綿羊瘤胃中原蟲對(duì)葡萄糖和木糖的化學(xué)感知作用研究

崔爽青，李勝利，孫海洲，金 鹿，桑 丹，張春華，張崇志，邴新帥，白 剛

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3. 鄂爾多斯市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)

反芻動(dòng)物可將飼料中的淀粉和纖維素等碳水化合物降解，同時(shí)釋放出作為副產(chǎn)物的揮發(fā)性脂肪酸(VFA)，VFA經(jīng)瘤胃壁吸收后，可以滿足機(jī)體50%～70%的能量需求[1]。此外，流出瘤胃食糜中的微生物提供了動(dòng)物機(jī)體60%～70% 蛋白需求。Bach[2]指出，微生物蛋白的量取決于瘤胃內(nèi)可利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的量，以及瘤胃微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率。隨著家畜飼養(yǎng)方式由傳統(tǒng)放牧方式向集約化方向發(fā)展，大多數(shù)日糧也向高精料為主轉(zhuǎn)變以提高生產(chǎn)性能，在高精料條件下，瘤胃內(nèi)產(chǎn)生和流出的原蟲生物量也會(huì)隨之提高[3]。在較高飼養(yǎng)條件下，原蟲生物量可以占到瘤胃內(nèi)微生物生物總量的50%[4]。利用瘤胃細(xì)菌[5]和非瘤胃細(xì)菌[6]進(jìn)行的體外純培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，儲(chǔ)備碳水化合物甚至可以占到細(xì)胞重量的50%以上。在反芻家畜采食后，瘤胃內(nèi)的大量細(xì)菌和原蟲會(huì)將過(guò)量碳水化合物在體內(nèi)貯存，當(dāng)能量受限時(shí)進(jìn)行動(dòng)員[7-10]。在高精料和低蛋白日糧條件下，可能會(huì)由于日糧能氮同步性較差，飼喂后會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的碳水化合物過(guò)量，這些動(dòng)態(tài)變化更為明顯[7]。

當(dāng)飼料進(jìn)入到瘤胃中時(shí)，糖類、氨基酸和小肽等作為原蟲的化學(xué)感應(yīng)因子在瘤胃液中釋放開(kāi)來(lái)。等毛蟲通過(guò)化學(xué)感知作用來(lái)識(shí)別糖類濃度梯度，雖然從原蟲感知糖類到游動(dòng)之間有所滯后，但是這一行為與細(xì)胞內(nèi)糖原濃度有明顯相關(guān)性[11]。在飼喂后的奶牛瘤胃液中，等毛蟲的化學(xué)感知作用隨著降解產(chǎn)生的糖濃度降低和糖原貯存增加而降低，并最終留存在瘤胃中部[12]。當(dāng)奶牛瘤胃內(nèi)營(yíng)養(yǎng)底物充足時(shí)，等毛原蟲傾向于背側(cè)游動(dòng)游向食物進(jìn)行采食，采食完成后利用腹側(cè)游動(dòng)進(jìn)行下沉，并能夠在不同類型日糧下進(jìn)行整個(gè)類群的同步協(xié)作[13]。背向游動(dòng)會(huì)增加等毛原蟲流出瘤胃的幾率，對(duì)于估算瘤胃模型中原蟲的流通速率的估算具有重要意義。另一方面，隨著流出速率的增加，內(nèi)毛蟲和等毛蟲會(huì)加快生長(zhǎng)速率進(jìn)行補(bǔ)償。

葡萄糖和木糖分別為六碳糖和五碳糖，是日糧纖維降解的主要產(chǎn)物。葡萄糖很容易被微生物或機(jī)體進(jìn)一步代謝利用，但木糖的代謝過(guò)程往往會(huì)受到抑制。瘤胃原蟲中內(nèi)毛蟲占絕大部分，已有文獻(xiàn)報(bào)道多集中于等毛蟲。因此研究瘤胃內(nèi)毛蟲和等毛蟲對(duì)于不同濃度葡萄糖和木糖的化學(xué)感知作用，可以更好地認(rèn)識(shí)原蟲的碳水化合物營(yíng)養(yǎng)利用規(guī)律，預(yù)測(cè)瘤胃碳氮循環(huán)。

