不同培養(yǎng)液及微滴內(nèi)卵母細(xì)胞數(shù)等因素對(duì)肉牛體外胚胎生產(chǎn)效率的影響

王 娜，李 姣，郭 晶，張?jiān)聵?，趙明禮，郝少?gòu)?qiáng)，郭春明，王小武*，馬 毅

(1.天津中科博雅生物育種研究有限公司，天津300347；2.全國(guó)畜牧總站，北京100125；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津300381)

胚胎生物技術(shù)是良種肉牛培育及快速擴(kuò)繁的有效技術(shù)手段，其中活體采卵-體外胚胎生產(chǎn)(OPU-IVP)技術(shù)通過(guò)活體采集優(yōu)秀個(gè)體卵母細(xì)胞，經(jīng)體外成熟(IVM)、體外受精(IVF)、胚胎體外培養(yǎng)(IVC)等，在體外條件下可快速獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)胚胎。相比體內(nèi)胚胎，其生產(chǎn)效率高達(dá)4～8倍，能有效提升優(yōu)良母畜繁殖潛力[1]。目前，國(guó)外牛OPU-IVP技術(shù)已達(dá)到較高水平[2-4]，部分地區(qū)已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用。但我國(guó)在該技術(shù)領(lǐng)域仍處于基礎(chǔ)研究階段，技術(shù)成果分散，且不同培養(yǎng)體系OPU-IVP的生產(chǎn)效率參差不齊，尚不能形成統(tǒng)一、高效、穩(wěn)定的配套體系用于商業(yè)化推廣。影響牛OPU-IVP效率的因素較多，現(xiàn)有研究多集中于通過(guò)在培養(yǎng)液中添加某種物質(zhì)[5-6]或優(yōu)化供體牛激素處理方案等[3,7-9]途徑來(lái)提高培養(yǎng)效率，而且卵母細(xì)胞培養(yǎng)方式主要以混合培養(yǎng)為研究基礎(chǔ)。但對(duì)于OPU來(lái)源的卵母細(xì)胞而言，需要按照牛只單獨(dú)培養(yǎng)以明確系譜。而卵母細(xì)胞培養(yǎng)液種類、單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)微滴內(nèi)卵母細(xì)胞數(shù)等因素對(duì)肉牛OPU-IVP效率的影響，目前國(guó)內(nèi)研究較少。因此，有必要探討不同培養(yǎng)液和培養(yǎng)方式對(duì)肉牛體外胚胎生產(chǎn)效率的影響，以期為肉牛OPU-IVP技術(shù)在我國(guó)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 卵母細(xì)胞及凍精 肉牛卵巢采自河北大廠屠宰場(chǎng)，置于含雙抗的0.9%生理鹽水(30～33 ℃)的保溫桶中，2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室?；铙w采集的卵母細(xì)胞來(lái)自天津中科博雅生物育種研究有限公司良繁場(chǎng)16～18月齡安格斯牛。凍精(牛號(hào)：020AN10820；生產(chǎn)日期：20170519)購(gòu)自先馬士商貿(mào)(上海)有限公司。

1.2 試劑耗材

1.2.1 主要試劑 Ⅰ組培養(yǎng)液(BO系列培養(yǎng)液，包括BO-Hepes-IVM；BO-IVF；BO-IVC等)購(gòu)自英國(guó)IVF bioscience公司，該系列培養(yǎng)液以平衡鹽溶液、磷酸氫鈉、谷氨酰胺、葡萄糖、牛血清白蛋白(BSA)、慶大霉素等為基礎(chǔ)成分，BO-Hepes-IVM另含Hepes緩沖液、促性腺激素；BO-IVF另含肝素、牛磺酸、腎上腺素；BO-IVC另含透明質(zhì)酸鹽、乳酸鹽、維生素、氨基酸、抗氧化劑、生長(zhǎng)激素等。Ⅱ組培養(yǎng)液(包括IVM液[10]；IVF液[11]；mCR1aa液[12]等)參照文獻(xiàn)進(jìn)行配制；TCM199和胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司；促卵泡素(FSH)注射液購(gòu)自北京畢威克生物技術(shù)有限責(zé)任公司，其余試劑均購(gòu)自Sigma公司。

