雙氫青蒿素對急性肺損傷大鼠炎癥機制的研究

張楊 王榮麗

急性肺損傷是指各種肺內(nèi)外因素導(dǎo)致的肺部嚴重并發(fā)癥，其病理生理改變?yōu)椋簢乐氐难装Y反應(yīng)、肺泡-毛細血管屏障損傷、氧化應(yīng)激、異常活化的凝血等，使肺組織損傷及水腫，導(dǎo)致動脈氧合不足，出現(xiàn)低氧血癥。臨床上病人表現(xiàn)為進行性的呼吸困難，甚至呼吸窘迫。ALI是導(dǎo)致急性呼吸衰竭甚至多器官功能衰竭的主要原因[1]。多種全身或局部因素可誘發(fā)AL,如膿毒癥、肺炎、嚴重創(chuàng)傷等，其中細菌性肺炎是臨床上常見的誘因。研究表明細菌性肺炎和繼之而來的ALI/ARDS(急性呼吸窘迫綜合征)是重癥患者發(fā)病和死亡的主要原因[2]；近年來，隨著細菌分離株中抗生素耐藥性的發(fā)生率迅速增加。找到新的輔助方法改善的ALI/ARDS愈后，顯得尤為重要。

肺泡巨噬細胞是肺部防御機制的第一道防線，被認為可能是 ALI 的啟動因子，研究已證明，巨噬細胞在不同微環(huán)境刺激下可以發(fā)揮抗炎或促炎兩種截然不同的作用，其機制是通過干預(yù)巨噬細胞的極化：經(jīng)典活化型巨噬細胞(M1)和替代活化型巨噬細胞(M2)的失衡實現(xiàn)的。其中M1主要發(fā)揮炎癥作用；而M2主要促進炎癥的轉(zhuǎn)歸。如2型糖尿病患者體內(nèi)存在M1/M2的失衡，促炎型M1細胞明顯增加, 在糖尿病大血管并發(fā)癥和糖尿病腎病患者中這種失衡更明顯[3]。

青蒿素及其衍生物有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤的作用[4-6]，雙氫青蒿素可調(diào)控炎癥因子的表達，發(fā)揮抗炎作用。但目前尚無研究報道雙氫青蒿素影響急性肺損傷中巨噬細胞的極化。本實驗將通過大腸桿菌誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型，來探討雙氫青蒿素抗炎及對ALI時巨噬細胞極化的影響。

材 料

一、菌株

大腸桿菌ATCC25922由西南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗科提供；實驗前使用麥氏比濁法將細菌濃度調(diào)整為3×108cfu/mL備用。

二、試劑

TNF-α、VEGF、IL-10 Elisa試劑盒(96t 酶聯(lián)生物)；Trizol(天根公司)，雙氫青蒿素(純度≥98% 805D021)、RPMI1640培養(yǎng)基(北京索萊寶公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司)；SYBR Green PCR 試劑盒(KAPA Biosystem公司)。

三、儀器

干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司)；-80°冰箱(日本sanyo公司)，37℃恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；550型酶標儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)；臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn) )；熒光定量PCR擴增儀(CFX-Connect96 美國伯樂公司)。

四、實驗動物

SD大鼠由成都達碩實驗動物有限公司提供(批號：scxk(川)2015-030)，體重180～220g。飼養(yǎng)在西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～25℃，室內(nèi)空氣濕度50%～60%，白天和黑夜各12 h，獨自攝食、飲水。

方法和結(jié)果

一、模型制備及取材參考文獻

40只雄性SD大鼠編號1～40，由SPSS軟件生成隨機數(shù)列分為五組大腸桿菌組(E-coli)、對照組(Control)、雙氫青蒿素低劑量組(low 5 mg·kg-1)、雙氫青蒿素中劑量組(Medium 15 mg·kg-1)、雙氫青蒿素高劑量組(High 25 mg·kg-1)。每組8只；大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)6 d后，雙氫青蒿素采用植物油溶解，雙氫青蒿素低、中、高劑量組分別予以對于劑量雙氫青蒿素連續(xù)灌胃3 d，1天2次[7-9],大腸桿菌組和對照組予以同等劑量生理鹽水灌胃；最后一次灌胃處理后1 h，腹腔水合氯醛麻醉大鼠，直視下大腸桿菌組、雙氫青蒿素低、中、高劑量組分別于氣管內(nèi)滴入大腸桿菌0.5mL (3×108)造模[10-11]。造模后24 h，水合氯醛麻醉大鼠,腹主動脈取血，常溫下靜置30min，4℃，3000 r·min-1離心10 min，取血清-80℃保存；開胸取右肺中葉、右下肺葉，分別行蘇木精-伊紅(HE)染色、肺濕干質(zhì)量比；結(jié)扎斷端，暴露、游離氣管，行肺泡灌洗：22G留置針插入主支氣管，抬高大鼠頭部，3mLPBS分三次灌入，回收率約60%；灌洗液放置無酶EP管內(nèi)，4℃2500rmp離心10 min收集上清于-80°冰箱保存；細胞沉渣用RMP1640重懸、洗滌細胞，離心，去上清，加入1mL Trizol,-80℃保存。

