肝損傷小鼠的保護作用[J]. 中國實驗方劑學雜志，2012，18（24）：304-307.

[2]馬艷妮，王志堯，郭展展，等. 忍冬葉總黃酮的測定及其體外抗菌活性[J]. 中國實驗方劑學雜志，2017，23（6）：55-59.

[3]陳 玲，張海艷，李 曉，等. 忍冬的化學成分研究進展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，2015，30（1）：108-114.

[4]朱 姮，陳靜嫻，文 蕾，等. 忍冬葉化學成分的研究進展[J]. 山東科學，2016，29（6）：30-39.

[5]郭 玉，陽育聰，劉運美，等. 金銀花及其葉中有效成分的比較研究[J]. 南華大學學報（醫(yī)學版），2008，36（2）：154-157.

[6]石雨荷，謝舒平，王麗君，等. 高效液相色譜法同時測定湖南不同產(chǎn)地金銀花中不同部位綠原酸與木犀草苷含量[J]. 中南藥學，2019，17（4）：552-555.

[7]王 柯，王艷艷，趙東保，等. HPLC法測定金銀花不同部位中木犀草素及其苷的含量[J]. 河南大學學報（自然科學版），2011，41（1）：39-43.

[8][JP3]范 毅，陳 玲，李 曉，等. 不同產(chǎn)地金銀花提取物的指紋圖譜及綠原酸、木犀草苷含量測定[J]. 河南科學，2019，37（1）：53-59.

[9]羅 磊，張冰潔，朱文學，等. 響應面試驗優(yōu)化超聲輔助提取金銀花葉黃酮工藝及其抗氧化活性研究[J]. 食品科學，2016，37（6）：13-19.

[10]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：221.

[11]錢正明，李會軍，李 萍，等. 高效液相色譜法測定忍冬藤和葉中8種活性成分[J]. 分析化學，2007，35（8）：1159-1163.

[12]朱金花，王悠悠，慶偉霞，等. HPLC法同時測定忍冬葉中9種活性成分的研究[J]. 化學研究，2017，28（1）：70-74.

[13]田 偉，范帥帥，甄亞欽，等. UPLC比較金銀花、忍冬藤和忍冬葉中11種活性成分的含量[J]. 中國中藥雜志，2019，44（1）：100-105.

[14]Gao W，Wang R，Li D，et al. Comparison of five Lonicera flowers by simultaneous determination of multi-components with single reference standard method and principal component analysis[J]. Journal of Pharmaceutical Biomedical Analysis，2016，117（1）：345-351.

[15]李 正，吳德玲，趙宏蘇，等. UPLC測定醉魚草不同部位中4種黃酮類成分[J]. 中國實驗方劑學雜志，2017，23（6）：74-77.

[16]Ren M T，Chen J，Song Y，et al. Identification and quantification of 32 bioactive compounds in Lonicera species by high performance liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry[J]. Journal of Pharmaceutical Biomedical Analysis，2008，48（5）：1351-1360.