殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉豚草提取物微膠囊的制備

包 穎，蘇景波

(1.吉林省林業(yè)技術(shù)推廣站，吉林 長春 130022；2.洮南市國有林總場，吉林 白城 137100)

微膠囊化 (Microencapsulation) 是將固體、液體或氣體物質(zhì)包覆起來，以天然或高分子材料作為囊壁，將作為囊芯的活性物質(zhì)包裹起來，形成具有半透性或密封性囊膜粒子的過程。微膠囊化后可避免囊芯物質(zhì)因外界環(huán)境的影響而失去活性。微膠囊的常用制備方法有物理法(噴霧干燥法、包合法、超臨界流體法、噴霧冷卻法、空氣懸浮法和擠壓法等)，化學(xué)法(界面聚合法、原位聚合法)，物理化學(xué)法(相分離法、干燥浴法)[1]。

豚草(Ambrosiaartemisiifolia)是一種分布廣泛的一年生雜草， Chen， K. W， Demers， I，Gentili， R.等調(diào)查研究表明，豚草起源于北美，至今，豚草在全球許多國家和地區(qū)都有發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)階段許多研究發(fā)現(xiàn)豚草花粉是世界許多地區(qū)致敏花粉的重要來源之一，在夏末和秋末能夠引起過敏反應(yīng)，在美國和歐洲一些國家已經(jīng)很普遍。氣候變化、城市化以及長途運(yùn)輸增加了豚草種子傳播的可能性，因此，豚草在非入侵地區(qū)變得越來越普遍，進(jìn)而增加了致敏率[2-4]。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)11種豚草過敏原，目前很多豚草的相關(guān)研究都是如何對其進(jìn)行防治，有學(xué)者對2013—2015年在羅馬尼亞西北和羅馬尼亞中部豚草花粉引起的過敏性鼻炎患者進(jìn)行記錄，結(jié)果表明，豚草花粉的強(qiáng)烈致敏性與眼睛和哮喘相關(guān)癥狀有關(guān)聯(lián)。Bousquet， J.等在豚草花粉傳播季節(jié)，對美國和歐盟國家與豚草花粉過敏相關(guān)的谷歌術(shù)語進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在調(diào)查的11個(gè)國家中，有8個(gè)在春季和夏季出現(xiàn)了“豚草” “花粉”“花粉癥”和“過敏”等相關(guān)詢問[5，6]。Case， M. J.等報(bào)道了氣候變化對豚草分布的影響，顯示佛羅里達(dá)州中部，阿巴拉契亞山脈南部和弗吉尼亞東北部的豚草有減少趨勢，并且在其當(dāng)前分布的北部邊緣，特別是在美國東北部，潛在擴(kuò)張的區(qū)域顯著增加，到2070年可能有所緩和，這意味著豚草可能對氣候變化敏感。由于豚草對健康的影響，文中建議當(dāng)?shù)氐碾s草控制委員會擴(kuò)展監(jiān)測范圍，并增加根除工作[7]。近幾年，有研究表明豚草提取物具有低毒性，可作為植物源農(nóng)藥用于生物防治[8-15]。

殼聚糖是唯一具有氨基的天然多糖，由甲殼素的脫乙?；@得，甲殼素廣泛存在于自然界，是β(1，4)-2-組成的線性天然聚合物氨基-2-脫氧-D-葡聚糖和β(1，4)-2-乙酰氨基-2-de-氧-D-葡聚糖。Aman， R. M.等將殼聚糖、瓜爾膠和阿拉伯膠等混合生物聚合物的水凝膠基質(zhì)制成納米乳液，基于納米乳劑的納米纖維可以作為局部給藥系統(tǒng)，有效地治療炎性疾病，取代具有不良作用的非甾體類藥劑，可將其引入植物藥領(lǐng)域[16]。Esmaeili， H.等發(fā)現(xiàn)用殼聚糖和乳清蛋白薄膜納米囊封后的大蒜精油，可延長冷藏真空包裝的保質(zhì)期[17]。Andonegi， M.等研究表明，殼聚糖/膠原蛋白薄膜的開發(fā)和表征證實(shí)，這些薄膜在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有適用性[18]。Asadzadeh， H.等使用分子動(dòng)力學(xué)模擬確定典型的抗菌肽與殼聚糖和聚乙二醇聚合物的相互作用，進(jìn)而確定合適的載體改善肽藥物遞送系統(tǒng)[19]。Ashassi-Sorkhabi， H.等對用于鋼合金的殼聚糖基抑制劑體系進(jìn)行論述，研究表明殼聚糖在各種腐蝕性介質(zhì)中具有有效保護(hù)金屬的作用，具有消除腐蝕性的功能[20]。Augustine， R.等發(fā)現(xiàn)殼聚糖生物聚合物可用于制備亞微米纖維膜，具有細(xì)胞外基質(zhì)的模擬性能、滲出液吸收性能、生物相容性、抗菌活性和生物可降解性，基于負(fù)載生物活性劑的殼聚糖的電紡膜可在傷口愈合應(yīng)用中發(fā)揮重要作用[21]。Zhang， Z. L等通過噴霧干燥法制備了基于殼聚糖的釋放微球，將殼聚糖用作載體材料，三七、黨參和白術(shù)提取物為活性物質(zhì)，通過單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了微球的噴霧干燥制備工藝。噴霧干燥法制備的殼聚糖基藥物微球的制備過程簡單、穩(wěn)定，制備的微球在體外顯示出緩釋作用[22]。

