血漿結(jié)核分枝桿菌游離DNA檢測對結(jié)核病的診斷價值

韓冰 胡柳楊 姚亞超 曹東林

結(jié)核病(tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性感染性疾病，可危及機(jī)體多個器官、系統(tǒng)。根據(jù)2018年世界衛(wèi)生組織全球結(jié)核病報告，2017年世界新增結(jié)核病例約1000萬例，是全球公共衛(wèi)生面臨的最嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一[1]。然而，目前臨床上常用的診斷技術(shù)中，傳統(tǒng)顯微鏡檢查陽性率低，細(xì)菌培養(yǎng)時效性差，影像學(xué)征象不特異，雖然免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)在診斷靈敏性和檢測速度等方面與經(jīng)典方法相比有了很大改進(jìn)，但依舊存在檢驗結(jié)果難以規(guī)范、適用人群不廣泛等諸多問題[2]。結(jié)核病的“難診斷”和“高發(fā)病”之間形成惡性循環(huán)，限制了世界衛(wèi)生組織提出的“結(jié)束結(jié)核病戰(zhàn)略”的進(jìn)展。為了改善結(jié)核病的診斷現(xiàn)狀，急需研發(fā)一種快速、準(zhǔn)確并具有較高診斷效能的檢測方法。

游離DNA(cell-free DNA, cfDNA)是一種存在于生物體液中無細(xì)胞狀態(tài)的胞外DNA片段，這種游離DNA片段的檢測已經(jīng)在孕婦產(chǎn)前診斷以及腫瘤等惡性疾病的診斷和療效監(jiān)測中取得了長足的進(jìn)展[3-4]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)人體感染某種細(xì)菌、寄生蟲等病原體時可在體液中檢測出相應(yīng)的cfDNA分子，這可能與機(jī)體的免疫保護(hù)反應(yīng)相關(guān)，它在感染性疾病診斷和治療等方面的價值逐漸突顯[5]。已有相關(guān)文獻(xiàn)報道[6-7]，通過PCR技術(shù)可在人體血漿、胸腔積液等多種體液樣本中檢測到血漿結(jié)核分枝桿菌cfDNA并且具有較高的診斷效能，為解決結(jié)核病診斷難題開辟新蹊徑。本研究旨在探討通過實時熒光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, Q-PCR)檢測血漿結(jié)核分枝桿菌cfDNA在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價值。

資料與方法

一、一般資料

選取2018年7月至2019年6月廣東省第二人民醫(yī)院和廣州市胸科醫(yī)院收治的118例結(jié)核病患者作為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料完整，經(jīng)涂片顯微鏡檢查和/或結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性確診，具體診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《結(jié)核病分類WS 196—2017》、《肺結(jié)核診斷 WS 288—2017》[8-9]。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不完整，合并嚴(yán)重的心、肺、肝、腎等重要器官功能障礙。另選取同期收治的61例非結(jié)核其他肺部疾病患者(肺炎48例，支氣管擴(kuò)張伴感染3例，塵肺1例，慢性阻塞性肺疾病4例，肺癌5例)作為對照組。2組研究對象一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，受檢者均已知情同意。

二、標(biāo)本采集

每例受檢者采集上肢靜脈血5mL(EDTA抗凝管)用于血漿結(jié)核分枝桿菌cfDNA提取檢測，同時留取晨痰樣本1mL(無菌容器)用于Xpert檢測。

三、研究方法

1 Xpert 1mL痰液樣本與SR處理液以1 ∶2的比例混合，取2mL充分液化后樣本加入至反應(yīng)盒并置于GeneXpert檢測儀進(jìn)行檢測。

表1 2組研究對象一般臨床資料比較

2 血漿MTB cfDNA提取 5mL靜脈全血經(jīng)4℃，3000 r·min-1離心10min 吸取上層血漿(2～3mL)，轉(zhuǎn)移至新離心管中；4℃，12000 r·min-1再次離心10min后吸取上清(2mL)轉(zhuǎn)移至新管中。按試劑盒操作說明書(QIAamp循環(huán)核酸提取試劑盒)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌cfDNA提取。血液離體6 h內(nèi)完成提取，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