1.2.2 主要設(shè)備 活體采卵儀(Easi-Scan Micro-Convex)購(gòu)自英國(guó)BCF公司；真空泵(19884/0603)和卵母細(xì)胞保溫運(yùn)輸箱(19180/0010)購(gòu)自美國(guó)MOFA公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)以屠宰場(chǎng)卵巢為卵母細(xì)胞來(lái)源，對(duì)比Ⅰ組培養(yǎng)液(BO-Hepes-IVM；BO-IVF；BO-IVC等)與Ⅱ組培養(yǎng)液(IVM液；IVF液；mCR1aa液等)對(duì)卵母細(xì)胞成熟、體外受精和IVP效率的影響；(2)以屠宰場(chǎng)卵巢為卵母細(xì)胞來(lái)源，將培養(yǎng)體系分為4組，微滴(100 μL/滴)內(nèi)卵母細(xì)胞數(shù)分別為5、10、15和20枚，探索不同卵母細(xì)胞數(shù)對(duì)胚胎發(fā)育能力的影響；(3)以O(shè)PU為卵母細(xì)胞來(lái)源，將培養(yǎng)體系分為<10枚/滴和≥10枚/滴2組，探索不同卵母細(xì)胞數(shù)對(duì)OPU胚胎發(fā)育能力的影響。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 屠宰場(chǎng)卵母細(xì)胞采集和體外成熟 牛卵巢洗滌后抽取表面2～8 mm的卵泡，撿出包裹卵丘細(xì)胞3層及以上的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，洗滌液洗去多余雜質(zhì)后，用成熟液(BO-Hepes-IVM；IVM液：TCM199+0.01 IU/mL LH+0.01 IU/mL FSH+1 μg/mL E2+10% FBS)洗滌2遍，最后放入平衡2 h的成熟液中，置于培養(yǎng)箱中(38.8 ℃，5.5%CO2，飽和濕度)培養(yǎng)22～24 h。成熟的COCs放入0.1%的透明質(zhì)酸酶中，消化1～2 min去除其周圍卵丘細(xì)胞，再加入終止液(TCM199+10%FBS)終止消化作用，最后在體視顯微鏡下觀察，排出第一極體的為成熟卵母細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)成熟率。

1.4.2 OPU卵母細(xì)胞采集和體外成熟 FSH遞減注射法進(jìn)行超排處理，B超引導(dǎo)穿刺牛卵巢上直徑為2～8 mm的卵泡，卵泡液回收后撿出卵丘細(xì)胞包裹3層及以上的COCs，放入盛有500 μL BO-Hepes-IVM液的1.5 mL離心管中，置于保溫運(yùn)輸箱(38 ℃)中，2 h內(nèi)運(yùn)回IVP實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

1.4.3 體外受精 參考文獻(xiàn)[11]中的方法，將體外培養(yǎng)成熟的COCs經(jīng)受精液(BO-IVF；IVF液：基礎(chǔ)液+20 μg/mL 肝素+20 mg/mL BSA)洗滌2遍后，轉(zhuǎn)移入預(yù)先平衡2 h的受精液中，放入培養(yǎng)箱待用。將凍精從液氮中取出，37 ℃無(wú)菌水中解凍，剪開凍精細(xì)管，使精液流入盛有洗精液的15 mL離心管中，離心機(jī)離心(328×g；1500r/min)2次，每次5 min，棄掉上清液，留離心管底部沉淀，最后加入300 μL受精液重懸精子沉淀。用精子計(jì)數(shù)板計(jì)算其精子濃度，向受精培養(yǎng)液中加入計(jì)算好的精液量，使其最終的受精濃度為1.0～2.0×106個(gè)/mL，在培養(yǎng)箱中(38.8 ℃，5.5%CO2，飽和濕度)精卵共孵育16～18 h。

1.4.4 早期胚胎體外培養(yǎng) 受精卵培養(yǎng)16～18 h后，放入胚胎培養(yǎng)液中(BO-IVC；mCR1aa液：基礎(chǔ)液+6 mg/mL BSA+0.15 mg/mL谷氨酰胺+10 μL/mL 非必需氨基酸+20 μL/mL 必需氨基酸)洗滌，用移液槍反復(fù)輕輕吹打以去除周圍卵丘細(xì)胞和精子，再放入預(yù)先平衡2 h的胚胎培養(yǎng)液中培養(yǎng)。BO-IVC培養(yǎng)過(guò)程中不更換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為38.8 ℃，5.5%CO2，6% O2，飽和濕度。mCR1aa在第2 d更換為mCR1aa+10%FBS，以后每隔48 h半量更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件為38.8 ℃，5.5%CO2，飽和濕度。培養(yǎng)過(guò)程中，第2 d統(tǒng)計(jì)卵裂及8-16細(xì)胞率，第7 d統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次及以上，所得數(shù)據(jù)用SAS軟件進(jìn)行分析，對(duì)百分?jǐn)?shù)進(jìn)行比較時(shí)先經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)化再采用方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)液效率比較