木質(zhì)素磺酸鈉是一種大分子表面活性劑，Vainio， U. Qiu， X.等研究表明，木質(zhì)素磺酸鈉可廣泛用于各種工業(yè)領(lǐng)域中的界面添加劑[23，24]。Lou， H.等使用木質(zhì)素磺酸鹽作為穩(wěn)定劑合成硒納米顆粒[25]。Wang， X.等使用具有生物相容性的殼聚糖和木質(zhì)素磺酸鈉作為外殼材料，通過層層自組裝方法配制除草劑微膠囊，結(jié)果表明，基于聚電解質(zhì)生物聚合物的多層微膠囊可以實(shí)現(xiàn)控制釋放和光穩(wěn)定特性[26]。

由于植物源農(nóng)藥易受外界環(huán)境影響而失活，因此，在使用時(shí)應(yīng)對其進(jìn)行保護(hù)處理，殼聚糖和木質(zhì)素磺酸鈉兩種材料性質(zhì)穩(wěn)定，可用于滲透性材料使用，本文嘗試采用物理化學(xué)法—相分離法—水相分離法—復(fù)合凝聚法，以豚草作為囊芯材料，殼聚糖和木質(zhì)素磺酸鈉作為囊壁材料制備殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉豚草提取物微膠囊劑，并對其進(jìn)行檢驗(yàn)。

1試驗(yàn)材料和儀器

豚草采自黑龍江省牡丹江市，殼聚糖，木質(zhì)素磺酸鈉，吐溫80，乙醇，戊二醛，冰乙酸，丙酮，氫氧化鈉，去離子水，以上藥品和材料均來自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司或?qū)嶒?yàn)室自制。

電子天平，超聲波儀，循環(huán)水式多用真空泵，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，磁力攪拌器，離心機(jī)，掃描電子顯微鏡，傅立葉變換紅外光譜系統(tǒng)，紫外分光光度儀，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

2 試驗(yàn)方法

2.1 豚草提取物的制備

采摘豚草植株洗凈晾干，粉碎。取豚草干粉與乙醇溶液混合，超聲波儀處理后抽濾，棄去粉末，將上層溶液蒸發(fā)，回收有機(jī)溶劑，保存余下油狀物質(zhì)，避光低溫保存。

2.2 殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉-豚草提取物微膠囊的制備

將豚草提取物與乙醇溶液混合，低速攪拌，制成豚草提取物懸浮液。

殼聚糖-豚草提取物溶液的配制：將殼聚糖溶于醋酸溶液，攪拌。將豚草提取物懸浮液與殼聚糖溶液混合，慢慢滴入乳化劑。

微膠囊懸浮液的配制：將木質(zhì)素磺酸鈉溶液攪拌后倒入殼聚糖-豚草提取物懸浮液中，邊倒邊攪拌，調(diào)節(jié)體系pH，加去離子水，繼續(xù)反應(yīng)一段時(shí)間后加入固化劑，調(diào)節(jié)體系pH，固化后，離心處理，取上清液，加丙酮溶液離心處理并抽濾，得到微膠囊粉末，室溫下保存。

