中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)在中性粒細(xì)胞表型哮喘治療中的研究進(jìn)展

姚文靜 萬瀅 李玲義 薛慶亮

哮喘(Asthma)是一種氣道慢性炎癥性肺疾病，其特征是氣道對(duì)過敏原的高反應(yīng)性、可逆性氣流受限、氣道水腫和粘液分泌增加。哮喘根據(jù)誘導(dǎo)痰中浸潤(rùn)的粒細(xì)胞不同，可分為四種不同的表型[1]，分別為嗜酸性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，混合性粒細(xì)胞和少粒粒細(xì)胞表型。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(Neutrophil Extracellular Traps, NETs)是Brinkmann等[2]在2004年首次報(bào)道，當(dāng)機(jī)體受到炎癥刺激時(shí)，中性粒細(xì)胞從血液中遷移到感染部位；它們通過吞噬、脫顆粒、NETs的形成釋放來有效地捕獲、殺滅病原微生物。盡管大多數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞哮喘患者對(duì)糖皮質(zhì)激素敏感[3]，但中性粒細(xì)胞表型哮喘對(duì)糖皮質(zhì)激素療效欠佳。中性粒細(xì)胞表型哮喘的患者氣道中形成了NETs，NETs在中性粒細(xì)胞表型哮喘中可能促進(jìn)了疾病的發(fā)生發(fā)展，對(duì)治療產(chǎn)生一定的影響。本文就針對(duì)NETs在中性粒細(xì)胞表型哮喘治療中的作用進(jìn)行綜述。

NETs的形成、形成過程及降解

一、NETs的形成及結(jié)構(gòu)

NETs的形成被認(rèn)為是宿主防御入侵病原微生物的機(jī)制之一；當(dāng)生物體被感染產(chǎn)生炎癥時(shí)，中性粒細(xì)胞被激活并釋放形成NETs。細(xì)菌感染部位的NETs形成釋放，被認(rèn)為是中性粒細(xì)胞的非經(jīng)典功能。多項(xiàng)研究表明，白介素-8(IL-8)[4]、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[5]、脂多糖(LPS)[6]、佛波酯(PMA)、尿酸單鈉(MSU)晶體、細(xì)胞因子等可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的活化。隨后，活化的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(NOX2)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，這些ROS通過與toll樣受體4(TLR4受體)結(jié)合從而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞核膜的裂變。此外，細(xì)胞內(nèi)中性粒細(xì)胞彈力蛋白酶(NE)、髓過氧化物酶(MPO)通過中性粒細(xì)胞核膜的分裂遷移到細(xì)胞核，它們?cè)诩?xì)胞核內(nèi)降解組蛋白并促進(jìn)染色質(zhì)的去濃縮[7]。并且，肽?；彼崦搧啺访?(PAD4)誘導(dǎo)的組蛋白的瓜氨酸化進(jìn)一步促進(jìn)了染色質(zhì)的去濃縮[8]。有研究報(bào)道鈣結(jié)合可能參與了PAD4的活化，而ROS可能參與調(diào)節(jié)了PAD4的活化[9]。染色質(zhì)去濃縮后，DNA釋放與顆粒狀細(xì)胞質(zhì)和各種蛋白混合，然后主動(dòng)地排出到細(xì)胞外空間，形成了NETs。NETs是由細(xì)胞外的DNA、組蛋白和顆粒蛋白組成[5]，其中DNA為NETs的主要結(jié)構(gòu)，并且顆粒蛋白包括NE、MPO、組織蛋白酶G(CG)、乳鐵蛋白、蛋白酶3(PR3)、溶菌酶和鈣衛(wèi)蛋白等。NETs結(jié)構(gòu)的完整性為其功能提供了基礎(chǔ)。

二、NETs的降解

Farrera 等[10]報(bào)道了單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞能夠有效清除中性粒細(xì)胞擠出的NETs。巨噬細(xì)胞對(duì)NETs的快速清除可以防止產(chǎn)生針對(duì)DNA或NETs其他成分的自身免疫反應(yīng)。巨噬細(xì)胞對(duì)NETs的清除不足可能會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾病。Frese[11]提出DNA酶I(DNase I)存在于血液中，通過降解NETs的主要結(jié)構(gòu)DNA從而預(yù)防狼瘡性腎炎的發(fā)展。DNase I的酶活性取決于陽(yáng)離子環(huán)境，在Mg2+和Ca2+存在的環(huán)境中，該酶可以切割DNA雙螺旋中的單鏈。

