EphB/EphrinB信號(hào)通路對(duì)成骨分化能力的影響

劉軍 李旭升 甄平 田琦 周勝虎 王偉 李玉娟 何曉樂(lè)

1. 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)940醫(yī)院(原蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院)全軍骨科中心， 甘肅 蘭州 730050 2. 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)940醫(yī)院(原蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院)手麻科， 甘肅 蘭州 730050 3. 空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院老年病科，陜西 西安 710032

國(guó)內(nèi)外研究表明，EphB/EphrinB雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可在破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞之間發(fā)揮重要作用，而其中EphB4/EphrinB2雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在解決相同位置上骨吸收轉(zhuǎn)向骨形成的有序性問(wèn)題中的影響尤為關(guān)鍵。EphB4/EphrinB2信號(hào)通路可以接觸依賴性的方式存在于成熟破骨細(xì)胞與成骨前體細(xì)胞之間，在正向正向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化增殖的同時(shí)，反向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)則可抑制破骨細(xì)胞的形成及其骨吸收活性[1-2]。對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的試驗(yàn)結(jié)果表明，成骨細(xì)胞中特異性EphB4過(guò)表達(dá)的小鼠最終股骨頸密度顯著增加，破骨細(xì)胞數(shù)量減少、增殖能力明顯下降，與骨吸收能力相關(guān)的尿液分解標(biāo)志物脫氧吡啶啉(deoxypyridinoline，DPD)水平降低[3]。既往諸多研究表明，Eph/Ephrin雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與BMP/Smads、JAK/STATj及MAPK等通路存在交叉作用，彼此之間相互協(xié)調(diào)，參與調(diào)節(jié)疼痛、抑郁發(fā)生發(fā)展、神經(jīng)-生理學(xué)系統(tǒng)等生物行為[4-6]，但Eph/Ephrin信號(hào)通路在骨平衡及骨生長(zhǎng)吸收等過(guò)程中的研究尚不深入。Compagni等[7]研究表明，在EphrinB1表達(dá)受到抑制的試驗(yàn)小鼠中可出現(xiàn)脊柱及四肢關(guān)節(jié)骨骼發(fā)育異常，其主要特點(diǎn)為脊椎椎體紊亂、關(guān)節(jié)融合及四肢遠(yuǎn)端小關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育不完善等問(wèn)題，而脊柱及四肢異常骨增生問(wèn)題同樣可出現(xiàn)在EphB2/EphB3受體突變的小鼠中。Davy等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，在EphrinB1及EphB2/EphB3表達(dá)突變的試驗(yàn)小鼠中，可出現(xiàn)顱骨鎖骨發(fā)育不全及胸骨骨化缺失等骨發(fā)育缺陷現(xiàn)象。本研究擬對(duì)EphB/EphrinB信號(hào)通路和去勢(shì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型骨量的相關(guān)性進(jìn)行初步探討，為EphB/EphrinB信號(hào)通路在骨穩(wěn)態(tài)失衡疾病中的作用提供一定試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

Ficoll細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司，SYBRRPrimeScriptTM RT-PCR Kit購(gòu)自日本Takara公司，基因引物購(gòu)自中國(guó)上海生工生物公司，倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源

研究動(dòng)物購(gòu)自中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院(原蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，8周齡健康雌性BALB/c小鼠24只，平均體重(20.0±3.2)g，術(shù)后10周處死，無(wú)菌條件下取小鼠雙下肢股骨和脛骨骨髓腔內(nèi)骨髓，貼壁培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，鑒定后方用于后續(xù)細(xì)胞試驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均按照我國(guó)“實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南”納入研究，本研究經(jīng)中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1小鼠卵巢去除術(shù)：將健康雌性BALB/c小鼠24只隨機(jī)分為以下兩組：假手術(shù)組及去勢(shì)組，每組各12只。采用如下手術(shù)方法：① 在小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(0.1 g/kg)進(jìn)行常規(guī)麻醉；② 對(duì)小鼠采用俯臥位，并將其四肢展開后固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，于肋下1 cm處，脊柱兩側(cè)2 cm處剪除毛發(fā)，并使用碘附消毒皮膚，然后切開背肌約1 cm，便可見兩側(cè)被黃色脂肪組織包繞的卵巢以及緊密相聯(lián)的子宮角(見圖1)；③ 用顯微器械尺鑷將小鼠脂肪組織夾起并拉出創(chuàng)口，于子宮角上部和輸卵管近子宮端切斷子宮角并將卵巢進(jìn)行摘除，觀察術(shù)部無(wú)明顯出血點(diǎn)后將脂肪組織送回腹腔，逐層縫合皮下組織后，關(guān)閉傷口；④ 假手術(shù)組僅僅去除卵巢周圍脂肪組織后逐層關(guān)傷口；⑤ 術(shù)后常規(guī)肌肉注射青霉素40萬(wàn)單位3 d，1次/d。