兩種成熟液對(duì)牛COCs成熟的影響如圖1所示，BO-Hepes-IVM液培養(yǎng)的牛COCs卵丘擴(kuò)散及粘連程度高于IVM液，成熟率顯著高于IVM液(P<0.05，見表1)。成熟卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精后，兩組培養(yǎng)液在卵裂率方面無(wú)顯著差異(P>0.05)，但Ⅰ組培養(yǎng)液的8～16細(xì)胞率及囊胚率顯著高于Ⅱ組培養(yǎng)液(P<0.05)(見表2)。

2.2 屠宰場(chǎng)來(lái)源卵母細(xì)胞數(shù)對(duì)胚胎發(fā)育能力的影響

選用Ⅰ組培養(yǎng)液，微滴培養(yǎng)屠宰場(chǎng)來(lái)源卵母細(xì)胞，各組卵裂率無(wú)顯著差異(P>0.05)，5、10、15枚/滴三組的8～16細(xì)胞率也無(wú)顯著差異(P>0.05)，但20枚/滴組的8～16細(xì)胞率顯著高于其他3組(P<0.05)，就囊胚率而言，20枚/滴組顯著高于5枚/滴組(P<0.05)，與10、15枚/滴兩組無(wú)顯著差異(P>0.05)(見表3)。進(jìn)一步分析，微滴內(nèi)卵母細(xì)胞數(shù)≥10枚/滴組的8～16細(xì)胞率及囊胚率顯著高于<10枚/滴組(P<0.05)。

表1 兩種成熟液對(duì)牛COCs成熟率的影響Table 1 Effects of two mature mediums on the maturation rates of bovine COCs %

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

Note: In the same column, different letter superscripts mean significant differences (P<0.05), the same letter or no letter superscripts mean insignificant difference (P>0.05).The same below.

表2 不同培養(yǎng)液對(duì)牛IVP效率的影響Table 2 Effects of different culture mediums on the bovine IVP rates %

2.3 OPU卵母細(xì)胞數(shù)對(duì)胚胎發(fā)育能力的影響

本試驗(yàn)獲得的頭均可用OPU卵母細(xì)胞數(shù)在3～21之間，每頭牛之間單獨(dú)微滴培養(yǎng)，結(jié)果表明，兩組卵裂率無(wú)顯著差異(P>0.05)，但≥10枚/滴的8～16細(xì)胞率及囊胚率顯著高于<10枚/滴組(P<0.05)(見表4)。

表3 微滴內(nèi)卵母細(xì)胞數(shù)對(duì)牛胚胎生產(chǎn)效率的影響Table 3 Effects of the number of oocytes in droplets on the production efficiency of bovine embryos %

3 討 論

3.1 不同培養(yǎng)液對(duì)肉牛體外胚胎生產(chǎn)效率的影響

目前我國(guó)肉牛良種覆蓋率低，提高牛OPU-IVP效率對(duì)發(fā)揮優(yōu)良種質(zhì)資源，推進(jìn)我國(guó)牛業(yè)發(fā)展具有重要意義[13]。本研究比較了兩組培養(yǎng)液對(duì)肉牛卵母細(xì)胞成熟及后續(xù)發(fā)育能力的影響，結(jié)果表明BO-Hepes-IVM的成熟率顯著高于配制的IVM液，這可能與BO-Hepes-IVM中添加了少量葡萄糖有關(guān)。已有研究表明，葡萄糖作為唯一的能量來(lái)源，卵母細(xì)胞不能直接利用，需要依賴周圍的卵丘細(xì)胞將其代謝為丙酮酸后，通過(guò)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體并經(jīng)線粒體呼吸鏈代謝支持卵母細(xì)胞核成熟[14]，成熟液中添加少量葡萄糖可促進(jìn)牛卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，較快達(dá)到核成熟階段，而高濃度的葡萄糖則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)含量升高，使卵母細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，損傷細(xì)胞膜、線粒體、核DNA等，造成卵母細(xì)胞發(fā)育能力下降或凋亡[15-16]。

表4 微滴內(nèi)OPU卵母細(xì)胞數(shù)對(duì)牛胚胎生產(chǎn)效率的影響Table 4 Effects of the number of OPU oocytes in droplets on the production efficiency of bovine embryos %

