解淀粉芽孢桿菌TF28對設(shè)施連作黃瓜根際土壤酶活性和微生物的調(diào)節(jié)

胡基華　李晶　張淑梅　陳靜宇　曹旭　孟利強　姜威　劉宇帥

摘要：為研究解淀粉芽孢桿菌TF28對設(shè)施連作黃瓜根際土壤環(huán)境影響，以液體（L）、顆粒（P）和復(fù)合（LP）3種處理與沒有施用TF28的空白對照進(jìn)行對比試驗，測定設(shè)施黃瓜生育指標(biāo)、土壤酶活性及微生物種群數(shù)量。結(jié)果表明，移栽后2～3周后L、P和LP 3種處理株高分別提高18.78%、17.27%、11.88%;L和LP 2種處理對黃瓜根須數(shù)量與空白對照相比分別提高35.20%和48.66%。移栽2～8周，與空白對照相比，P處理對堿性磷酸酶活性、酸性磷酸酶活性高69.43%、77.43%，L處理脲酶活性提高40.99%，LP處理過氧化氫酶活性提高163.24%。與空白對照相比，3種處理都能顯著增加土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量，降低真菌數(shù)量。這說明TF28的添加對連作黃瓜中的酶活性、微生物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)有明顯的調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞：黃瓜;連作障礙;土壤理化性質(zhì);解淀粉芽孢桿菌細(xì)菌;微生物;調(diào)節(jié)作用

中圖分類號： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）07-0152-05

隨著我國設(shè)施農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展，連作障礙越來越突出[1]。黃瓜作為設(shè)施蔬菜主要品種，近年來其連作障礙的發(fā)生機制及其防治措施受到學(xué)者們較廣泛的關(guān)注，已有的研究表明，土壤微生物區(qū)系失衡是黃瓜連作障礙發(fā)生的主要原因之一[2]，且施用有機肥及微生物肥可有效改善土壤微生物生態(tài)環(huán)境，能有效解除作物連作障礙[3]。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）在自然界中分布廣泛，是一類重要的生防資源菌，也是具有較高開發(fā)價值的農(nóng)用微生物[4-6]，在植物病害生物防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景[7]。內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28是從大豆根部分離出的1株內(nèi)生細(xì)菌，具有廣譜抗菌活性[8]，前期研究發(fā)現(xiàn)對番茄具有抗病作用，并對生長具有調(diào)控作用，同時能提高果實品質(zhì)[9]。

筆者對菌株TF28以液體（L）、顆粒（P）和復(fù)合（LP）3種處理方法與空白對照（CK）進(jìn)行對比試驗，研究其對棚室連作黃瓜的生長發(fā)育、土壤菌群和根跡微生態(tài)酶活的變化，找到可以改善棚室連作土壤質(zhì)量和環(huán)境的菌株和方法，從而更有利于設(shè)施農(nóng)業(yè)健康發(fā)展，實現(xiàn)設(shè)施蔬菜生產(chǎn)能力的持續(xù)穩(wěn)定健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌TF28由黑龍江省科學(xué)院微生物研究所黑龍江省生物工程重點實驗室分離保存。本試驗地點在黑龍江省哈爾濱市太平鎮(zhèn)興業(yè)村，于2018年2月23日穴盤育苗，4月5日移載到溫室大棚中;黃瓜品種為“早熟綠神”，種子購于哈爾濱全福種苗有限公司。試驗顆粒為腐殖酸顆粒;細(xì)菌NYD培養(yǎng)基（貨號BS1002）;PDA培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）;放線菌培養(yǎng)基（貨號BS1075）。將解淀粉芽孢桿菌TF28制成濃度為108 CFU/mL的菌懸液，置于4 ℃冰箱中待用。試驗用顆粒劑制備：將菌懸液用噴壺均勻地噴涂在腐殖酸顆粒上，制成含菌量為2億～3億CFU/g的顆粒劑，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