圖1 小鼠卵巢摘除術(shù)Fig.1 Mouse ovarian ablation

1.3.2腹腔內(nèi)注射EphB受體激動(dòng)劑EphrinB-Fc蛋白：將去勢(shì)組雌性BALB/c小鼠共計(jì)12只按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，各組動(dòng)物分別于術(shù)后2、4、6、8周腹腔內(nèi)注射不同F(xiàn)c。注射步驟：① 碘附消毒小鼠外側(cè)腹部皮膚；② 各組小鼠稱重，用PBS緩沖液溶解不同F(xiàn)c粉劑，一次性過(guò)濾器過(guò)濾；③ 使用微量注射器，按1 mg/kg分別給不同處理的小鼠腹腔內(nèi)注射相應(yīng)EphB受體激動(dòng)劑EphrinB-Fc蛋白：EfnB1-Fc組(OVX+EfnB1-Fc組)、EfnB2-Fc組(OVX+EfnB2-Fc組)，給予注射EphB受體抑制劑EphB2-Fc組(OVX+EphB2-Fc組)，對(duì)照組給予注射human IgG-Fc(OVX+Con+Fc組)，注射劑量均為0.5 mL，注射部位均選擇兩大腿根連線與腹中線交叉點(diǎn)外側(cè)約1 cm處，注射后使用棉簽壓迫注射點(diǎn)30 s。

1.3.3Micro-CT檢測(cè)動(dòng)物模型股骨骨量：各組分別注射Fc制劑后，于術(shù)后10周將24只小鼠脫頸處死，然后取各組股骨置于Micro-CT掃描試管內(nèi)進(jìn)行Micro-CT掃描分析，掃描電壓為80 kVp，電流為80 mA。沿著股骨的長(zhǎng)軸方向進(jìn)行掃描，分辨率為1024×1024像素，層間距為15 μm。掃描后所獲得的平面采用Microview ABA 2.1.2軟件進(jìn)行三維重建并測(cè)定骨密度(BMD)及骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)。

1.3.4小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定：① 取去勢(shì)組和假手術(shù)組術(shù)后10周小鼠，每組各為12只，頸椎脫臼處死后，將試驗(yàn)小鼠放置在75%酒精中5 min，在無(wú)菌條件下暴露小鼠股骨及脛骨，去除骨組織附帶的肌肉和骨膜，切斷股骨和脛骨兩端，用PBS液沖洗取下標(biāo)本。② 將4 mL沖洗液緩緩加入盛有等體積Ficoll細(xì)胞分離液試管內(nèi)，后以1 000 r/min將分離液試管離心10 min，試驗(yàn)用滴管抽吸出試管內(nèi)的乳白色云霧狀單核細(xì)胞層，PBS液將單核細(xì)胞層充分漂洗3次。漂洗后棄去上清的細(xì)胞重懸于含10% FBS及100 U/mL青鏈霉素的α-MEM-低糖培養(yǎng)液，按試驗(yàn)要求的密度在9孔培養(yǎng)基中接種后，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，平均每3天1次全量換液。③ 待細(xì)胞匯合成單層后加入0.25%的胰酶消化，按照1∶2的比例進(jìn)行傳代接種培養(yǎng)(此為第一代P1)，以此類推。待培養(yǎng)到P3代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5對(duì)培養(yǎng)鑒定后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞使用實(shí)時(shí)定量PCR(Realtime-PCR)檢測(cè)Runx2、ALP、Osterix、OPG及RANKL表達(dá)水平：通過(guò)SYBR GreenⅠ對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行行相對(duì)定量分析，試驗(yàn)過(guò)程遵照ΔΔCt解析研究方法進(jìn)行全程設(shè)計(jì)，主要測(cè)定在人與小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)的骨重建相關(guān)EphB/EphrinB信號(hào)通路關(guān)鍵分子的表達(dá)情況，引物由上海生工生物工程公司合成，見表1。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：① RT-PCR檢測(cè)反應(yīng)體系，見表2。② Realtime-PCR選擇兩步法反應(yīng)程序測(cè)定，見表3。③ 選擇2-ΔΔCt值法對(duì)研究中RT-PCR的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

