深圳市耐多藥結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變特征分析

洪創(chuàng)躍 楊婷婷 李金莉 李霜君 吳利凱 楊爭(zhēng) 譚衛(wèi)國(guó)

耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)是全球及我國(guó)主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。MDR-TB的治療需要多種藥品聯(lián)合，療程較長(zhǎng)，制定的治療方案常因缺乏藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱(chēng)“藥敏試驗(yàn)”)檢測(cè)結(jié)果而導(dǎo)致治療失敗，增加患者的復(fù)發(fā)率[1]，因此，藥敏試驗(yàn)對(duì)于MDR-TB患者的治療尤為重要。目前，作為金標(biāo)準(zhǔn)的表型藥敏試驗(yàn)(drug susceptibility testing, DST)結(jié)果檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)[2]，臨床醫(yī)生不能及時(shí)制定具有針對(duì)性的治療方案。而快速分子檢測(cè)方法(如GeneXpert MTB/RIF、GenoType MTBDRplus等)能夠解決DST耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題，已逐漸應(yīng)用于臨床檢測(cè)中，但由于其目前只能檢測(cè)有限的耐藥突變，故只能選擇檢測(cè)已知耐藥突變頻率高的突變類(lèi)型；另一方面，由于不同地區(qū)結(jié)核分枝桿菌菌株的基因型不同，其耐藥基因的突變類(lèi)型和頻率也有差異，如katG基因突變?cè)谥饕餍芯隇長(zhǎng)3型的巴基斯坦地區(qū)是katG-463-R/L(66.7%)，而在主要流行菌株為L(zhǎng)2型的北京則為katG-315-S/T(73.8%)[3-4]，故檢測(cè)本地區(qū)的耐藥突變類(lèi)型，只能為當(dāng)?shù)氐倪x擇提供基礎(chǔ)。隨著全基因組測(cè)序(whole-genome sequencing, WGS)技術(shù)的普及，基于全基因組序列數(shù)據(jù)分析可以同時(shí)檢測(cè)目前所有已知的對(duì)一線(xiàn)和二線(xiàn)抗結(jié)核藥品的耐藥突變，而且能夠獲得高于目前所有其他分子檢測(cè)方法的敏感度和特異度[5-7]，為評(píng)估現(xiàn)有分子技術(shù)檢測(cè)出的耐藥突變類(lèi)型的代表性，全面分析一個(gè)地區(qū)耐藥突變類(lèi)型，研發(fā)適合檢測(cè)本地區(qū)耐藥突變類(lèi)型的分子技術(shù)提供依據(jù)。筆者利用2013—2017年深圳市MDR-MTB菌株全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，分析深圳市MDR-MTB菌株的耐藥基因突變類(lèi)型和特點(diǎn)，以及主要突變類(lèi)型與不同菌株基因型之間的相關(guān)性，旨在了解深圳市耐藥結(jié)核病的耐藥突變特點(diǎn)，為本地區(qū)耐藥結(jié)核病分子快速檢測(cè)方法的應(yīng)用提供依據(jù)。

材料和方法

一、研究材料

收集2013—2017年深圳市慢性病防治中心及各區(qū)慢性病防治院門(mén)診診治的11 315例肺結(jié)核患者中，確診為MDR-TB的449例患者的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株作為研究材料。

二、研究方法

1.WGS：由于本中心缺少測(cè)序設(shè)備，委托深圳聯(lián)合醫(yī)學(xué)科技有限公司對(duì)449株MDR-MTB臨床分離株進(jìn)行測(cè)序，并于測(cè)序完成后返回測(cè)序原始數(shù)據(jù)。