2.3 檢測方法

2.3.1 微膠囊外部形態(tài)特征

將制備好的微膠囊粉末進(jìn)行噴金處理，利用電鏡掃描觀察外部形態(tài)特征。

2.3.2 微膠囊的紅外光譜分析

利用傅立葉變換紅外光譜系統(tǒng)對殼聚糖、木質(zhì)素磺酸鈉、豚草提取物及殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉-豚草提取物微膠囊進(jìn)行紅外表征分析。紅外光譜表征是檢驗(yàn)微膠囊是否成功包覆的重要試驗(yàn)過程，首先要掌握每種物質(zhì)紅外光譜吸收峰所代表的化學(xué)鍵和變化趨勢，根據(jù)不同成分所含化學(xué)物質(zhì)和基團(tuán)分析光譜變化規(guī)律，進(jìn)而確定囊芯材料和囊壁材料是否結(jié)合，可以判斷囊芯材料是否成功包埋，紅外光譜表征分析的關(guān)鍵是查閱資料找出成分里所含起主要作用的物質(zhì)和其對應(yīng)的峰值，囊芯材料和囊壁材料必須分別與制備好的殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉豚草提取物微膠囊光譜進(jìn)行對比，分析重要吸收峰的變化，從而確定試驗(yàn)反應(yīng)情況。

微膠囊的紅外光譜分析是微膠囊性能測定的基礎(chǔ)，只有驗(yàn)證囊芯材料已成功包覆于囊壁材料后，再進(jìn)行粒徑分析、熱重分析、緩釋試驗(yàn)、室內(nèi)毒力測定和田間生物防治試驗(yàn)才具有現(xiàn)實(shí)意義，紅外光譜分析是進(jìn)一步研究的核心環(huán)節(jié)和前提條件。

2.3.3 豚草提取物微膠囊化的效率和有效載量

取實(shí)驗(yàn)室已制好的一定量的豚草提取物質(zhì)，分別配制成0.5 %、1.0 %、1.5 %、2.0 %和2.5 %五個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液，選擇乙醇溶液作為空白對照，使用紫外分光光度計(jì)，在660 nm波長條件下測其各自的吸光度，繪制吸光值曲線，并得出方程。將制備完成的殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉豚草提取物微膠囊懸浮液進(jìn)行離心處理后，取其上清液1 mL，稀釋，取含有游離未被包覆的豚草提取物的上清液適量于比色皿中，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測定，重復(fù)3次。

微膠囊的效率(A.E.)和有效載量(L.C.)計(jì)算公式如下：

A.E.( %) =(1-W2/W1) ×100 %

L.C.( %)=〔(W1-W2)/W3〕×100 %

式中：W1為芯材總質(zhì)量；W2為微膠囊表面未被包覆的芯材總質(zhì)量；W3為微膠囊粉末的質(zhì)量。

3 結(jié)果與分析

3.1 形態(tài)特征

利用電子掃描顯微鏡觀察外部形態(tài)特征，如圖1所示。

從圖1中可以看出，殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉豚草提取物微膠囊分布有序，大小均勻，形態(tài)規(guī)則，大部分成圓形，極少部分成橢圓形，整體雜質(zhì)較少，基本包覆完全。

圖1微膠囊外部形態(tài)

Fig.1 The external shape of the microcapsule

3.2 紅外光譜表征

殼聚糖的紅外光譜圖如圖2所示。

圖2殼聚糖的紅外光譜

Fig.2 Infrared spectrum of chitosan

從圖2中可以看出，3 359 cm-1處是締合-NH2和-OH伸縮振動(dòng)吸收峰，而-OH和-NH2伸展一般在3 200～3 700 cm-1出現(xiàn)，由于含有的氫鍵在殼聚糖分子里起作用，形成氫鍵的-OH伸展峰，從而鍵強(qiáng)減弱，因此，羥基的伸縮振動(dòng)峰向低頻3 200～3 550 cm-1處移動(dòng)，在3 285 cm-1處出現(xiàn)，峰形肥寬[27]。2 923 cm-1處和1 649 cm-1處分別對應(yīng)的是-CH的伸縮振動(dòng)吸收峰和酞胺基伸縮振動(dòng)吸收峰，1 588 cm-1和1 421 cm-1是-NH2的彎曲振動(dòng)吸收峰和-CH2的彎曲振動(dòng)吸收峰，1 370 cm-1和1 149 cm-1對應(yīng)-CH-NH2的伸縮振動(dòng)吸收峰和醚鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 066 cm-1和1 043 cm-1分別對應(yīng)的是-CO彎曲振動(dòng)吸收峰[28-31]。

豚草提取物的紅外光譜圖如圖3所示。

圖3豚草提取物的紅外光譜

Fig.3 Infrared spectrum of ragweed extract

從圖3中可以看出，在1 729 cm-1處的吸收峰為不飽和五元內(nèi)酯環(huán)，1 620 cm-1處的吸收峰為共軛雙鍵。在1 453 cm-1附近處有一芳環(huán)的伸展峰，在900～1 200 cm-1之間1 034 cm-1處有一酚類化合物的γ(C-O) 峰。這一系列主要吸收峰為豚草內(nèi)倍半萜內(nèi)酯的主要基團(tuán)[27]。