表1成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因引物

Table1Gene primers of osteogenic and osteoclast differentiation

基因順序列(5’-3’)反序列(5’-3’)GAPDH Runx2ALPOsterixOPGRANKLaggccggtgctgagtat-gtccttcctcgaacttgatttct-cacaacccagacacaagcattccagaagccatacgctgac-ctttcttcttcaggtttgctgttc-ctattagcattcaggtgtc-caacctgcctgcttcaccaccttctctacaggaatacgcatcacaacaccagcaagaagaagcctttgccaggaaatgagtgagggaagaagtgggatgttttcaagtgcttcaagagagagggctgtgagtt

表2RT-PCR反應(yīng)液配制表

Table2Table of solution preparation for RT-PCR reaction

試劑使用量(μL)SYBR Premix Ex Taq II (2X)12.5PCR 前引物1PCR 后引物1cDNA模板2無(wú)菌水Total8.525

表3 Realtime-PCR反應(yīng)程序Table 3 Reaction procedure of real-time PCR

1.3.6成骨堿性磷酸酶染色(ALP)及茜素紅染色觀察成骨分化能力：ALP染色：①細(xì)胞成骨誘導(dǎo)14 d后，PBS進(jìn)行沖洗3遍，4 ℃多聚甲醛固定30 min，PBS再重新沖洗3遍，每次漂洗時(shí)間為5 min，選擇BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒說(shuō)明書按流程進(jìn)行顯色。② 遵循BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒的說(shuō)明書要求進(jìn)行染色液的配制。③將配制好的BCIP/NBT染色液加入經(jīng)過(guò)PBS漂洗3次后的細(xì)胞中。④將混勻的細(xì)胞溶液進(jìn)行37 ℃下避光保存30 min。⑤將混合細(xì)胞溶液中的BCIP/NBT染色液去除，PBS漂洗3遍后進(jìn)行拍照觀察。

茜素紅染色：①茜素紅染液的配制：稱取0.1 g茜素紅溶于Tris-HCl 100 mL(pH=8.3)中，4 ℃保存。②將以上成骨培養(yǎng)組培養(yǎng)21 d后，棄去培養(yǎng)基，使用預(yù)冷的PBS將細(xì)胞洗滌3次，然后加入預(yù)冷的多聚甲醛，室溫下固定30 min。③加入事先配制好的茜素紅染液，室溫下進(jìn)行染色5 min，然后晾干拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中骨重建相關(guān)Eph/Ephrin信號(hào)通路表達(dá)水平

在小鼠來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，與假手術(shù)組(Sham組)相比較，去勢(shì)組(OVX組)中EfnA2、EphB4、EfnB2、EfnB1及EphA4表達(dá)顯著增高(P<0.01)，去勢(shì)組中EphA2及EphB2表達(dá)顯著降低(P<0.01)。見圖2。

圖2 OVX組與Sham組小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中骨重建相關(guān)Eph/Ephrin信號(hào)通路表達(dá)水平比較注： 與Sham組比較，*P<0.01。Fig.2 Comparison of expression of Eph/Ephrin signaling pathway in bone remodeling between OVX group and Sham group in bone mesenchymal stem cells

2.2 Micro-CT分析檢測(cè)動(dòng)物模型股骨骨量結(jié)果

各去勢(shì)組分別注射Fc，于術(shù)后10周將小鼠脫頸處死，與OVX human IgG-Fc(OVX+con+Fc)組比較，Sham組、OVX+EfnB1-Fc、OVX+EfnB2-Fc及OVX+EphB2-Fc組骨小梁結(jié)構(gòu)均較完整、骨小梁密度較好(P<0.01)。與OVX+EfnB1-Fc、OVX+EfnB2-Fc去勢(shì)組相比較，Sham組和OVX+EphB2-Fc去勢(shì)組的骨密度及骨體積分?jǐn)?shù)均明顯增高(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組小鼠Fc腹腔注射后Micro-CT結(jié)果分析注： 與OVX+Con+Fc組比較，*P<0.01；與OVX+EfnB1-Fc 和 OVX+EfnB2-Fc去勢(shì)組比較，**P<0.01。Fig.3 Analysis of the results of micro-CT after intraperitoneal injection of Fc in mice of each group