2.WGS數(shù)據(jù)分析：通過(guò)對(duì)原始序列數(shù)據(jù)中基因突變的分析來(lái)獲得所需的相應(yīng)的耐藥突變基因和突變位點(diǎn)。第一步，分別使用Scythe(https://github.com/ucdavisbioinformatics/scythe)和Sickle(https://github.com/najoshi/sickle)兩個(gè)軟件對(duì)449株菌株的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行接頭去除和低質(zhì)量堿基處理(過(guò)濾Phred<20的堿基)。第二步，使用Bowtie2(http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2)軟件將處理過(guò)的高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)與結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(H37Rv)基因組模板序列(從美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院維護(hù)的基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank accession：NC_000962.3獲得)進(jìn)行比對(duì)。第三步，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，篩選出測(cè)序深度>10 X、基因組覆蓋度>95%[8]的測(cè)序數(shù)據(jù)樣本，本研究最終獲得平均深度為187X、覆蓋度為98.2%的447個(gè)滿(mǎn)足分析要求的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)。

3.單核苷酸多態(tài)性(SNP)鑒定：使用Samtools(http://www.htslib.org/)工具包鑒定每株菌株相比于H37Rv的SNP，將比對(duì)質(zhì)量(mapping quality)最低值設(shè)定為30。再采用VarScan(http://varscan.sourceforge.net)軟件進(jìn)一步鑒定和篩選出頻率≥75%，至少10條序列支持的SNP固定突變。

4.菌株分型和耐藥基因突變判定：將每株菌株鑒定后的全基因組SNP與H37Rv的各基因型和亞型的特異性突變(如L1，615938 G→A；L2，497491 G→A；L2.3, 1286766 G→C)進(jìn)行比對(duì)，獲得各菌株獨(dú)屬的基因型或亞型[根據(jù)SNP的特異性突變，全球菌株的基因型可分為7種類(lèi)型(L1～L7基因型)[9-10]]。將本研究檢測(cè)到的全基因組SNP與11種抗結(jié)核藥品(剔除掉所有患者治療中均未使用到的氯法齊明、利奈唑胺和貝達(dá)喹啉)的已知耐藥基因突變(從GenBank基因數(shù)據(jù)庫(kù)獲得)進(jìn)行比對(duì)，獲得每株菌株的耐藥基因突變類(lèi)型[11-12]，以耐藥基因是否發(fā)生突變作為判斷藥品敏感性的結(jié)果，以發(fā)現(xiàn)耐藥基因突變視為耐藥菌株，反之則為敏感菌株。11種藥品包括異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、吡嗪酰胺(PZA)、鏈霉素(Sm)、氧氟沙星(Ofx)、阿米卡星(Am)、卡那霉素(Km)、卷曲霉素(Cm)、乙硫異煙胺(Eto)、對(duì)氨基水楊酸(PAS)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、MDR-MTB臨床分離株耐藥基因突變情況

447株MDR-MTB臨床分離株的測(cè)序結(jié)果顯示432株(96.6%)發(fā)生基因突變。不同藥品的主要耐藥突變基因及突變類(lèi)型的分布情況見(jiàn)表1。