二、肺組織病理評分

右肺中葉取出后立即放入4%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、包埋切片，HE染色，光鏡下觀察病理損傷情況。肺臟組織病理評分參照smith評分系統(tǒng)[12]。對肺水腫、肺泡及間質(zhì)炎癥、肺泡及間質(zhì)出血、肺實變形成，分別進行0～4分的半定量分析：無損傷0分，病變范圍<25%為 1 分，病變范圍占 25%～50%為2分，50%～75%為3分，病變滿視野為4 分，肺損傷評分為上述各項之和。

三、肺濕干質(zhì)量比(W/D)

取出大鼠右肺下葉，稱濕質(zhì)量后置于烤箱(60℃24 h)烤到恒定質(zhì)量，稱干質(zhì)量，W/D計算公式：濕重/濕重-干重。

四、ELisa法測肺泡灌洗液及血清中TNF-α、VEGF、IL-10

將-80℃存儲的肺泡灌洗液、血清，按照試劑盒操作方法測肺泡灌洗液及血清中TNF-α、VEGF、IL-10的濃度。

五、RT-PCR 法檢測大鼠肺泡灌洗巨噬細胞Arg-1、iNOS、IL-1ra、IL-1β的mRNA表達

從-80℃冰箱中取出含trizol的大鼠肺泡巨噬細胞，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板用SYBR Green PCR試劑盒進行熒光定量PCR擴增。通過分析儀器讀取CT值，用2-ΔΔCT分析基因的相對表達量，以β-actin 為內(nèi)參。引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成(見表1)。

表1 Arg1、iNOS、IL-1ra、IL-1β引物序列

六、統(tǒng)計學(xué)分析

七、結(jié)果

1 各組大鼠肺組織HE染色及病理評分

Contol組肺泡結(jié)構(gòu)完整，未見明顯病理改變；E-coli組可見肺泡結(jié)構(gòu)破壞；肺間隔明顯增寬，肺間質(zhì)水腫、出血，肺內(nèi)大量炎癥細胞的浸潤；雙氫青蒿素Low組可見肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺間隔明顯增寬，間質(zhì)水腫，肺內(nèi)炎癥細胞浸潤；Medium組肺泡結(jié)構(gòu)破壞，可見間隔增寬，水腫及炎癥細胞浸潤程度減輕；High組肺泡結(jié)構(gòu)破壞，間隔增寬，水腫及炎癥細胞浸潤明顯減輕。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色(×10)

A：E-coli組； B：Control組；C：Low組(5 mg·kg-1)；D：Medium組( 15 mg·kg-1)；E ：High組(25 mg·kg-1)

2 各組大鼠肺組織病理評分 Simth評分評估大鼠肺組織病理損傷：其中與Control組比較，E-coli組的肺組織評分明顯升高(P<0.05)；DHA灌胃治療，與E-coli組比較，Low、Medium、High組肺組織Smith評分降低，其中Medium、High組smith評分明顯降低(P<0.05)；提示雙氫青蒿素可減輕大腸桿菌造成的肺組織損傷(見表2)。

表2 各組大鼠肺組織Smith評分

vsE-coli#P<0.05，vscontrol*P<0.05

3 肺組織濕干質(zhì)量(W/D)比 肺W/D比主要反應(yīng)肺組織水腫情況，其中E-coli組肺組織W/D比較Control組明顯升高(P<0.05)，雙氫青蒿素Low、Medium、High組治療可減輕ALI 大鼠的 W/D 比，其中Medium、High組smith評分比E-coli明顯降低(P<0.05)(見表3)。

表3 各組大鼠肺組織W/D

vsE-coli；#P<0.05，vscontrol*P<0.05

4 血清及支氣管肺泡灌洗液TNF-α、VEGF、IL-10濃度 Elisa試劑盒檢測各組血清、BALF中細胞因子：其中與Control組比較，E-coli組灌洗液、血清中TNF-α、VEGF濃度明顯升高(P<0.05)，灌洗液、血清中IL-10濃度明顯降低(P<0.05)；DHA治療后，與E-coli組比較，Low、Medium、High組大鼠灌洗液中TNF-α、VEGF濃度明顯降低(P<0.05)；IL-10的濃度明顯升高(P<0.05)(見表4、5)