NETs的生物學(xué)作用

一、NETs的抗微生物作用

NETs已被證明可捕獲和殺死革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，革蘭氏陰性細(xì)菌，真菌，寄生蟲和原生生物。中性粒細(xì)胞通過釋放NETs來捕獲限制那些因太大難以被吞噬的細(xì)菌如酵母菌和單個(gè)的細(xì)菌[12]。NETs捕獲和殺死病原微生物可能與其組分相關(guān)，其中NE可以通過切割病原微生物的毒力因子并防止其從吞噬溶酶體中逸出來，以此來滅活和殺死病原微生物；組蛋白可以分解病原微生物細(xì)胞膜，并限制微生物的生長(zhǎng)；MPO的活性對(duì)于消滅金黃色葡萄球菌至關(guān)重要[13]，它也可以催化形成具有殺菌作用的次氯酸鹽；鈣衛(wèi)蛋白是胞質(zhì)蛋白S100A家族的成員，它通過螯合二價(jià)金屬離子鋅來抑制真菌的生長(zhǎng)，因?yàn)殇\是真菌生長(zhǎng)所需的陽(yáng)離子[7]；微生物捕獲過程的發(fā)生是通過基于帶正電荷的細(xì)菌表面與帶負(fù)電荷的染色質(zhì)纖維之間的靜電相互作用來完成的[14]。

二、NETs的免疫作用

NETs形成與自身免疫性疾病的相關(guān)性首先在ANCA相關(guān)的血管炎中證實(shí)，隨后在其他自身免疫性疾病中描述，包括銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)[15-16]。NETs中的顆粒蛋白可能是自身抗原的來源，其中包括ANCA相關(guān)血管炎中的MPO，SLE中的dsDNA抗體和RA中的抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(ACPA)[17]。NETs的顆粒蛋白不僅充當(dāng)免疫復(fù)合物形成和自身抗體的靶標(biāo)，而且還進(jìn)一步誘導(dǎo)NETs形成。NETs還可以通過產(chǎn)生I型干擾素和激活補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典途徑和代替途徑來促進(jìn)自身免疫。在銀屑病和SLE中，NETs的細(xì)胞外DNA能夠誘導(dǎo)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)產(chǎn)生干擾素-α(IFN-α)[18]。 pDC是IFN-α的主要生產(chǎn)者，通常是對(duì)入侵病毒做出反應(yīng)的。具有dsDNA核含量的NETs同樣可以通過pDC來誘導(dǎo)IFN-α的產(chǎn)生。然后，IFN-α可以激活先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，特別是誘導(dǎo)Th 1型通路，抑制T細(xì)胞凋亡，激活B細(xì)胞和抗體產(chǎn)生[19]。

三、NETs的不良反應(yīng)

①促進(jìn)痰液粘稠：肺囊性纖維化(CF)患者的痰液含有豐富的NETs，這導(dǎo)致CF患者難以咳出粘稠的痰液。當(dāng)給予CF患者DNase治療時(shí)，CF患者痰液變得稀薄，較易咳出，可能與DNase可以降解NETs中的DNA結(jié)構(gòu)有關(guān)[20]，從而達(dá)到治療CF。②過度反應(yīng)：盡管NETs具有抗微生物的特性，但在某些情況下，NETs的過量存在或無法被DNase降解時(shí)可能對(duì)宿主有害，因此，NETs被認(rèn)為是“先天免疫的雙刃劍” 。NETs的成分，例如細(xì)胞外DNA、組蛋白和NE具有促炎作用，并且會(huì)促進(jìn)疾病發(fā)生與進(jìn)展[21]。③促血栓作用：Fuchs等[22]首次報(bào)道了NETs的促血栓作用。該研究表明，NETs可以捕獲血小板，促進(jìn)其活化和聚集。NETs還被證明可以通過為紅細(xì)胞和促凝血因子提供支架來促進(jìn)凝血酶的形成，例如血管性血友病因子(VWF)、纖維蛋白原、XII因子(FXII)和組織因子(TF)。NETs的組蛋白-DNA主鏈被認(rèn)為可以增加血栓中纖維蛋白支架的穩(wěn)定性[23]。在組蛋白-DNA復(fù)合物存在的情況下，纖維蛋白原凝塊會(huì)導(dǎo)致纖維蛋白的纖維變粗，增加纖維蛋白凝塊的穩(wěn)定性以及顯著延長(zhǎng)凝塊的溶解時(shí)間[24]。

