廣西壯族自治區(qū)耐多藥結(jié)核分枝桿菌耐藥情況與基因型特征分析

梁小煙 林玫 梁大斌 藍(lán)如束 覃慧芳 葉婧 黃莉雯

據(jù)全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告顯示，我國(guó)結(jié)核病總耐藥率為42.10%，耐多藥(multidrug-resistant, MDR)發(fā)生率為6.8%，雖較2000年有所下降，但仍高于全球平均水平，耐藥形勢(shì)不容樂觀[1]。北京基因型作為全球第二大流行菌株，與INH、RFP、EMB耐藥的發(fā)生呈正相關(guān)，與MDR的發(fā)生呈強(qiáng)相關(guān)[2-3]。間隔區(qū)寡核苷酸基因分型(Spoligotyping)技術(shù)是鑒定北京基因型的金標(biāo)準(zhǔn)，但其所耗時(shí)間較長(zhǎng)，容易造成交叉污染且易出現(xiàn)人為判讀錯(cuò)誤；而熔解曲線間隔區(qū)寡核苷酸基因分型(melting curve analysis-based Spoligotyping，McSpoligotyping)是一種新型的基因分型技術(shù)，與傳統(tǒng)的Spoligotyping相比，不僅大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，也避免了由于人工判讀而導(dǎo)致的錯(cuò)誤；同時(shí)其結(jié)果的準(zhǔn)確率也較高，可用于結(jié)核病的流行病學(xué)研究[4]。廣西壯族自治區(qū)(以下簡(jiǎn)稱“廣西”)位于我國(guó)西南地區(qū)，由于其特殊的地理位置，結(jié)核病和MDR-TB 疫情一直處于全國(guó)較高水平[5-6]，嚴(yán)重制約著廣西的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，然而關(guān)于廣西MDR-MTB基因型與耐藥性的關(guān)系鮮有報(bào)道。因此，本研究采用McSpoligotyping分型技術(shù)對(duì)收集到的MDR-MTB菌株進(jìn)行基因分型，了解其耐藥情況和基因型分布特征，同時(shí)分析基因型與耐藥的關(guān)系。

材料和方法

一、菌株來源

采用連續(xù)監(jiān)測(cè)的方法，選取位于廣西境內(nèi)東、西、南、北、中的貴港市、百色市、崇左市、桂林市、防城港市5個(gè)市為監(jiān)測(cè)點(diǎn)，采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取5個(gè)市中的21個(gè)縣(市、區(qū))，納入于2016—2017年在當(dāng)?shù)亟Y(jié)核病防治(簡(jiǎn)稱“結(jié)防”)機(jī)構(gòu)登記治療且培養(yǎng)陽性的MTB菌株，共1514株，將菌株送往廣西疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治所進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)，最終有51株確定為MDR-MTB菌株，其中貴港市12株(23.53%)、百色市9株(17.65%)、崇左市18株(35.29%)、桂林市5株(9.80%)、防城港市7株(13.73%)。

二、研究方法

(一)藥敏試驗(yàn)

采用WHO[7]推薦的比例法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，本研究共檢測(cè)6種藥品，包括異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、鏈霉素(Sm)、氧氟沙星(Ofx)和卡那霉素(Km)。

(二)DNA提取(煮沸法)

取帶螺旋蓋的前處理管，加入500 μl滅菌生理鹽水；用接種環(huán)在固體培養(yǎng)基上刮取1～2環(huán)MTB加入前處理管中；使用80 ℃水浴滅活30 min后，12 000×g離心5 min；棄上清液，然后加入200 μl三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸緩沖液(TE)重懸菌體；置于100 ℃金屬浴中15 min，取出后12 000×g離心10 min后取其上清液置于潔凈的EP管中備用。

(三)McSpoligotyping基因分型

1.操作步驟：每份樣本分為3管進(jìn)行檢測(cè)，分別加擴(kuò)增試劑McSpoligotyping PCR Mix(A/B/C)。先按照每個(gè)樣本19.75 μl McSpoligotyping PCR Mix(A/B/C)+0.25 μl McSpoligotyping酶的比例混合PCR反應(yīng)液，混勻后3000×g離心5 s，然后抽取20 μl離心后的3種PCR反應(yīng)液分裝于PCR薄壁反應(yīng)管中，最后加入5 μl DNA樣本或陰/陽性對(duì)照品后置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。