1.432株MDR-MTB對(duì)一線(xiàn)抗結(jié)核藥品發(fā)生耐藥突變的基因：(1)INH：發(fā)生katG突變共計(jì)391株(90.5%)、inhA突變37株(8.6%)、oxyR-ahpC突變3株(0.7%)、kas基因突變1株(0.2%)。耐藥基因中共產(chǎn)生31種突變類(lèi)型，其中最主要的突變類(lèi)型為katG-315-S/T(81.7%,353/432)；此外，發(fā)現(xiàn)43株(10.0%,43/432)存在2個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合突變，以katG和inhA聯(lián)合突變居多(2.1%,9/432)。(2)RFP：均發(fā)生在rpoB基因耐藥決定區(qū)(rifam-picin-resistance determining region，RRDR)，共產(chǎn)生50種突變類(lèi)型，最主要的突變類(lèi)型為rpoB-450-S/L(59.7%,258/432)；且發(fā)現(xiàn)59株(13.7%,59/432)存在2個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的聯(lián)合突變。(3)EMB：主要為embB基因，主要位點(diǎn)分布在306(66.0%,175/265)、406(14.0%,37/265)、497(9.1%,24/265)、354(4.2%,11/265)等位點(diǎn)；同時(shí)在embA基因上也發(fā)現(xiàn)了突變位點(diǎn)的存在，主要在embA啟動(dòng)子的-12(4.9%,13/265)、 -16(1.5%,4/265)位點(diǎn)。共產(chǎn)生31種突變類(lèi)型，其突變類(lèi)型以embB-306-M/V(35.5%,94/265)和embB-306-M/I(20.0%,53/265)最為常見(jiàn)，其中22株(8.3%,22/265)存在位點(diǎn)聯(lián)合突變。(4)PZA：主要為pncA基因及pncA啟動(dòng)子區(qū)，共產(chǎn)生55種突變類(lèi)型，其中突變頻率最高的是pncA啟動(dòng)子-11-T/C(8.9%,11/123)。(5)Sm：主要為rrs和rpsL基因，共產(chǎn)生12種突變類(lèi)型，其中最主要的突變類(lèi)型為rpsL-43-K/R(66.0%,198/300)；另發(fā)現(xiàn)59株(19.7%,59/300)菌株中存在位點(diǎn)聯(lián)合突變。

2.對(duì)二線(xiàn)抗結(jié)核藥品發(fā)生耐藥突變的基因：(1)Ofx：主要在gyrA和gyrB基因上，但以gyrA(96.8%,120/124)基因突變?yōu)橹?，主要的突變?lèi)型為gyrA-90-A/V(31.5%,39/124)與gyrA-94-D/G(29.8%,37/124)。(2)Am、Km和Cm：主要為rrs基因，突變類(lèi)型以rrs-1401-A/G(71.2%,79/111)為主，在Am、Km和Cm中分別占48.1%(25/52)、100.0%(27/27)、84.4%(27/32)。(3)Eto：主要發(fā)生在inhA基因，主要的耐藥突變類(lèi)型為inhA-15-C/T(84.2%,48/57)。(4)PAS：主要在folC和thyA基因，主要的突變類(lèi)型為folC-43-I/T(15.6%,5/32)與thyA-75-H/N(31.3%,10/32)。

表1 深圳市447株MDR-MTB臨床分離株對(duì)一、二線(xiàn)抗結(jié)核藥品的耐藥基因突變類(lèi)型

續(xù)表1

注“其他”表示該種藥品中單個(gè)突變類(lèi)型<5株的類(lèi)型之和；表中英文縮寫(xiě)分別為：A:丙氨酸；C：半胱氨酸；D：天冬氨酸；G：甘氨酸；H：組氨酸；I:異亮氨酸；K：賴(lài)氨酸；L：亮氨酸；N：天冬酰胺；M：甲硫氨酸；P：脯氨酸；Q：谷氨酰胺；R：精氨酸；S:絲氨酸；T：蘇氨酸；V: 纈氨酸；Y：酪氨酸；*：基因突變形成了終止密碼子，不編碼成氨基酸類(lèi)型

二、MDR-MTB臨床分離株基因型

本研究?jī)H獲得3個(gè)基因型，分別為L(zhǎng)1型(0.4%,2/447)、L2型(84.6%,378/447)和L4型(15.0%,67/447)。其中，L2型菌株又分為3個(gè)亞型，分別為L(zhǎng)2.1型菌株(1.9%，7/378)、L2.2型菌株[又稱(chēng)“古老北京型”；37.0%(140/378)]和L2.3型菌株[又稱(chēng)“現(xiàn)代北京型”；61.1%(231/378)]。