施菌劑方法：（1）液體處理（L），108 CFU/mL菌懸液5 mL澆在苗根部;（2）顆粒劑施肥法（P），移栽時將顆粒劑（2億～3億CFU/g）按5 g/株均勻撒在壟溝，再將瓜苗栽上;（3）復(fù)合施用法（LP），瓜苗移栽時，苗根部均勻放置5 g/株顆粒劑（2億～3億CFU/g），將瓜苗栽上后再澆灌5 mL菌懸液（108 CFU/mL）;以清水處理為空白對照。移植第1周和第2周，隨機選取健壯的黃瓜，對株高、葉面積（根部起測量第5張葉片）、根須數(shù)量、主根長度和根部干質(zhì)量等生育指標(biāo)進(jìn)行測定，3個重復(fù)，每個重復(fù)5株;黃瓜果實在移栽第5周測定，共取樣3次，每次取1空（72株/空）成熟果實，黃瓜移栽至大棚后每周取1次土樣，采用5點取樣法取樣，將每個處理5點的土壤樣品混合為1個重復(fù)，過2 mm篩，-80 ℃ 凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 測定儀器與方法

離心機AIGMA 3-18K（日本）;紫外分光光度計INESA-UV757CRT（青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司），96孔板Costar 3590，石英比色皿0.35 mL（型號為YA1150，Solarbio北京）。葉面積采用葉面積測量儀YMJ-B（浙江托普儀器有限公司）測量;土壤pH值采用FILDSCOUT pH400 Meter 2109儀讀取;堿性磷酸酶（S-AKP/ALP）活性檢測試劑盒Solarbio（貨號BC0285）、土壤酸性磷酸酶（S-ACP）試劑盒Solarbio（貨號BC0145）、土壤脲酶（S-UE）活性檢測試劑盒Solarbio（貨號BC0125）、土壤過氧化氫酶（S-CAT）活性檢測試劑盒Solarbio（貨號BC0105），4種酶活性測定按規(guī)程進(jìn)行操作，其中脲酶活性測試中37 ℃水浴鍋用37 ℃恒溫培養(yǎng)箱代替。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用ANOVA單因素（LSD法）進(jìn)行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 TF28對黃瓜生育指標(biāo)和土壤理化性質(zhì)的調(diào)節(jié)作用

施用TF28菌劑2～3周后對黃瓜的葉片、根部采用5點取樣法進(jìn)行對比，結(jié)果（表1）表明，P、LP、L 3種處理株高與空白對照相比分別提高18.78%、17.27%、11.88%;L和LP 2種處理根須數(shù)量分別高于空白對照35.20%和48.66%;3種處理對葉面積、果實質(zhì)量、根長和根質(zhì)量影響不顯著。

由圖1可見，L處理的pH值為7.35～5.12，移栽后1周最高，7周最低;LP處理的pH值為6.58～5.85，6周最高，5周最低;P處理的pH值6.34～5.23，1周最高，6周最低;CK處理pH值較平穩(wěn)，在6.18～5.23之間，1周最高，5周最低。

2.2 TF28對連作黃瓜土壤酶活性的影響

由圖2-A可見，3種處理對連作黃瓜根際堿性磷酸酶活性具有調(diào)節(jié)作用。在移栽后3周，L、P和LP處理的堿性磷酸酶活性都高于CK，其中L處理與CK差異明顯，提高了23.11%;在移栽后6周，L和LP 2種處理的堿性磷酸酶活性呈下降趨勢，P處理呈上升趨勢，與CK差異明顯，提高35.03%;在移栽后7周，LP處理的堿性磷酸酶活性高于CK 24.19%， [CM（17*2]其他2種處理趨于空白對照。 由圖2-B可見，3種處理酸性磷酸酶活性在移栽后2周均提高，L和CK處理差異明顯，提高14.33%;移栽后3周3種處理都高于空白對照，分別提高41.47%、22.20%和77.43%;移栽后4周3種處理仍高于空白對照，其中L處理明顯高于CK，較CK提高17.91%。由圖2-C 可見，L處理的脲酶活性在移栽后4周明顯高于CK 24.34%。由圖2-D可見，L、LP和P 3種處理過氧化氫酶活性都明顯高于CK，分別提高158.70%、163.24%和138.97%;移栽后6周LP處理明顯高于CK 86.15%;移栽后7周L處理明顯高于CK 102.36%;移栽后8周3種處理都明顯高于CK，分別提高83.20%、91.52%和119.62%。