2.PCR擴(kuò)增條件和熔解曲線分析：50 ℃ 5 min→95 ℃ 10 min→(95 ℃ 15 s→57 ℃ 15 s→72 ℃ 15 s)×50個(gè)循環(huán)→95 ℃ 1 min→35 ℃ 1 min→35 ℃～90 ℃ 以0.04 ℃/s的速率升溫時(shí)進(jìn)行熔解曲線分析，并采集羧基熒光素(FAM)、羧基羅丹明(ROX)、六氯熒光素(HEX)和吲哚二碳菁(CY5)四個(gè)通道的熒光信號(hào)。

3.結(jié)果判讀：本研究共檢測(cè)43個(gè)間隔子，判讀規(guī)則見文獻(xiàn)[8]。將數(shù)據(jù)表提交至國(guó)際數(shù)據(jù)庫MIRU-VNTRplus (https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index.faces)和SpolDB4.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

結(jié) 果

一、耐藥情況

51株MDR-MTB菌株中，有21株對(duì)EMB耐藥，16株對(duì)Sm耐藥，15株對(duì)Ofx耐藥，1株對(duì)Km耐藥，耐藥率分別為41.18%、31.37%、9.80%和1.96%。耐藥形式共9種，包括耐INH+RFP、耐INH+RFP+Sm、耐INH+RFP+EMB、耐INH+RFP+Ofx、耐INH+RFP+Sm+EMB、耐INH+RFP+Sm+Ofx、耐INH+RFP+EMB+Ofx、耐INH+RFP+Sm+EMB+Ofx、耐INH+RFP+Sm+EMB+Ofx+Km，其包含的菌株數(shù)分別為23株(45.10%)、4株(7.84%)、4株(7.84%)、2株(3.92%)、5株(9.80%)、1株(1.96%)、6株(11.76%)、5株(9.80%)和1株(1.96%)。

二、基因分型

McSpoligotyping將51株MDR-MTB菌株分為北京和非北京基因型兩大類，其中北京基因型29株(56.86%)，非北京基因型22株(43.14%)。非北京基因型包括T家族(含6株T1、4株T2和1株T4)11株(21.57%, 11/51)、U家族2株(3.92%, 2/51)、MANU家族(MANU2)1株(1.96%, 1/51)和新發(fā)現(xiàn)基因型8株(15.69%, 8/51)。將獲得的基因分型結(jié)果與SpolDB 4.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，有43株被分為18種型別且有對(duì)應(yīng)的系統(tǒng)集成測(cè)試(SIT)編碼，典型北京基因型(SIT=1)占所有菌株的37.25%(19/51)，有8株未找到相對(duì)應(yīng)的SIT編碼，為本研究新發(fā)現(xiàn)基因型。見表1。

表1 51株耐多藥結(jié)核分枝桿菌McSpoligotyping基因分型結(jié)果

續(xù)表1

表2 廣西耐多藥結(jié)核分枝桿菌基因型與耐藥情況的相關(guān)性

注a：表示采用Fisher確切概率法

三、基因型與耐藥情況相關(guān)性

北京基因型和非北京基因型菌株對(duì)EMB、Sm、Ofx、Km耐藥情況比較見表2，結(jié)果顯示差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討 論

MDR-TB是全球結(jié)核病防控的主要威脅，由于其治療效果不佳，耐受性差，且治療費(fèi)用較高，因此MDR-TB患者，特別是并發(fā)糖尿病和年齡較大者，更有可能導(dǎo)致不良治療結(jié)局和死亡[9-10]。關(guān)于MDR-TB的相關(guān)研究一直以來都是全球關(guān)注的熱點(diǎn)。本研究對(duì)收集到的MDR-MTB菌株進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDR-MTB對(duì)EMB、Sm、Ofx、Km的耐藥率分別為41.18%、31.37%、9.80%和1.96%。對(duì)EMB的耐藥率雖低于全國(guó)水平(58.7%)[11]，但明顯高于海南省(27.34%)[12]、烏魯木齊市(31.0%)[13]和廣西以往的報(bào)道(21.7%)[14]。EMB作為一線抗結(jié)核藥品，是初、復(fù)治結(jié)核病的常規(guī)藥品，其耐藥率的增加勢(shì)必會(huì)對(duì)結(jié)核病的治療效果產(chǎn)生影響，因此應(yīng)加強(qiáng)對(duì)EMB耐藥性的監(jiān)測(cè)。而對(duì)Sm、Ofx、Km的耐藥率低于廣西以往的報(bào)道(53.9%、44.2%和5.6%)[14]，也低于海南省(54.69%、51.56%和10.94%)[12]，提示Sm、Ofx和Km對(duì)MDR-TB仍有一定的治療價(jià)值，但仍需加強(qiáng)對(duì)其耐藥性的監(jiān)測(cè)。耐藥形式以耐INH和RFP最為多見，與周云等[12]、喻容等[15]研究結(jié)果一致，也與以往的報(bào)道一致[14]。