NETs在中性粒細(xì)胞表型哮喘治療中的研究進(jìn)展

一、NETs在中性粒細(xì)胞表型哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用

①直接的炎癥反應(yīng)：有報(bào)告表明[25]，中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞可以在哮喘患者氣道中產(chǎn)生細(xì)胞外DNA誘捕網(wǎng)。并且在患有哮喘的患者支氣管活檢中檢測(cè)到了NETs和嗜酸性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)(EETs)的形成[26]。與非中性粒細(xì)胞人群相比[27]，中性粒細(xì)胞表型哮喘患者的誘導(dǎo)痰中NETs及其組分有所增加，即細(xì)胞外DNA、抗菌肽LL-37和CXC趨化因子配體8(CXCL8)/ IL-8明顯升高。Marrah E通過實(shí)驗(yàn)證明[28]，哮喘患者痰液中的細(xì)胞外DNA與氣道中性粒細(xì)胞炎癥相關(guān)，這與肺功能和哮喘的有效控制呈負(fù)相關(guān)。一項(xiàng)新的研究表明[29]，NETs可以通過破壞氣道上皮并引發(fā)炎癥反應(yīng)，從而加劇中性粒細(xì)胞表型哮喘的嚴(yán)重程度。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞表型哮喘患者的LPS水平升高，表明NETs可能與LPS的存在有關(guān)；此外，IL-8可能是這些氣道發(fā)生NETs的潛在誘因，因?yàn)橄惹霸谄渌芯恐幸呀?jīng)證明它會(huì)誘發(fā)NETs形成[30]。在中性粒細(xì)胞表型哮喘患者的氣道中，活化的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的NETs可能增強(qiáng)對(duì)感染的抵抗。中性粒細(xì)胞表型哮喘患者的肺部中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯。研究表明[31]，中性粒細(xì)胞通過誘導(dǎo)粘液分泌過多和氣道重塑在中性粒細(xì)胞表型哮喘惡化中起著至關(guān)重要的作用，這分別可導(dǎo)致急性可逆性和進(jìn)行性不可逆性氣道阻塞。②免疫損傷：NETs的增加會(huì)加重中性粒細(xì)胞表型哮喘患者的癥狀；在中性粒細(xì)胞表型哮喘患者中，肺泡巨噬細(xì)胞降解NETs的能力受到損害[10]，從而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞表型哮喘持續(xù)存在。以上提示氣道中的NETs促進(jìn)了中性粒細(xì)胞表型哮喘發(fā)生發(fā)展。

二、重組人DNA酶(rhDNase)在哮喘治療中的作用

中性粒細(xì)胞表型哮喘患者通常表現(xiàn)出嚴(yán)重的癥狀[32-33]，對(duì)傳統(tǒng)的糖皮質(zhì)激素治療無反應(yīng)。此外中性粒細(xì)胞表型哮喘患者服用糖皮質(zhì)激素治療后可加劇肺部炎癥，因?yàn)樘瞧べ|(zhì)激素可以延長(zhǎng)中性粒細(xì)胞的生存期[34]。da Cunha通過實(shí)驗(yàn)證明[35]，重組人DNase(rhDNase)可以降解哮喘小鼠模型的細(xì)胞外DNA誘捕網(wǎng)，并降低氣道阻力及改善肺功能。他通過在第0 d和第7 d給予小鼠兩次皮下注射卵清蛋白(OVA)致敏，然后在第14 d，第15 d和第16 d給予OVA鼻內(nèi)攻擊3次。對(duì)照組使用磷酸鹽緩沖液(DPBS)代替OVA，從而建立哮喘小鼠模型，在第15 d和16 d時(shí)，給予OVA攻擊2 h后小鼠接受1 mg/mL的鼻內(nèi)rhDNase；從而得出，鼻涕中的細(xì)胞外DNA在哮喘小鼠模型的下氣道阻塞中起到一定的作用，當(dāng)給予rhDNase治療，可減少細(xì)胞外DNA誘捕網(wǎng)的形成，并顯著的降低下氣道阻力。在個(gè)案報(bào)道[36]，針對(duì)急性嚴(yán)重性哮喘的患者，給予rhDNase和吸入糖皮質(zhì)激素聯(lián)合治療，可以降低痰液的黏稠性，并改善肺通氣。

總結(jié)與展望

NETs是一把“雙刃劍”，既可以起到捕獲病原體、殺菌等作用，也可啟動(dòng)免疫應(yīng)答對(duì)機(jī)體造成損傷。NETs產(chǎn)生過多或降解減少，都可以引起免疫性疾病的發(fā)生和進(jìn)展。然而，目前為止NETs形成及降解的機(jī)制尚不明確，在疾病中的發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。NETs在中性粒細(xì)胞表型哮喘可能促進(jìn)了疾病發(fā)生與進(jìn)展的作用。rhDNase的治療為哮喘的患者帶來了曙光。