2.3 菌株TF28對黃瓜根際土壤微生物數(shù)量的影響

施用TF28菌劑的3個處理對棚室連作黃瓜土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌具有調(diào)節(jié)作用，提高細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，降低了真菌的數(shù)量。由表2可見，移栽后L處理的黃瓜根際土壤細(xì)菌數(shù)量從移栽后1～8 周分別比CK增加368.35%、279.21%、256.90%、134.54%、263.43%、90.35%、9.95%和-4.51%;LP處理黃瓜根際土壤細(xì)菌分別比CK增加367.57%、378.22%、357.66%、186.91%、254.73%、17.95%、5.30%、-21.83%;P處理黃瓜根際土壤細(xì)菌分別比CK增加271.07%、355.05%、252.36%、187.22%、237.85%、64.86%、26.32%和-0.58%。

由表3可見，移栽后L處理的黃瓜根際土壤放線菌數(shù)量從移栽后1～8周分別比CK增加125.16%、146.56%、141.14%、123.21%、131.75%、125.79%、69.18%和46.36%;LP處理放線菌數(shù)量分別比CK增加52.20%、78.63%、56.96%、125.00%、89.95%、49.69%、64.15% 和30.46%;P處理放線菌數(shù)量分別比CK增加159.12%、222.90%、223.42%、215.48%、207.41%、251.57%、45.28%和68.87%。

由表4可見，移栽后L處理的黃瓜根際土壤真菌數(shù)量從移栽后1～8周分別比CK降低69.72%、51.52%、46.01%、39.34%、43.41%、35.34%、21.60%和30.29%;LP處理真菌數(shù)量分別比CK降低23.85%、41.21%、47.79%、65.57%、77.52%、81.95%、70.04%、65.14%;P處理真菌數(shù)量分別比CK降低51.38%、70.91%、70.99%、84.43%、72.87%、63.16%、24.80%和23.43%。

3 討論

植物根際是植物與外界環(huán)境交流的主要場所，土壤中微生物的含量與生態(tài)系統(tǒng)功能的發(fā)揮密切相關(guān)，是土壤中有機質(zhì)養(yǎng)分的一種短暫而最有效的貯存形式[10-11]，同時也是土壤肥力水平的活指標(biāo)[12]。內(nèi)生細(xì)菌具有在植物體內(nèi)定殖傳導(dǎo)，不易受外界環(huán)境影響等優(yōu)點，解淀粉芽孢桿菌TF28是廣譜生防菌株，有研究表明接種TF28后能夠提高番茄抗灰霉病能力，番茄葉片防御酶活性及JA（茉莉酸）和SA（水楊酸）含量升高[9]，本試驗對TF28以液體、顆粒劑和復(fù)合3種形式施用，可以提高棚室連作黃瓜苗期株高和根須數(shù)量，顯著提高設(shè)施黃瓜土壤中細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，降低真菌數(shù)量，其中以顆粒形式施用比其他2種處理效果要好。說明TF28可以改善棚室連作黃瓜土壤質(zhì)量和環(huán)境，對土壤具有調(diào)節(jié)作用，利于植株生長發(fā)育，可以抑制由于連作引起的由“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變。已有研究表明，不同作物的根際有其特定的微生物群落，就是同一作物在不同生育時期和營養(yǎng)狀態(tài)下，其根際微生物數(shù)量也呈現(xiàn)一定的動態(tài)變化[13]。微生物數(shù)量及多樣性的增加，作用期較短，這與張昕等研究2株生防菌對黃瓜根圍的環(huán)境生態(tài)效應(yīng)結(jié)果[14]相似，生防菌株的施入對土壤中細(xì)菌的種群數(shù)量有短期影響，但隨著黃瓜生育期的延長，施入生防細(xì)菌土壤的細(xì)菌數(shù)量最終與對照土壤中細(xì)菌數(shù)量持平。其原因可能是土壤本身的微生物生態(tài)環(huán)境有一定的自我恢復(fù)能力，在受到外來因素擾動后，短期內(nèi)出現(xiàn)激烈的變化，但是隨著時間的推移逐步恢復(fù)到原有的水平。