北京基因型是多個(gè)國(guó)家和地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌株，導(dǎo)致了MDR-TB的暴發(fā)，一直以來都備受全球關(guān)注[16]。本研究采用McSpoligotyping對(duì)收集到的51株MDR-MTB菌株進(jìn)行了基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)北京基因型占56.86%，略低于以往的報(bào)道(58.29%)[17]，低于福建省(67.23%)[16]、河南省(83.53%)[18]和陜西省(86.21%)[19]，而略高于四川省(55.73%)和貴州省(55.13%)[17]，進(jìn)一步體現(xiàn)了北京基因型的分布具有地區(qū)差異，表明北京基因型是廣西MDR-MTB的主要流行菌株，因此在今后的研究工作中，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該基因型菌株的相關(guān)研究，進(jìn)一步了解其流行和傳播規(guī)律，以便更好地控制MDR-TB的流行。本研究發(fā)現(xiàn)，非北京基因型菌株占43.14%，包括T、U、MANU家族及新發(fā)現(xiàn)基因型，其中T家族所占的比例最大。T家族主要流行于中南美洲地區(qū)，而在本研究中，T家族占非北京基因型的50.00%，這可能與廣西地處中越邊境、西南大通道和東盟橋頭堡等特殊地理位置，對(duì)外貿(mào)易頻繁，人口流動(dòng)性較大有關(guān)，提示應(yīng)加強(qiáng)對(duì)流動(dòng)人口結(jié)核病的篩查和管理力度。新發(fā)現(xiàn)基因型菌株占全部菌株的15.69%，有待做進(jìn)一步的研究。

雖然有資料報(bào)道北京基因型與INH、RFP、Ofx等藥品耐藥有關(guān)，與MDR呈強(qiáng)相關(guān)[2-3]，但一項(xiàng)關(guān)于中國(guó)南方地區(qū)MTB北京基因型與耐藥相關(guān)性的研究結(jié)果卻顯示[20]，盡管北京基因型對(duì)任一藥品的耐藥率均高于非北京基因型，但除Sm外，其他藥品耐藥與否與是否為北京基因型不相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)北京基因型對(duì)EMB、Sm、Ofx、Km的耐藥率均高于非北京基因型，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與以往的報(bào)道一致[17]，也與林淑芳等[16]、Liu等[21]研究結(jié)果一致。由此可見，北京基因型與耐藥的相關(guān)性存在爭(zhēng)議，這可能是由于地區(qū)差異而引起，也有可能與本研究所收集到的樣本量較少有關(guān)。因此下一步應(yīng)擴(kuò)大樣本量以發(fā)現(xiàn)廣西北京基因型與耐藥的可能相關(guān)性。

綜上所述，廣西MDR-MTB對(duì)EMB的耐藥率較高，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)該藥品的監(jiān)測(cè)，此外還應(yīng)關(guān)注MDR-MTB 對(duì)其他藥品的耐藥性。北京基因型為主要流行菌株，與EMB、Sm、Ofx、Km耐藥無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。該結(jié)論對(duì)廣西MDR-TB的防控措施的制定有一定的指導(dǎo)作用。當(dāng)然，本研究尚存在不足之處，即未對(duì)其他常用藥品(如吡嗪酰胺、左氧氟沙星等)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，未能評(píng)估北京基因型與其他藥品耐藥的相關(guān)性，且由于樣本量較少未能對(duì)該地區(qū)MDR-MTB基因型與社會(huì)人口學(xué)資料(如性別、年齡等)、人口流動(dòng)性、疾病進(jìn)展等的相關(guān)性進(jìn)行深入探討，這也將成為下一步的研究工作。