1 材料與方法

1.1 供體動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

選取三只體重相近(43.80±4.35)kg的鄂爾多斯細(xì)毛羊，安裝永久性瘤胃瘺管作為瘤胃液供體。每日早晚兩次等量飼喂，飲水充足。

1.2 試驗(yàn)試劑

MFS溶液：將甲基綠0.6 g、NaCl 8 g溶解至100 mL福爾馬林溶液中并定容至1 000 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同飼喂條件下瘤胃原蟲對(duì)葡萄糖的化學(xué)感知作用規(guī)律 分別在晨飼前0h和晨飼后3 h，采集三只瘺管綿羊的瘤胃內(nèi)不同部位瘤胃液，移入39.50 ℃預(yù)熱好的保溫瓶中并運(yùn)送至試驗(yàn)室，四層紗布過(guò)濾[11]。將過(guò)濾后瘤胃液用攪拌器充分混合，放入恒溫培養(yǎng)箱中39.50 ℃厭氧絮凝30 min，除去分層后的頂層食糜，取20 mL底層瘤胃液于50 mL燒杯中。

80 μL玻璃毛細(xì)管分別吸滿0、1、10、100和1 000 mM濃度的生理鹽水溶解的葡萄糖溶液，固體石蠟封口，每個(gè)處理四個(gè)平行樣本，同時(shí)插入不封口空毛細(xì)管(Empty Tubes,ET)作為瘤胃液原蟲種群豐度的參照。將毛細(xì)管開(kāi)口端斜向下插入裝有瘤胃液的小燒杯中(如圖1所示)，放入恒溫培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)，整個(gè)過(guò)程中需要在39℃恒溫水浴上操作，并持續(xù)通入二氧化碳保持厭氧環(huán)境。

培養(yǎng)20 min后，從燒杯中取出毛細(xì)管，用擦鏡紙擦干毛細(xì)管外壁。用膠頭將毛細(xì)管內(nèi)液體吹出至封口管中，并用MFS液1∶1的比例加入封口管中固定和染色原蟲。原蟲染色后過(guò)夜，用滴管將染色后液體轉(zhuǎn)移至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片計(jì)數(shù)。原蟲的感知作用強(qiáng)弱(趨向性)用填充某一濃度營(yíng)養(yǎng)素的玻璃毛細(xì)管中原蟲數(shù)目來(lái)反映，結(jié)果用×103個(gè)/mL表示。

1.3.2 瘤胃原蟲對(duì)木糖和葡萄糖的化學(xué)感知作用 采集綿羊晨飼后3 h的瘤胃液，混合后處理過(guò)程同1.3.1。在80 μL毛細(xì)管中，分別吸入0、1、10、50、100、250、500、750、1000mM等不同濃度的葡萄糖生理鹽水溶液和相應(yīng)的木糖生理鹽水溶液，固體石蠟封口，每個(gè)處理四個(gè)平行樣本，并插入不封口空毛細(xì)管(ET)作為瘤胃液內(nèi)原蟲種群豐度的參照。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010 軟件簡(jiǎn)單處理后，利用SAS 9.2軟件ANOVA過(guò)程對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan過(guò)程進(jìn)行多重檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃原蟲在不同飼喂條件下對(duì)葡萄糖的化學(xué)感知作用規(guī)律