2.3 Realtime-PCR檢測(cè)各組Runx2、ALP、Osterix、OPG及RANKL表達(dá)水平

各去勢(shì)組(EfnB1-Fc、EfnB2-Fc及EphB2-Fc)小鼠原代成骨細(xì)胞誘導(dǎo)7 d后，Realtime PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因提示，與去勢(shì)對(duì)照組(Con+Fc組)比較，EfnB1-Fc、EfnB2-Fc和EphB2-Fc去勢(shì)組中ALP與Osterix的表達(dá)水平升高(P<0.01)，與EfnB1-Fc去勢(shì)組比較，EphB2-Fc去勢(shì)組中ALP與Osterix的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。EfnB1-Fc、EfnB2-Fc和EphB2-Fc去勢(shì)組中RANKL的表達(dá)未見明顯差異(P>0.05)，但OPG的表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，OPG/RANKL的比率明顯上調(diào)(P<0.01)，其中，EfnB1-Fc去勢(shì)組與EphB2-Fc去勢(shì)組中OPG/RANKL的比率升高最為明顯(P<0.01)。見圖4-a、圖4-b。

圖4-a 各Fc處理組的去勢(shì)小鼠BMSCs成骨分化相關(guān)基因表達(dá)比較注：與 Con-Fc組比較，*P<0.01；與EfnB1-Fc組比較，**P<0.01。Fig.4 -a Comparison of osteogenic differentiation-related gene expression in castrated mouse BMSCs between each Fc-treated group

圖4-b 各Fc處理組的去勢(shì)小鼠BMSCs的OPG、RANKL表達(dá)比較注：與 Con-Fc組比較，*P<0.01；與EfnB1-Fc組比較，**P<0.01。Fig.4-b Comparison of OPG and RANKL expression in castrated mouse BMSCs between each Fc-treated group

2.4 成骨堿性磷酸酶染色(ALP)及茜素紅染色觀察各組成骨分化能力

各去勢(shì)組(EfnB1-Fc、EfnB2-Fc及EphB2-Fc)小鼠原代成骨細(xì)胞誘導(dǎo)14 d后進(jìn)行堿性磷酸酶染色，誘導(dǎo)21 d后進(jìn)行茜素紅染色。與去勢(shì)對(duì)照組(Con+Fc組)比較，EfnB1-Fc和EphB2-Fc去勢(shì)組中ALP的活性和骨基質(zhì)礦化能力顯著增強(qiáng)(P<0.01)，與EfnB1-Fc組相比較，EphB2-Fc去勢(shì)組的ALP增強(qiáng)最為明顯(P<0.01)。見圖5。

圖5 各Fc處理組的去勢(shì)小鼠BMSCs成骨分化的ALP及茜素紅染色結(jié)果分析注：與 Con-Fc組比較，*P<0.01；與EfnB1-Fc組比較，**P<0.01。Fig.5 Comparison of ALP and Alizarin red staining results in castrated mouse BMSCs between each Fc-treated group

3 討論

相關(guān)研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)在體內(nèi)分化為不同的組織細(xì)胞受復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制所控制，當(dāng)調(diào)控機(jī)制發(fā)生紊亂，將會(huì)導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生[9]。BMSCs的分化異常與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生密切相關(guān)，主要體現(xiàn)為在骨質(zhì)疏松患者骨髓中成骨分化能力減弱，成脂分化能力增加。目前主要有兩種學(xué)說(shuō)：①BMSCs的衰老導(dǎo)致了成熟的骨細(xì)胞生成減少，進(jìn)而造成了骨形成的減弱[10]。在一個(gè)多樣本的人群研究證實(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量和增殖能力在骨質(zhì)疏松患者中其數(shù)量以及增殖能力均是下降的[11]。在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力也是減弱的，由于成骨細(xì)胞分化的減少，使得骨保護(hù)素OPG生成減少，這樣間接的促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成，加速骨量丟失[12]。②在骨質(zhì)疏松癥患者中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂肪分化的增加抵消了其成骨分化[13]。在老年性骨質(zhì)疏松骨髓中，脂質(zhì)積累是增加的，這意味著成骨與成脂之間是負(fù)相關(guān)的。卵巢切除術(shù)引起的骨量的減少同樣也被證明脂肪細(xì)胞的分化是增加的。因此，通過(guò)干預(yù)，使得骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和成脂分化之間達(dá)到平衡，可能會(huì)成為一個(gè)治療骨質(zhì)疏松癥新的治療靶點(diǎn)。