殼聚糖、木質(zhì)素磺酸鈉和殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉豚草提取物微膠囊的紅外光譜表征分析如圖4所示。

注：A 為殼聚糖；E為木質(zhì)素磺酸鈉；F為殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉豚草提取物微膠囊。

圖4殼聚糖、木質(zhì)素磺酸鈉和殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉豚草提取物微膠囊的紅外光譜

Fig.4 Infrared spectra of chitosan， sodium lignosulfonate and chitosan/sodium lignosulfonate ragweed extract microcapsules

從圖4中可以看出，殼聚糖的紅外光譜圖中1 588 cm-1處對應(yīng)-NH2的彎曲振動(dòng)吸收峰，1 370 cm-1處對應(yīng)-CH-NH2伸縮振動(dòng)吸收峰，兩者都在殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉豚草提取物微膠囊的紅外光譜圖中減弱。這是由于囊皮材料間彼此的鍵合作用，殼聚糖分子與木質(zhì)素磺酸鈉在溶液里進(jìn)行復(fù)凝聚反應(yīng)，形成囊壁凝聚物。

豚草提取物和殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉豚草提取物微膠囊的紅外光譜如圖5所示。

注：D為豚草提取物；F為殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉豚草提取物微膠囊。

圖5豚草提取物和殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉豚草提取物微膠囊的紅外光譜

Fig.5 Infrared spectrum of ragweed extract and chitosan/sodium lignosulfonate ragweed extract microcapsules

從圖5中可以看出，在1 729 cm-1處的吸收峰為不飽和五元內(nèi)酯環(huán)，1 620 cm-1處的吸收峰為共軛雙鍵。光譜D豚草提取物在1 729 cm-1處峰強(qiáng)，光譜F殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉豚草提取物微膠囊在1 729 cm-1處吸收峰變?nèi)踔料?，說明藥品被包覆在微膠囊中。同樣，藥品被包覆于微膠囊后光譜F中1 620 cm-1處吸收峰與光譜D相比，在很大程度上變?nèi)?，光譜D中在1 453 cm-1附近處有一芳環(huán)的伸展峰，在900～1 200 cm-1之間1 034 cm-1處有一酚類化合物的γ(C-O) 峰。光譜F中1 453 cm-1附近處和900～1 200 cm-1之間1 034 cm-1處也有幾乎相同的芳環(huán)伸展峰和酚基γ(C-O) 峰。這些主要吸收峰顯示的基團(tuán)為豚草內(nèi)倍半萜內(nèi)酯的主要基團(tuán)。因此，說明豚草提取物質(zhì)被成功包覆于囊壁材料殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉[27]。

從上述分析可知，在各物質(zhì)的紅外光譜中均可以很清晰地看出主要化學(xué)物質(zhì)的吸收峰，當(dāng)囊皮材料殼聚糖和木質(zhì)素磺酸鈉產(chǎn)生凝聚反應(yīng)后，殼聚糖的紅外光譜圖中1 588cm-1處和1 370 cm-1處分別對應(yīng)的是-NH2的彎曲振動(dòng)吸收峰和-CH-NH2的伸縮振動(dòng)吸收峰明顯減弱，說明殼聚糖和木質(zhì)素磺酸鈉反應(yīng)完全，正負(fù)電荷相互吸引，產(chǎn)生復(fù)凝聚反應(yīng)，形成微膠囊囊皮結(jié)構(gòu)。光譜圖中能夠顯示豚草倍半萜內(nèi)酯的主要基團(tuán)的吸收峰在殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉豚草提取物微膠囊光譜圖中明顯減弱，說明豚草提取物質(zhì)被成功包埋，因此，紅外光譜圖可以同時(shí)成功驗(yàn)證囊皮材料反應(yīng)程度和微膠囊包覆情況。

3.3 效率和有效載量

根據(jù)豚草提取物微膠囊化的效率和有效載量計(jì)算方法，制備的殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉豚草提取物微膠囊的效率和有效載量均達(dá)到80 %以上。

4結(jié)論

試驗(yàn)制備的殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉豚草提取物微膠囊分布有序，大小均勻，形態(tài)規(guī)則，大部分成圓形，極少部分成橢圓形，整體雜質(zhì)較少，基本包覆完全。紅外光譜顯示豚草提取物質(zhì)被成功包覆于囊壁材料殼聚糖/木質(zhì)素磺酸鈉。效率和有效載量均達(dá)到80 %以上。