三、耐藥基因突變類(lèi)型與耐藥基因型的相關(guān)性分析

由于本研究L1菌株(0.4%)及L2.1型菌株(1.9%)較少，故本結(jié)果僅分析L2.2型、L2.3型和L4型菌株與各藥品主要耐藥突變類(lèi)型的相關(guān)性。結(jié)果顯示：(1)耐藥突變類(lèi)型katG-315-S/T(INH)、embB-306-M/V(EMB)、rpsL-43-K/R(Sm)在L2基因型中的比例明顯高于L4型(P值均<0.05)；PAS中folC-43-I/T和thyA-75-H/N兩種突變類(lèi)型僅在L2型菌株中出現(xiàn)。(2)L2.3型菌株中inhA-15-C/T(INH)、rpoB-450-S/L(RFP)、rpsL-43-K/R(Sm)和inhA-15-C/T(Eto)的突變率均明顯高于L2.2型菌株(χ2分別為4.319、5.668、16.053、12.797，P值均<0.05)，而katG-315-S/T(INH)的發(fā)生率則明顯低于L2.2型菌株(P=0.000)。(3)PAS中的thyA-75-H/N突變也僅在L2.2型菌株中發(fā)現(xiàn)，而在L4基因型未發(fā)現(xiàn)突變株數(shù)。具體見(jiàn)表2。

討 論

采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)耐藥基因突變來(lái)預(yù)測(cè)結(jié)核分枝桿菌的藥品敏感性已獲得WHO的認(rèn)可和推薦[13-14]，同時(shí)相關(guān)的研究證據(jù)也表明分子藥敏試驗(yàn)具有較高的敏感度和特異度，且與DST的結(jié)果一致性超過(guò)85%[5-6,15]。但由于不同地區(qū)的結(jié)核分枝桿菌主要流行基因型不同，導(dǎo)致其耐藥突變類(lèi)型和突變位點(diǎn)頻率不盡相同[3,16-19]；同時(shí)，目前用于臨床檢測(cè)的分子方法僅能檢測(cè)部分藥品或部分高頻耐藥突變基因[13,20-24]，如GeneXpert MTB/RIF僅檢測(cè)RFP的耐藥突變，而GenoType MTBDRplus僅檢測(cè)INH的katG和inhA基因，EMB僅檢測(cè)embB基因，而與耐藥相關(guān)的oxyR-ahpC和kasA(INH)、embA啟動(dòng)子(EMB)并未涉及。

表2 深圳市MDR-TB臨床分離株對(duì)不同藥品主要突變類(lèi)型在不同基因型中的分布情況

注括號(hào)外數(shù)值為“突變株數(shù)”，括號(hào)內(nèi)數(shù)字為“突變率(%)”；突變株數(shù)包含表1中其他菌株類(lèi)型中未顯示的菌株。a：為L(zhǎng)2型中L2.2型與L2.3型的差異性比較；b：為L(zhǎng)2型與L4型的差異性比較；SLID為包含Am、Km、Cm在內(nèi)的二線(xiàn)抗結(jié)核藥品注射劑；耐PZA、PAS中主要突變數(shù)量較少，故不作分析

WGS方法相比較這些分子檢測(cè)方法具有可檢測(cè)所有已知耐藥突變類(lèi)型的優(yōu)勢(shì)，既可以對(duì)本地區(qū)耐藥突變特征進(jìn)行全面分析，也可以評(píng)估本地區(qū)使用的分子檢測(cè)方法是否適用。例如本研究結(jié)果不僅檢測(cè)出所有已知的耐藥突變類(lèi)型，還發(fā)現(xiàn)3株oxyR-ahpC和1株kasA(INH)、13株embA啟動(dòng)子(EMB)突變的情況，若采用目前臨床使用的分子檢測(cè)方法則會(huì)產(chǎn)生漏診情況。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)多種藥品(INH、RFP、EMB和Sm)存在兩種及以上耐藥突變情況，提示患者體內(nèi)存在異質(zhì)性耐藥[25]，可能導(dǎo)致臨床DST檢測(cè)同時(shí)出現(xiàn)耐藥和敏感的結(jié)果，對(duì)臨床醫(yī)生的診斷治療造成困惑。既往研究顯示，目前的分子檢測(cè)方法的敏感度僅能檢測(cè)到高于20%的耐藥亞群[26]，這可能也是多種分子檢測(cè)方法研究未見(jiàn)異質(zhì)性耐藥報(bào)道的原因之一[3-4,27]。而本研究采用WGS方法發(fā)現(xiàn)了比例不低的異質(zhì)性突變情況，且檢查出來(lái)的耐藥亞群均低于20%，進(jìn)一步說(shuō)明WGS相比較其他分子檢測(cè)方法具有更大的優(yōu)勢(shì)。