3 熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 含10×Buffer 2.5 μL，2.5 mMdNTP 2.5 μL，1.5 mmoL/L MgCl20.4 μL，引物1和引物2各0.8 μL，探針1和探針2各0.4 μL，5U/μLTaq酶0.2 μL，模板DNA 2.5 μL，ddH2O 12.9 μL。以結(jié)核分枝桿菌特異性插入序列IS6110為靶基因設(shè)計引物，雙探針標(biāo)記方式均為：熒光基團(tuán)FAM-淬滅基團(tuán)MGB(見表2)。反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min 預(yù)變性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s擴(kuò)增反應(yīng)，在60 ℃收集熒光信號，40個循環(huán)；50 ℃ 35 s 冷卻。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行核酸序列測定。

表2 引物及探針信息

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測診斷結(jié)核病的ROC曲線分析

血漿結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測診斷結(jié)核病的ROC曲線下面積(area under the curve, AUG)為0.884，約登指數(shù)為74.80，cut-off值為38.69，以ct值<38.69判定為陽性，反之為陰性。靈敏性特、異性分別為：79.70%、95.10%。

圖1 cfDNA檢測診斷結(jié)核病的ROC曲線

二、結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測與T-SPOT.TB、Xpert檢測對結(jié)核病的總體檢測情況

血漿結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測對結(jié)核病患者的診斷靈敏性高于Xpert檢測(χ2=35.155,P<0.05)，與T-SPOT.TB檢測相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=31.288,P>0.05)；診斷特異性高于T-SPOT.TB檢測(χ2=2.191,P<0.05)，與Xpert檢測相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=39.977,P>0.05)(見表3)。

三、結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測與T-SPOT.TB、Xpert檢測對各組結(jié)核病患者的陽性檢出率

血漿結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測、T-SPOT.TB、Xpert檢測對肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者的陽性檢出率分別為：79.75% (63/79)和79.48% (31/39)，83.54% (66/79)和76.92% (30/39)，69.62% (55/79)和43.59% (17/39)。結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測對肺結(jié)核和肺外結(jié)核的陽性檢出率均高于Xpert檢測(P<0.05)；與T-SPOT.TB檢測相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表4)。

表3 3種診斷方法對結(jié)核病的總體檢測情況比較

注.aP<0.05：cfDNA檢測與Xpert檢測比較，bP>0.05：cfDNA檢測與T-SPOT.TB檢測比較，cP<0.05：cfDNA檢測與T-SPOT.TB檢測比較，dP>0.05：cfDNA檢測與Xpert檢測比較

表4 3種診斷方法對肺結(jié)核/肺外結(jié)核患者陽性檢出率比較

討 論

我國作為結(jié)核病流行的重災(zāi)區(qū)，早期發(fā)現(xiàn)和治療干預(yù)可以極大的減輕社會負(fù)擔(dān)，針對當(dāng)前不論是傳統(tǒng)的實驗室檢查方法，還是新興的免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測技術(shù)，均不能完全滿足臨床需求的現(xiàn)狀，急需研發(fā)診斷效能更好的新技術(shù)。cfDNA作為一種潛在生物標(biāo)志物在結(jié)核病診斷和治療中的價值得到業(yè)界的廣泛關(guān)注。Fernández-Carballo等[10]對6項有關(guān)血、尿樣本中結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測的研究進(jìn)行系統(tǒng)性回顧，發(fā)現(xiàn)這種方法用于結(jié)核病診斷的靈敏性約80%，特異性可高達(dá)100%。另外，當(dāng)前在分子生物學(xué)診斷中大多檢測痰液中結(jié)核分枝桿菌基因組核酸，無呼吸系統(tǒng)損害的肺外結(jié)核或嬰幼兒、HIV感染等可疑肺結(jié)核患者痰液診斷效能很低，相較而言，無需進(jìn)行液化等前處理的血漿樣本將是一種有吸引力的樣本類型。Santos等[11]利用Q-PCR技術(shù)能夠有效檢測到肺外結(jié)核患者血、尿、胸腹水等肺外體液中的結(jié)核分枝桿菌cfDNA，而且聯(lián)合檢測血、尿樣本可獲得更高的陽性檢出率。本研究基于結(jié)核分枝桿菌特異性插入序列IS6110設(shè)計特異性引物，采用可以相互補(bǔ)充的雙探針標(biāo)記來進(jìn)一步提高檢測靈敏度，通過Q-PCR技術(shù)分別檢測結(jié)核病患者和非結(jié)核對照組患者血漿中結(jié)核分枝桿菌cfDNA，與新興的免疫學(xué)和分子生物學(xué)診斷方法對比分析，探討cfDNA在結(jié)核病早期診斷中的臨床應(yīng)用價值。