表4 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、VEGF、IL-10的濃度

vsE-coli#P<0.05vscontrol*P<0.05

表5 各組大鼠血清中TNF-α、VEGF、IL-10的濃度濃度

vsE-coli#P<0.05vscontrol*P<0.05

5 大鼠支氣管肺泡灌洗液巨噬細胞Arg1、iNOS 、IL-1ra、IL-1βmRNA表達情況 PCR檢測支氣管肺泡灌洗液中巨噬細胞表型：其中與Control組比較，E-coli組大鼠巨噬細胞Arg1、IL-1ra mRNA表達減弱，iNOS 、IL-1β mRNA表達增強(P<0.05)，巨噬細胞表型以M1為主；與E-coli組比較，Medium、High組DHA灌胃后Arg1、IL-1ra mRNA表達增強，Low組僅Arg1表達增強，而Low、Medium、High iNOS、IL-1β mRNA表達均減弱(P<0.05)，巨噬細胞表型以M2為主(見圖2、3)。

圖2 各組大鼠支氣管肺泡巨噬細胞iNOS、Arg-1amRNA表達情況

vsE-coli#P<0.05vscontrol*P<0.05

圖3 各組大鼠支氣管肺泡巨噬細胞IL-1β、IL-1ramRNA表達情況

vsE-coli#P<0.05vscontrol*P<0.05

討 論

ALI/ARDS是一類嚴重的肺部并發(fā)癥，其病情危重，死亡率高，造成沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。誘導(dǎo)ALI的方式有很多，LPS是誘導(dǎo)ALI/ARDS最常見的方法，但內(nèi)毒素并不完全等同于細菌所致的ALI，采用大腸桿菌能更好的模擬細菌性肺炎所致ALI的生理病理過程，更符合臨床實際，同時大腸桿菌也常常作為誘導(dǎo)實驗性ALI的替代物[13-14]。本實驗采用直視下氣管內(nèi)滴入大腸桿菌方法成功誘導(dǎo)急性肺損傷模型，大鼠表現(xiàn)出精神萎靡、打噴嚏、呼吸急促。光鏡下病理切片可見肺泡結(jié)構(gòu)破環(huán)、肺間質(zhì)增寬、間質(zhì)水腫、大量炎癥細胞浸潤。Smith評分幾乎能涵蓋ALI肺臟病理損傷的全部表現(xiàn)，可半定量評估肺的炎癥程度[15].模型大鼠病理切片顯示Smith評分明顯升高。肺水腫是ALI重要病理改變。評估肺水腫最簡單且最重要的的方法是W/D比。而VEGF是另一種有效評估肺水腫的炎癥因子。因為VEGF能夠?qū)Ψ闻菝氀苣さ纳掀ず蛢?nèi)皮均產(chǎn)生影響，其對血管通透性的誘導(dǎo)作用是組胺的20000倍[16]。在將VEGF156腺病毒輸送至大鼠肺內(nèi)的研究中，大鼠呈現(xiàn)出非心源性肺水腫、肺組織毛細血管通透性增加、肺W/D比增加[17]，表明VEGF參與ALI肺水腫過程。本實驗同時采用W/D比及VEGF濃度評估肺水腫，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌誘導(dǎo)大鼠肺組織W/D比及VEGF都呈不同程度的升高，其升高趨勢是一致的。

青蒿素作為傳統(tǒng)中藥，除了抗瘧疾作用外，還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等特點[4,17-18]。青蒿素可以減少炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、黏附因子的表達，抑制中性粒細胞的浸潤等，發(fā)揮抗炎作用[5-6]。雙氫青蒿素(DHA)作為青蒿素衍生物中的一種，它不僅具備青蒿素的所有藥理特點，同時它的副作用更小，藥效更高。隨著雙氫青蒿素研究的深入，發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素可抑制NF-κB通路而抗炎[19]；在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中，雙氫青蒿素可以抑制纖維增生[6]；在LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞炎癥中，雙氫青蒿素可以抑制iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA的表達[20]。本實驗中，雙氫青蒿素減輕大腸桿菌所致急性肺損傷的smith評分，呈劑量依賴性。DHA同樣減輕大腸桿菌所致急性肺損傷的W/D。目前研究針對DHA對VEGF的作用機制主要是抗腫瘤：DHA通過抑制VEGF的表達及腫瘤血管的形成誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡[17-18]；針對DHA對ALI中炎癥所致VEGF的調(diào)節(jié)，尚未有報道。本實驗對各組大鼠肺組織及血清中VEGF進行檢測，發(fā)現(xiàn)DHA同樣減輕急性肺損傷大鼠體內(nèi)的VEFG濃度，說明，DHA可以降低大腸桿菌誘導(dǎo)的急性肺損傷中VEGF。DHA通過減輕W/D比及VEGF來減輕肺水腫。但具體的機制還需要進一步研究。