由圖2可知，在不同條件下，內(nèi)毛蟲數(shù)量隨著葡萄糖濃度上升呈整體上升趨勢(shì)，但禁食條件下10、100 mM濃度和飼喂后100 mM濃度數(shù)量有所下降。兩種條件之間進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，飼喂?fàn)顟B(tài)對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果影響顯著(P<0.05)，1、10、100、1 000 mM各濃度水平下，飼喂后內(nèi)毛蟲對(duì)葡萄糖的趨向性要高于禁食條件下(P<0.05)，但禁食條件下0 mM濃度組內(nèi)毛蟲趨向性要高于飼喂后(P<0.05)，空管內(nèi)的內(nèi)毛蟲數(shù)量要遠(yuǎn)高于其他各組(P<0.05)；在各自飼喂條件下， 0、1、10、100 mM葡萄糖溶液間內(nèi)毛蟲趨向性差異不顯著(P>0.05)，但內(nèi)毛蟲對(duì)1 000 mM濃度趨向性顯著高于其他濃度(P<0.05)。內(nèi)毛蟲數(shù)量在空管ET中數(shù)量最高，在禁食和飼喂后分別達(dá)到944.44×103個(gè)/mL和1183.72×103個(gè)/mL，并且飼喂后高于禁食條件下(P<0.05)。

由圖3可知，在兩種不同條件下，除100 mM葡萄糖濃度外，1、10、1 000 mM各濃度以及空管中禁食條件下等毛蟲數(shù)量均高于飼喂條件下(P<0.05)，與內(nèi)毛蟲呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)；兩種條件下，等毛蟲對(duì)葡萄糖的趨向性隨著濃度的升高均呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢(shì)，100 mM時(shí)趨向性最高，1 000 mM時(shí)反而急劇下降。綜合兩種飼喂條件之間進(jìn)行比較，飼喂?fàn)顟B(tài)對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有相關(guān)性(P>0.05)。

從以上結(jié)果可以看出，對(duì)比空管內(nèi)原蟲數(shù)量，等毛蟲對(duì)葡萄糖趨向性比內(nèi)毛蟲明顯，內(nèi)毛蟲只對(duì)高濃度葡萄糖溶液表現(xiàn)出明顯趨向性。

注：同一飼喂條件下標(biāo)有不同小寫字母表示同組內(nèi)不同濃度間差異顯著(P<0.05)；同一濃度不同大寫字母表示禁食和飼喂兩組間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Under the same feeding condition, different lowercase letters mean significant differences in different concentrations of the same group (P<0.05). For the same concentration, different capital letters mean significant difference between fasting group and feeding group (P<0.05). The same blow.

2.2 瘤胃原蟲對(duì)木糖和葡萄糖化學(xué)感知作用規(guī)律

從圖4可以看出，在各個(gè)試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，瘤胃內(nèi)毛蟲對(duì)葡萄糖和木糖兩種單糖的趨向性都具有顯著差異(P<0.05)。當(dāng)濃度在1 mM 至750 mM范圍內(nèi)時(shí)，內(nèi)毛蟲對(duì)葡萄糖和木糖趨向性隨濃度增加呈緩慢上升趨勢(shì)，相鄰濃度間差異不顯著(P>0.05)，特別是木糖組1 mM 至750 mM范圍內(nèi)趨向性差異不顯著(P>0.05)。但是當(dāng)單糖濃度達(dá)到1 000 mM時(shí)，內(nèi)毛蟲對(duì)木糖尤其是葡萄糖的趨向性迅速升高，均顯著高于其他濃度(P<0.05)。但是此時(shí)空管ET中的內(nèi)毛蟲數(shù)量仍然非常高，分別達(dá)到1065.34×103個(gè)/mL 和 1095.62×103個(gè)/mL，仍然顯著高于各試驗(yàn)濃度(P<0.05)。

從圖5可知，在1 mM 至1 000 mM各試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，瘤胃等毛蟲對(duì)葡萄糖和木糖兩種單糖間的趨向性差異顯著(P<0.05)，并且隨著糖濃度的升高均呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)。等毛蟲的趨向性在葡萄糖濃度100 mM、木糖濃度500 mM時(shí)分別達(dá)到最高，并且顯著高于同組內(nèi)其他各濃度數(shù)值(P<0.05)。