兩組培養(yǎng)體系對(duì)卵母細(xì)胞體外受精后的卵裂率無(wú)顯著影響，這與Somfai等[17]對(duì)比IVD101培養(yǎng)液與CR1aa培養(yǎng)液在卵裂率方面的研究結(jié)果一致；但在8～16細(xì)胞率及囊胚率方面，Ⅰ組培養(yǎng)液顯著高于Ⅱ組培養(yǎng)液，這可能與BO-Hepes-IVM較好的成熟效果和BO-IVC一步式培養(yǎng)所營(yíng)造的全程低氧(6%)氣體條件有關(guān)。一方面卵母細(xì)胞充分成熟是成功受精的前提[18]，另一方面胚胎培養(yǎng)過(guò)程中使用的O2濃度是牛體外胚胎產(chǎn)量的重要決定因素[19]?，F(xiàn)階段國(guó)內(nèi)體外胚胎培養(yǎng)體系大多使用20%的O2濃度，而高O2濃度培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生增加，損傷細(xì)胞的線粒體功能，導(dǎo)致胚胎死亡[20]。并且有研究證實(shí)當(dāng)O2濃度從20%降至5%時(shí)，可觀察到胚胎發(fā)育率明顯增加[20-22]。而對(duì)于Ⅱ組培養(yǎng)液，使用的是20%的O2濃度，并且在后期培養(yǎng)過(guò)程中需要頻繁更換培養(yǎng)液，增加了對(duì)胚胎發(fā)育的人為干擾，可能是造成該培養(yǎng)體系效率低的主要原因。因此，Ⅰ組培養(yǎng)液更適合OPU卵商業(yè)化推廣使用。

3.2 微滴內(nèi)不同卵母細(xì)胞數(shù)對(duì)肉牛體外胚胎生產(chǎn)效率的影響

在早期胚胎培養(yǎng)過(guò)程中，胚胎可以產(chǎn)生多種生長(zhǎng)因子(IGF-1，TGF-α，PDGF，EGF等)以自分泌和旁分泌的方式促進(jìn)自身或鄰近的胚胎發(fā)育和分化，另外胚胎體外發(fā)育還具有密度依賴性，在相對(duì)較小的體積內(nèi)有較快的發(fā)育，這可以將自分泌因子的影響作用發(fā)揮到最大化[23-24]，因此，增加單位體積內(nèi)胚胎數(shù)量可以提高胚胎發(fā)育率。但較小體積也容易使有害代謝產(chǎn)物堆積，又不利于胚胎發(fā)育[24]。由此可見，一定體積內(nèi)合適的胚胎培養(yǎng)數(shù)量對(duì)提高胚胎發(fā)育效率至關(guān)重要。本研究通過(guò)屠宰場(chǎng)來(lái)源卵母細(xì)胞進(jìn)行微滴培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果表明5、10、15枚/滴3組之間的卵裂率無(wú)顯著差異，但8～16細(xì)胞率顯著低于20枚/滴，后期培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)5枚/滴的囊胚率顯著低于20枚/滴，說(shuō)明5枚/滴組中，胚胎之間的自分泌因子效應(yīng)較弱。而10、15枚/滴的最終囊胚率與20枚/滴無(wú)顯著差異，說(shuō)明10枚及以上的COCs單獨(dú)微滴(100 μL/滴)培養(yǎng)可以獲得較為理想的培養(yǎng)效果，并且以10枚為分界，合并數(shù)據(jù)分析也表明≥10枚/滴組的8～16細(xì)胞率及囊胚率顯著高于<10枚/滴組，這為OPU卵母細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)提供了實(shí)踐參考。

肉牛OPU卵母細(xì)胞微滴培養(yǎng)結(jié)果表明，滴內(nèi)卵母細(xì)胞數(shù)不會(huì)顯著影響其卵裂率，但培養(yǎng)10枚及以上COCs的8～16細(xì)胞率及囊胚率顯著高于10枚以下組的結(jié)果，這與屠宰場(chǎng)來(lái)源卵母細(xì)胞分組培養(yǎng)結(jié)果一致，但培養(yǎng)效率高于屠宰場(chǎng)來(lái)源的卵母細(xì)胞，與以往早期研究結(jié)論一致[25-26]，但與許紅喜等[27]的研究結(jié)論相反，可能是不同技術(shù)人員所用的卵母細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量不同導(dǎo)致的。此外，本研究中的培養(yǎng)效率高于周木清[28]、江明生等[29]在奶牛OPU卵上的培養(yǎng)結(jié)果，也高于和占星等[30]在BMY牛OPU卵上的培養(yǎng)結(jié)果，說(shuō)明本試驗(yàn)所采用的肉牛OPU卵母細(xì)胞培養(yǎng)方式可以為商業(yè)化推廣提供參考。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，Ⅰ組培養(yǎng)液操作簡(jiǎn)便，IVC過(guò)程無(wú)需更換培養(yǎng)液且效率穩(wěn)定，有助于牛OPU-IVP技術(shù)的快速產(chǎn)業(yè)化。肉牛OPU卵母細(xì)胞以微滴培養(yǎng)不低于10枚的方式單獨(dú)培養(yǎng)，可以獲得較高的囊胚發(fā)育率。