在人類基因組中，Eph(erythropoietin-producing hepatocyte kinases)受體是酪氨酸蛋白激酶受體家族中最大的亞家族，Eph的配體為Ephrin(Eph receptor interacting proteins)[14]。目前研究表明，人類基因組中Eph受體共有14個(gè)成員，其中包括2個(gè)亞類的EphA(EphA1～EphA8)以及EphB(EphB1～EphB6)[15]。Zhao等[16]團(tuán)隊(duì)率先研究報(bào)道，在骨吸收與骨形成耦聯(lián)過(guò)程中存在Eph/Ephrin雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并影響整個(gè)耦聯(lián)過(guò)程。EphB4過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠被研究證實(shí)骨密度高于對(duì)照組小鼠，且其破骨細(xì)胞的增殖能力收到明顯抑制。Kuroda等[17]對(duì)成骨細(xì)胞中EphA4研究發(fā)現(xiàn)，EphA4蛋白在試驗(yàn)小鼠的成骨及軟骨骨化方面發(fā)揮重要影響，在成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞形成的終末期影響更為明顯，但與EphA4蛋白相互作用的Ephrin配體尚需進(jìn)一步研究闡明。

在本研究中發(fā)現(xiàn)：在小鼠來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，去勢(shì)組小鼠的EfnA2、EphB4、EfnB2、EfnB1及EphA4較假手術(shù)組明顯表達(dá)降低，但去勢(shì)組中EfnA2及EfnB2相比表達(dá)顯著升高。使用Micro-CT分析檢測(cè)動(dòng)物模型股骨骨量結(jié)果提示：各組分別注射Fc，于術(shù)后10周將小鼠脫頸處死，加入human IgG-Fc去勢(shì)組(OVX+Con+Fc組)小鼠的骨小梁結(jié)構(gòu)均破壞嚴(yán)重，骨小梁密度下降。Sham組和加入EfnB1-Fc、EphB2-Fc去勢(shì)組的骨密度及骨體積分?jǐn)?shù)均明顯增高，但EphB2-Fc去勢(shì)組提高骨密度能力更好。此結(jié)果表明小鼠去勢(shì)后可抑制BMSCs的成骨分化能力，而EphB2-Fc可刺激骨微環(huán)境，有利于去勢(shì)小鼠骨量的維持。我們?cè)隗w外試驗(yàn)中已驗(yàn)證了EphB2/EphrinB1雙向信號(hào)通路對(duì)去勢(shì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中再次驗(yàn)證其信號(hào)通路對(duì)去勢(shì)小鼠骨量丟失的抑制作用，改善了去勢(shì)小鼠的骨量丟失。采用成骨堿性磷酸酶染色(ALP)、茜素紅染色及Realtime-PCR檢測(cè)Runx2、ALP、Osterix、OPG及RANKL表達(dá)水平的研究中結(jié)果提示：EfnB1-Fc和EfnB2-Fc組中Runx2表達(dá)增高，EfnB1-Fc、EfnB2-Fc和EphB2-Fc去勢(shì)組中ALP與Osterix的表達(dá)水平升高，且EphB2-Fc去勢(shì)組中ALP與Osterix的表達(dá)水平升高最為明顯，EfnB1-Fc和EphB2-Fc可顯著提高BMSCs成骨分化中ALP的活性和骨基質(zhì)礦化能力，以EphB2-Fc效果最為顯著。EfnB1-Fc、EfnB2-Fc和EphB2-Fc去勢(shì)組中OPG的表達(dá)水平明顯升高，進(jìn)而OPG/RANKL的比率明顯上調(diào)。其中，EfnB1-Fc去勢(shì)組與EphB2-Fc去勢(shì)組中OPG/RANKL的比率升高最為明顯。本研究結(jié)果顯示：①EfnB1-Fc與EphB2-Fc在抑制骨量丟失、促進(jìn)骨基質(zhì)礦化能力方面功能相似，其原因兩個(gè)因素相關(guān)，即EphrinB1(EfnB1)上調(diào)后可發(fā)揮促成骨抑制破骨，以及EphrinB1高親和結(jié)合受體EphB2受到抑制劑作用后反向刺激EphrinB1信號(hào)通路，引起EphrinB1上調(diào)最終提高成骨分化能力相關(guān)。Eph/Ephrin信號(hào)通路對(duì)骨重建的影響中，當(dāng)EphrinB2缺乏時(shí)，EphrinB1和其他因子可能起到代償作用。②骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的Runx2，在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨祖細(xì)胞時(shí)發(fā)揮重要作用，顯著的增加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化以及骨礦化能力[18]。③ALP作為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化早中期的一個(gè)標(biāo)志物，在鈣化期開始達(dá)到高峰，提高質(zhì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化的能力。④Osterix作為Runx2的下游作用元件，在成骨過(guò)程中出現(xiàn)的比Runx2晚，Osterix本身作為重要影響因子，可在Runx2促進(jìn)BMCs分化為成骨祖細(xì)胞之后，繼續(xù)發(fā)揮促進(jìn)前成骨細(xì)胞的形成作用，并影響前成骨細(xì)胞向功能完善的成骨細(xì)胞分化[19]。⑤在成骨與破骨分化過(guò)程中，EphB/EphrinB對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的調(diào)節(jié)不光局限于成骨分化能力，也間接影響破骨細(xì)胞系的分化功能，其中EfnB2-Fc對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制作用最為顯著。⑥EphB/EphrinB雙向信號(hào)通路中的反向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過(guò)EphrinB2 C端的YKV基序部位與胞內(nèi)含PDZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合作用，其產(chǎn)生的信號(hào)向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)c-Fos-NFATc1轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程(負(fù)反饋)產(chǎn)生抑制作用，從而降低破骨細(xì)胞的分化[20]。⑦經(jīng)EphB4的正向信號(hào)使成骨前體細(xì)胞內(nèi)的成骨分化標(biāo)志物表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化，其胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是降低RhoA 活性促進(jìn)成骨能力。