本研究中179例受檢者均接受了血漿結(jié)核分枝桿菌cfDNA測定，診斷靈敏性和特異性分別為79.70%和95.10%，對結(jié)核病具有重要的診斷價值。受檢者中有9例確診血行播散型肺結(jié)核患者，其中僅5例患者血漿結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測陽性，并非所有血行播散型肺結(jié)核病例均可在血液樣本中檢測到結(jié)核分枝桿菌核酸，說明檢測到的游離DNA片段并非來源于播散到血液循環(huán)中的菌體基因組DNA。這些都為通過Q-PCR檢測血漿結(jié)核分枝桿菌cfDNA實現(xiàn)結(jié)核病診斷提供了有力的支持。

同樣作為分子生物學(xué)診斷技術(shù)的Xpert和結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測對肺結(jié)核患者的陽性檢出率差異并不顯著，但結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測對肺外結(jié)核患者的陽性檢出率明顯高于Xpert檢測，約為后者的2倍。本研究中存在22例臨床確診肺外結(jié)核患者的Xpert檢測為陰性，其中14例患者可在其血漿樣本中檢測到結(jié)核分枝桿菌cfDNA(檢測結(jié)果經(jīng)核酸測序進(jìn)一步驗證)，或許可以彌補(bǔ)Xpert在肺外結(jié)核診斷中的不足。這與機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后免疫系統(tǒng)分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子發(fā)生免疫應(yīng)答密切相關(guān)，病原體遭到破壞后釋放的結(jié)核分枝桿菌cfDNA可隨宿主循環(huán)到達(dá)各處，游離在血漿、尿液、胸腔積液等體液樣本中的小DNA片段含量遠(yuǎn)高于基因組DNA[12]，極大的提高了結(jié)核分枝桿菌的檢出率，未發(fā)生菌血癥的肺外結(jié)核患者同樣能在血液中檢測到結(jié)核分枝桿菌cfDNA，為肺外結(jié)核的快速有效診斷提供新方法。游離DNA片段相較于基因組DNA具有不穩(wěn)定性，很快被降解清除[13]，因此檢測到的結(jié)核分枝桿菌cfDNA很可能最近才被釋放到患者體內(nèi)，更能夠反映受檢者目前的疾病狀況。然而，正是由于cfDNA的不穩(wěn)定性極大的增加了其檢測難度，研究組內(nèi)10例T-SPOT.TB檢測陽性的確診結(jié)核病患者血漿中并未檢測到相應(yīng)的病原體cfDNA。而結(jié)核感染后體內(nèi)可長期存在抗原特異性的記憶性T細(xì)胞，T-SPOT.TB根據(jù)這些淋巴細(xì)胞受刺激分泌的干擾素來判斷感染，診斷靈敏性更高，是目前臨床最常用的免疫學(xué)篩查方法之一[14]。但Kang等[15]研究數(shù)據(jù)表明，這種免疫學(xué)診斷技術(shù)的檢測結(jié)果受到免疫抑制、營養(yǎng)不良、年齡、吸煙等多種因素的影響，特異性明顯降低，本研究中僅為40.98%。并且有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB與其他免疫學(xué)方法對潛伏性結(jié)核的檢出情況具有不一致性[16]，在結(jié)核病流行地區(qū)進(jìn)行篩查時應(yīng)對T-SPOT.TB結(jié)果作進(jìn)一步確證檢查。因此，cfDNA檢測與臨床常用免疫學(xué)和(或)分子生物學(xué)技術(shù)相比對結(jié)核病具有更高的診斷效能。