土壤酶是土壤組分中最活躍的有機成分之一[15]，酶活性反映土壤物質(zhì)能量代謝強度[16]。設(shè)施蔬菜連作會導(dǎo)致土壤酶活性降低、微生物群落結(jié)構(gòu)單一化、有害微生物數(shù)量增多[17-21]。土壤磷酸酶活性可以用來評價土壤磷素狀況[18]，磷酸酶酶促作用能加快土壤有機磷的脫磷速度;堿性磷酸酶作為一種適應(yīng)酶，當(dāng)植物缺少磷肥時堿性磷酸酶會增加，其活性會隨著磷素含量的上升而降低[19]。土壤磷酸酶活性與作物的生育期和土壤水分含量、土壤溫度、土壤pH值等多方面因素有關(guān)[20-21]。本研究中3種處理均提高了堿性磷酸酶、酸性磷酸酶。在移栽后8周內(nèi)，所有樣品除了第1周L處理呈堿性，其他樣品都在酸性范圍內(nèi)，酸性磷酸酶活性L處理在第2周最高，為37 407.71 nmol/（g·d），堿性磷酸酶活性P處理在第6周達(dá)到最高值25 684.77 nmol/（g·d），3種處理無論是單個樣品還是8周平均數(shù)值，酸性磷酸酶作為優(yōu)勢酶作用要大于堿性磷酸酶，在苗期酸性磷酸酶呈先升高再降低的趨勢，與戰(zhàn)厚強等的研究結(jié)果[22]相同。脲酶是催化尿素水解的唯一酶，可以將酰胺態(tài)有機氮化物水解轉(zhuǎn)化為植物可直接利用的無機氮的酶，脲酶活性可以反映出土壤供氮水平和能力[23]。本試驗結(jié)果顯示，L、LP處理脲酶活性在苗期移栽后3、4周與對照差異顯著，說明TF28可以改善棚室連作土壤供氮水平。土壤中的過氧化氫酶活性能夠反映土壤中碳、氮物質(zhì)的轉(zhuǎn)化情況[24]。已有研究表明，生物炭的添加對設(shè)施連作黃瓜根域基質(zhì)酶活性和微生物具有調(diào)節(jié)作用[25]。本試驗中L和LP 2種處理的過氧化氫酶活性在移栽后6、7周達(dá)到最高值，說明TF28對碳、氮轉(zhuǎn)化具有促進(jìn)作用。

從移栽后連續(xù)8周對4種酶活性進(jìn)行測試，結(jié)果顯示，酸性磷酸酶活性在移栽后2周出現(xiàn)最高值，脲酶活性在移栽后3、4周出現(xiàn)最高值，堿性磷酸酶活性在移栽后6周出現(xiàn)最高值，過氧化氫酶活性的最高值出現(xiàn)在移栽后7周，4種酶活性達(dá)到最高值的時間有先后順序，依次是酸性磷酸酶、脲酶、堿性磷酸酶和過氧化氫酶，這些活性變化還須要進(jìn)一步研究其代謝功能來驗證說明。3種處理中P處理能明顯提高堿性磷酸酶，L處理能明顯提高酸性磷酸酶、脲酶和過氧化氫酶。

4 結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌TF28對設(shè)施連作黃瓜根際土壤酶活性、微生物含量和pH值具有調(diào)節(jié)作用，3種處理中L和P 2種處理效果明顯，可以提高苗期植株株高、苗期根須數(shù)量以及土壤中的堿性磷酸酶、脲酶和過氧化氫酶活性，酸性磷酸酶是主導(dǎo)磷酸酶。施用TF28可提高土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量，降低真菌數(shù)量。8周連續(xù)采樣結(jié)果顯示，無論是菌群數(shù)量、pH值、4種酶活性都呈波浪狀起伏，說明土壤自身調(diào)節(jié)能力，TF28可以促進(jìn)土壤自身恢復(fù)調(diào)節(jié)。

參考文獻(xiàn)：

[1]吳鳳芝，趙鳳艷，劉元英. 設(shè)施蔬菜連作障礙原因綜合分析與防治措施[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2000，31（3）：241-247.

[2]喻景權(quán)，周 杰. “十二五”我國設(shè)施蔬菜生產(chǎn)和科技進(jìn)展及其展望[J]. 中國蔬菜，2016（9）：18-30.

[3]呂雅悠，于 迪，丁方麗，等. 促植物生長根際細(xì)菌A21-4對田間辣椒生長及根際土壤微生態(tài)環(huán)境的影響[J]. 中國生物防治學(xué)報，2016，32（1）：86-92.