EfnB1-Fc和EphB2-Fc處理可上調(diào)去勢(shì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的ALP和Osterix表達(dá)，這與Arthur等[21]和 Xing等[22]分別在正常人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和正常小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究一致。文獻(xiàn)報(bào)道在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞偶聯(lián)機(jī)制中EphB4/EphrinB2雙向信號(hào)通路能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞分化。對(duì)于OPG的上調(diào)和EfnB1-Fc和EphB2-Fc處理組一致，提示EfnB2-Fc的作用主要表現(xiàn)應(yīng)在于對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制。之所以沒有選擇EphB4-Fc作為刺激因素是因?yàn)镋phB4是EphrinB2的主要受體，而EphrinB2的反向信號(hào)通路主要發(fā)生在破骨細(xì)胞中，抑制破骨細(xì)胞分化，在成骨細(xì)胞系中增加EphB4-Fc并不能起到促進(jìn)成骨分化作用[23]。

體外試驗(yàn)驗(yàn)證了EphB2/EphrinB1雙向信號(hào)通路對(duì)去勢(shì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的作用，并且發(fā)現(xiàn)EphB/EphrinB通過(guò)調(diào)節(jié)OPG/RNAKL比率影響去勢(shì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的功能，從而間接影響破骨細(xì)胞系的分化。本研究證明EphB/EphrinB信號(hào)通路的刺激干預(yù)可以改善因去勢(shì)后小鼠骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)一步加劇，阻止了骨小梁的大量破壞和丟失。在早期的研究中，通過(guò)骨髓腔內(nèi)注射技術(shù)，對(duì)于去勢(shì)造成的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型給予骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注射，有利于小鼠骨量的維持。在研究中，通過(guò)腹腔內(nèi)注射EfnB1-Fc、EfnB2-Fc、EphB2-Fc片段，結(jié)合EphB/EphrinB對(duì)OPG/RANKL的研究，可以推測(cè)EphB2-Fc促進(jìn)成骨作用比較顯著，EfnB2-Fc在調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞OPG的上調(diào)對(duì)骨微環(huán)境中破骨細(xì)胞的分化起到一定的抑制作用，進(jìn)而減少了骨吸收，維持了骨量。提示EphB/EphrinB信號(hào)通路對(duì)于去勢(shì)后破骨細(xì)胞系的作用機(jī)制應(yīng)是下一步研究的方向之一。從而使EphB/EphrinB信號(hào)通路在整體骨重建過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用機(jī)制更加明晰。

綜上，本研究驗(yàn)證了EphB/EphrinB在去勢(shì)骨質(zhì)疏松小鼠中調(diào)節(jié)骨重建的作用，為進(jìn)一步將EphB/EphrinB作為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松治療靶點(diǎn)的目標(biāo)提供了試驗(yàn)依據(jù)。