不同地區(qū)的耐藥突變譜不同，可能與不同地區(qū)的不同流行基因型菌株差異有關(guān)[3,16-19]。本研究中深圳地區(qū)主要以L2型和L4型基因型為主，其中L2基因型菌株超過(guò)80%，是最主要的流行基因型；同時(shí)發(fā)現(xiàn)L2型菌株中katG-315-S/T(INH，81.7%)、embB-306-M/V(EMB)、rpsL-43-K/R(Sm)突變頻率最高，與katG-315-S/T在主要流行L3型的印度地區(qū)(62.6%)[16]和主要流行L4型的墨西哥地區(qū)(60.0%)[18]的研究結(jié)果存在差異，也與同樣流行L2基因型的北京(73.8%)[4]和上海(66.3%)[5]不同，這一結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了解本地區(qū)耐藥突變分布情況的重要性。EMB耐藥菌株中則出現(xiàn)了突變位點(diǎn)相同但突變類(lèi)型不同的情況，如在主要流行L3型的巴基斯坦地區(qū)，突變類(lèi)型為embB-306-M/I占20%[19]；而本研究在深圳市L2流行為主的情況下，突變類(lèi)型為embB-306-M/V占比較大(35.5%)，與上海地區(qū)相似(embB-306-M/V，36.2%)[5]，但較北京地區(qū)低(embB-306-M/V，62.5%)[4]。研究還發(fā)現(xiàn)，PAS的folC-43-I/T、thyA-75-H/N兩種突變類(lèi)型僅出現(xiàn)在L2型菌株中，與已報(bào)道的研究相同[28]；Am的rrs基因中出現(xiàn)514和517位點(diǎn)的突變情況，這種突變暫時(shí)未見(jiàn)其他耐藥研究報(bào)道[2,5,7,29]，是否與其耐藥性存在相關(guān)性仍需進(jìn)一步深入研究；同時(shí)，檢測(cè)到Am的2個(gè)耐藥基因突變位點(diǎn)，可能是本研究中Am的耐藥率高于Km的原因。因此，不同地區(qū)突變類(lèi)型和基因型存在的這些差異，使得同一種分子檢測(cè)方法檢測(cè)敏感度也存在差異。例如巴基斯坦地區(qū)使用GenoType MTBDRplus檢測(cè)INH、RFP的敏感度分別為71.7%、79.2%[3]；而巴西地區(qū)、中國(guó)北京也采用同樣方法，其檢測(cè)敏感度分別為83.3%、93.3%[27]和82.1%、98.7%[4]。因此，采用WGS對(duì)本地區(qū)進(jìn)行耐藥突變特征分析，可以了解本地區(qū)耐藥突變分布情況，進(jìn)而針對(duì)相應(yīng)突變類(lèi)型設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的突變位點(diǎn)，對(duì)提高分子檢測(cè)方法的敏感度、避免漏診耐藥患者、更好地指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義。

綜上所述，本研究揭示了深圳市MDR-MTB菌株主要耐藥突變類(lèi)型，以及突變類(lèi)型與菌株基因型的相關(guān)性，為研發(fā)新的耐藥結(jié)核病分子檢測(cè)方法選擇耐藥突變位點(diǎn)提供了數(shù)據(jù)支持，為提高分子耐藥檢測(cè)敏感度、精準(zhǔn)指導(dǎo)臨床用藥提供理論參考。