3 討 論

在禁食和飼喂兩種不同喂食條件下，瘤胃等毛蟲對(duì)100 mM濃度葡萄糖趨向性大于其他各濃度，而對(duì)更高濃度的1 000 mM葡萄糖趨向性反而下降。試驗(yàn)組葡萄糖毛細(xì)管內(nèi)的等毛蟲豐度要遠(yuǎn)高于未封口空管毛細(xì)管的等毛蟲豐度，說(shuō)明等毛蟲是糖的利用者所以趨向于葡萄糖。但當(dāng)葡萄糖濃度高達(dá)1 000 mM時(shí)，禁食條件下豐度顯著高于飼喂后，可能是由于高濃度的葡萄糖促使其進(jìn)行糖原儲(chǔ)存[14]。另外在此濃度時(shí)內(nèi)毛蟲數(shù)量急劇增加，可能限制了等毛蟲的聚集和養(yǎng)分利用，表現(xiàn)為趨向性反而下降[15]。

在禁食和飼喂兩種條件下，瘤胃內(nèi)毛蟲對(duì)0、1、10、100 mM各濃度梯度葡萄糖溶液間的趨向性差異不顯著，但是當(dāng)葡萄糖溶液濃度達(dá)到1000 mM時(shí)趨向性顯著增高。100 mM葡萄糖溶液內(nèi)的內(nèi)毛蟲數(shù)量反而低于10 mM，這可能是因?yàn)榈让x游動(dòng)速度比較快，100 mM濃度時(shí)等毛蟲濃度增高，將葡萄糖轉(zhuǎn)化利用并進(jìn)行糖原儲(chǔ)存，使底物濃度下降所致[16]。盡管等毛蟲在空管也就是瘤胃液中數(shù)量遠(yuǎn)少于內(nèi)毛蟲，但在對(duì)不同葡萄糖濃度梯度趨向性行為更加明顯。從1 mM到1 000 mM以及空管中飼喂組內(nèi)毛蟲趨向性均高于禁食組，可能是由于飼喂后瘤胃液中內(nèi)毛蟲數(shù)量快速增長(zhǎng)，造成空管中及濃度梯度中內(nèi)毛蟲數(shù)量均較禁食組高。

從總體趨勢(shì)上，等毛蟲對(duì)葡萄糖的趨向性高于木糖，大概是木糖的兩倍左右，但同時(shí)也表明等毛蟲識(shí)別糖類的化學(xué)感受器可能不具有特異性。隨著兩種糖濃度升高，等毛蟲對(duì)兩種糖的趨向性呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，在葡萄糖濃度100 mM、木糖濃度500 mM時(shí)趨向性最高。從趨向性趨勢(shì)來(lái)看，等毛蟲優(yōu)先利用葡萄糖，木糖消耗速度比較慢，所以木糖趨向性最高點(diǎn)比葡萄糖后移[16]。飼料中的游離葡萄糖或者淀粉等快速降解碳水化合物可能會(huì)引起瘤胃液內(nèi)葡萄糖濃度快速增高，而木糖需要細(xì)菌定植于纖維組織內(nèi)部釋放木聚糖酶緩慢分解木聚糖才能產(chǎn)生，因此木糖不太可能作為原蟲的主要化學(xué)感應(yīng)因子。與前一試驗(yàn)類似，內(nèi)毛蟲只對(duì)較高濃度(1 000 mM)葡萄糖溶液表現(xiàn)出明顯的趨向性。在其他非瘤胃原蟲中的纖毛蟲模型中也有對(duì)營(yíng)養(yǎng)素競(jìng)爭(zhēng)利用的類似報(bào)道[17]，四膜蟲細(xì)胞膜上的糖結(jié)合位點(diǎn)與瘤胃等毛蟲類似，為相對(duì)非特異性結(jié)合位點(diǎn)[18]。

4 結(jié) 論

原蟲對(duì)不同糖類的趨向性具有明顯差異，對(duì)葡萄糖的趨向性高于木糖；等毛蟲對(duì)葡萄糖、木糖趨向性比內(nèi)毛蟲更加明顯，內(nèi)毛蟲只對(duì)高濃度的糖類溶液表現(xiàn)出趨向性。