炎癥細胞在ALI的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用，既往認為中性粒細胞是ALI中最重要的細胞。但隨著研究進展，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞的在ALI的發(fā)生發(fā)展亦中起著舉足輕重的作用。肺巨噬細胞被認為是肺部防御的第一道防線，是ALI的啟動因素。肺巨噬細胞并非為單一的活化形式，據(jù)其所處微環(huán)境及其中細胞因子、生長因子，TLRs，信號通路(NF-κB、STATs、AP-1等)等不同，巨噬細胞可以極化為不同的表型[21]：經(jīng)典活化型：M1和替代活化型：M2。M1/M2動態(tài)變化，反映機體免疫狀態(tài)，其極化方向在疾病的抗感染免疫和抗炎癥反應(yīng)的病理生理過程中發(fā)揮重要作用，甚至直接影響疾病的結(jié)果。其中M1作用的延長或放大，M2防御的缺陷被認為是ALI發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵所在[21]。內(nèi)毒素和INF-γ可使巨噬細胞極化為M1，在本實驗中大腸桿菌細胞壁上的脂多糖就起著極化M1的作用；M1主要表面標記物有：iNOS、IL-6、MHC-II。活化的M1吞噬病原體、凋亡細胞，釋放促炎因子TNFα、(IL)-1β、IL-6、 IL-12、 IL-15、 IL-23, 產(chǎn)生ROS、RNS、蛋白水解酶及生物活性脂，參與機體的炎癥應(yīng)答[21]。在博來霉素、油酸、內(nèi)毒素、二氧化硅誘導(dǎo)的急性肺損傷中，抗炎類固醇阻斷M1的促炎活性，可以減輕肺組織損傷[22-23]，可見過分活化的M1會導(dǎo)致肺組織損傷，發(fā)生ALI。但M1的生物活性作用可以被M2平衡。IL-4、IL-13可使肺巨噬細胞極化為M2。其主要表面標記物有：FIZZ1、 Arg1。M2主要發(fā)揮抗炎、組織修復(fù)及免疫調(diào)節(jié)作用, 通過增強抗炎因子IL-10、IL-1ra、IL-13及VEGF、EGF、PDGF表達，促進組織修復(fù)、重塑、血管生成，并保持穩(wěn)態(tài)[21,24]。研究發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細胞通過分泌抗炎因子IL-4、IL-10等在病毒性心肌炎、急性腎炎等的發(fā)病過程中起到了保護作用[25]；而暴露于吸煙、博來霉素、內(nèi)毒素下的動物，肺組織中M2細胞數(shù)量增加，它們上調(diào)炎癥因子IL-4、IL-10、IL-13的表達，這些因子介導(dǎo)和刺激細胞外基質(zhì)、生長因子的產(chǎn)生，促進組織的修復(fù)[22,26-27]。提示肺損傷的轉(zhuǎn)歸則很大程度上是由M2介導(dǎo)的。不過在急性肺損傷的早期，肺組織中巨噬細胞以M1為主[21]，細胞形態(tài)學(xué)改變及誘導(dǎo)iNOS及TNF-α的表達可以佐證。M2總是遲于M1的出現(xiàn)，如果可早期刺激M2的表達，逆轉(zhuǎn)M1/M2失衡，則可以減輕M1的作用，避免疾病的加重。結(jié)合上述雙氫青蒿素可以抑制炎癥通路，下調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-1β等的表達，猜測雙氫青蒿素可能改變巨噬細胞所處微環(huán)境，從而影響巨噬細胞的極化。為此，本實驗將iNOS作為M1的表面標志物，IL-1β為M1的炎癥因子，血清及灌洗液TNF-α作為促炎因子；Arg1作為M2的表面標志物，IL-1ra為M2的炎癥因子，血清及灌洗液中IL-10作為抑炎因子。發(fā)現(xiàn)與Control組比較，E-coli組大鼠巨噬細胞表型以iNOS為主，IL-1β水平明顯升高，血清及灌洗液中炎癥因子以TNF-α為主；即ALI中巨噬細胞表型以M1為主。與E-coli組，雙氫青蒿素治療后，大鼠肺泡巨噬細胞表型以Arg1為主，IL-1ra水平明顯升高，血清及灌洗液中炎癥因子以IL-10為主。雙氫青蒿素治療改變了巨噬細胞的表型，使巨噬細胞表型向著促進疾病轉(zhuǎn)歸的方向發(fā)展。這可能與DHA的抗炎機制改變了ALI大鼠體內(nèi)的炎癥水平及微環(huán)境有關(guān)。但雙氫青蒿素具體通過那種信號通路改變了巨噬細胞的極化，還需要進一步的研究來證明。

綜上，本實驗結(jié)果表明:1)、雙氫青蒿素灌胃治療可以減輕急性肺損傷炎癥；2)、雙氫青蒿素影響肺泡巨噬細胞的極化；雙氫青蒿素可能成為治療急性肺損傷的一種新方法。