實驗中還有一個值得關(guān)注的重點，在3例臨床確診非結(jié)核受檢者血漿樣本中也檢測到結(jié)核分枝桿菌cfDNA，潛伏性感染可能是導(dǎo)致這種現(xiàn)象出現(xiàn)的重要因素。潛伏性結(jié)核是一種對結(jié)核分枝桿菌抗原刺激的持續(xù)免疫應(yīng)答狀態(tài)，而沒有臨床表現(xiàn)為活動性結(jié)核病的證據(jù)。據(jù)估計[17]，全球約有30%的人口感染了結(jié)核分枝桿菌，但僅有10%的感染者患上了活動性結(jié)核病，90%仍處于潛伏期。然而，大多數(shù)衛(wèi)生工作者缺乏對相關(guān)風(fēng)險群體進(jìn)行潛伏性結(jié)核檢測和治療重要性的認(rèn)識，導(dǎo)致其治療覆蓋率很低。結(jié)核分枝桿菌不易直接進(jìn)入機(jī)體循環(huán)，cfDNA這類小分子片段可能會比細(xì)菌本身更有效地引發(fā)免疫反應(yīng)。觀察T-SPOT.TB檢測結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，3例結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測陽性的臨床確診非結(jié)核受檢者T-SPOT.TB檢測也為陽性，并經(jīng)測序證實。因此，在非結(jié)核受檢者血漿中檢測到結(jié)核分枝桿菌cfDNA并非一定為“假陽性”，應(yīng)進(jìn)一步隨訪明確是否存在潛伏性感染。已有研究證實[18]，及時服用異煙肼治療潛伏性感染可以明顯降低發(fā)展為活動性結(jié)核的風(fēng)險，若血漿結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測能為潛伏性結(jié)核的診斷提供可靠依據(jù)，將有利于阻斷其進(jìn)一步發(fā)展。

本項研究也存在一定的局限性。實驗結(jié)果顯示并非所有確診結(jié)核病例血漿中均可檢出結(jié)核分枝桿菌cfDNA，并且有2例Xpert檢測陽性的肺結(jié)核患者血漿中未檢測到結(jié)核分枝桿菌cfDNA，這與血漿中cfDNA的濃度密切相關(guān)。有學(xué)者根據(jù)當(dāng)前結(jié)核分枝桿菌cfDNA檢測的相關(guān)研究指出，基于核酸擴(kuò)增的測定中檢測限，應(yīng)為10拷貝/μL，即至少需要收集5mL體液樣本才能實現(xiàn)cfDNA的檢出[10]。更大容量的樣本可以進(jìn)一步改善cfDNA的檢出情況，用9mL血液樣本提取檢測結(jié)核分枝桿菌cfDNA的敏感性(71%)顯著高于2mL提取方案(33%)[19]。另外，實驗中血液采集、儲存和運(yùn)輸?shù)雀鱾€環(huán)節(jié)操作不當(dāng)均可導(dǎo)致不穩(wěn)定的cfDNA降解，背景DNA的釋放也會影響檢測結(jié)果。血漿中結(jié)核分枝桿菌cfDNA濃度范圍評價應(yīng)成為這種新型診斷技術(shù)未來研究的重要目標(biāo)，這不僅是診斷的關(guān)鍵，對療效監(jiān)測也有重要價值。

綜上所述，通過Q-PCR技術(shù)檢測血漿結(jié)核分枝桿菌cfDNA在結(jié)核病診斷中具有靈敏便捷、適用寬度廣泛等多種優(yōu)勢，可顯著提高結(jié)核病的診斷靈敏性，滿足臨床上早診斷、早治療的需求，也為肺外結(jié)核以及兒童、HIV感染者等特殊群體中的可疑肺結(jié)核患者帶來福音。雖然結(jié)核分枝桿菌cfDNA作為結(jié)核病的潛在生物標(biāo)志物目前仍處于研究階段，我們有理由相信通過優(yōu)化特異性引物設(shè)計、cfDNA提取方式以及血液采集和保存條件等一定能夠開創(chuàng)結(jié)核病快速診斷的新局面。