[4]Niazi A，Manzoor S，Bejai S，et al. Complete genome sequence of a plant associated bacterium Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum UCMB5033[J]. Standards in Genomic Sciences，2014，9（3）：718-725.

[5]吳一晶，林藝芬，林河通，等. 生防菌解淀粉芽孢桿菌研究進(jìn)展[J]. 包裝與食品機械，2012，30（6）：49-52.

[6]張龍來，康向輝，魏孝義，等. 1株解淀粉芽孢桿菌HN011抑菌次級代謝產(chǎn)物的分析[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016，37（1）：63-69.

[7]車曉曦，李校堃. 解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的研究進(jìn)展[J]. 北京農(nóng)業(yè)，2010（3）：7-10.

[8]Zhang S M，Sha C Q，Wang Y X，et al. Isolation and characterization of antifungal Endophytic bacteria from soybean[J]. Microbiology，2008，35（10）：1593-1599.

[9]張淑梅，李 晶，姜 威，等. 內(nèi)生細(xì)菌TF28誘導(dǎo)番茄抗病分子機制研究[J]. 中國生物防治學(xué)報，2015，31（6）：913-920.

[10]劉 卉，周清明，黎 娟，等. 生物炭施用量對土壤改良及烤煙生長的影響[J]. 核農(nóng)學(xué)報，2016，30（7）：1411-1419.

[11]魏賽金，黃國強，倪國榮，等. 稻草還田配施腐解菌劑對水稻土壤微生物的影響[J]. 核農(nóng)學(xué)報，2016，30（10）：2026-2032.

[12]Ritz K，Wbeatley R E. Effects of water amendment on basal and substrate induced respiration rates of mineral soils[J]. Biology and Fertility of Soils，1989，8（3）：242-246.

[13]Marcial G C，F(xiàn)agbolaO，Costa R，et al. Dynamics of fungal communities in bulk and maize rhlzosphere soil in the tropics[J]. Applied and Environmental Microbiology，2003，69（7）：3758-3766.

[14]張 昕，張立欽，林海萍，等. 引入黃瓜根圍的株生防菌株的生態(tài)效應(yīng)[J]. 浙江林學(xué)院學(xué)報，2007，24（6）：649-653.

[15]Marx M C，Wood M，Jarvis S. A microplate fluorimetric assay for the study of enzyme diversity in soils[J]. Soil Biology and Biochemistry，2001，33（12/13）：1633-1640.

[16]孫 真，鄭 亮，邱浩斌. 植物根際促生細(xì)菌定殖研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報，2017，33（2）：8-15.

[17]劉 來，黃保健，孫 錦，等. 大棚辣椒連作土壤微生物數(shù)量、酶活性與土壤肥力的關(guān)系[J]. 中國土壤與肥料，2013（2）：5-10.

[18]劉建新. 不同農(nóng)田土壤酶活性與土壤養(yǎng)分相關(guān)關(guān)系研究[J]. 土壤通報，2004，35（4）：523-525.

[19]王 燦，王德建，孫瑞娟，等. 長期不同施肥方式下土壤酶活性與肥力因素的相關(guān)性[J]. 生態(tài)環(huán)境，2008，17（2）：688-692.

[20]李科江，張素芳，賈文竹，等. 半干旱區(qū)長期施肥對作物產(chǎn)量和土壤肥力的影響[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，1999，5（1）：22-26.

[21]Veronicaa A M，Leo C，David S R，et al. Enzyme activities as affected by soil properties and land use in a tropical watershed[J]. Applied Soil Ecology，2007，35（1）：35-45.

[22]戰(zhàn)厚強，顏雙雙，王家睿，等. 水稻秸稈還田對土壤磷酸酶活性及速效磷含量的影響[J]. 作物雜志，2015（2）：78-83.

[23]于天一，逄煥成，唐海明，等. 不同母質(zhì)類型水稻土酶活性及其與理化性質(zhì)的關(guān)系[J]. 土壤學(xué)報，2013，50（5）：1043-1047.

[24]何念祖. 浙江省幾種水稻土的酶活性及其與土壤肥力的關(guān)系[J]. 浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1986，12（1）：43-47.

[25]鄒春嬌，張勇勇，張一鳴，等. 生物炭對設(shè)施連作黃瓜根域基質(zhì)酶活性和微生物的調(diào)節(jié)[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2015，26（6）：1772-1778.