兩種水稻蛀莖害蟲(chóng)精氨酸激酶基因的克隆及序列分析

魯艷輝 鄭許松 田俊策 白琪 呂仲賢

摘要 精氨酸激酶（AK， EC 2.7.3.3）是昆蟲(chóng)體內(nèi)唯一的磷酸原激酶，參與能量代謝。為探究AK基因的作用，本文利用本實(shí)驗(yàn)室建立的cDNA文庫(kù)及RACE技術(shù)，分別從兩種重要的水稻蛀莖害蟲(chóng)稻蛀莖夜蛾Sesamia inferens和二化螟Chilo suppressalis中克隆獲得了AK基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并對(duì)其序列特征進(jìn)行分析。AK基因分別命名為SinAK（稻蛀莖夜蛾，GenBank登錄號(hào)：MK559476）和CsuAK（二化螟，MK559475），開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)為1 065 bp，編碼355個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為40.0 kDa，等電點(diǎn)為5.88。氨基酸序列分析結(jié)果顯示SinAK、CsuAK基因編碼的氨基酸序列具有AK典型的功能位點(diǎn)保守序列：底物識(shí)別域S62G63V64-Y67和酶活性中心序列CP（S/T）N（I/L）GT。氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析表明，SinAK與甜菜夜蛾、草地貪夜蛾和斜紋夜蛾的同源性最高，達(dá)95%以上，而CsuAK與印度谷螟、亞洲玉米螟的進(jìn)化關(guān)系較近，同源性在95%左右。SinAK、CsuAK與其他昆蟲(chóng)AK的氨基酸序列同源性也高于80%，而與部分脊椎動(dòng)物起同樣作用的肌酸激酶（CK）的同源性低于40%，說(shuō)明AK基因的功能是高度保守的，且與脊椎動(dòng)物CK同源性很低。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究SinAK和CsuAK的功能以及開(kāi)發(fā)以AK基因?yàn)榘袠?biāo)的、對(duì)高等動(dòng)物安全的害蟲(chóng)防治新技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 水稻蛀莖害蟲(chóng); 稻蛀莖夜蛾; 二化螟; AK基因; 克隆; 序列

中圖分類號(hào)： S 435.112.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019083

Cloning and sequence analysis of arginine kinase genes from two rice stem borer species

LU Yanhui， ZHENG Xusong， TIAN Junce， BAI Qi， L Zhongxian

（State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control， Institute of Plant Protection

and Microbiology of Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310021， China）

Abstract

Arginine kinase （AK， EC 2.7.3.3） is an important regulation factor of energy metabolism in insect species. Aimed to explore the role of AK genes， in this study， two AK genes， named SinAK （GenBank accession number： MK559476）， CsuAK （MK559475） were isolated from Sesamia inferens and Chilo suppressalis larvae， respectively， using cDNA library and RACE methods. Either cDNA sequence contained a 1 065 bp open reading frame （ORF） encoding a polypeptide of 355 amino acids with the predicted molecular weight and isoelectric point of 40.0 kD and 5.88， respectively. Amino acid sequence analysis showed that the SinAK and CsuAK sequences had the typical characteristics of arginine kinase， which contained the substrate recognition region S62G63V64-Y67 and the active site CP（S/T）N（I/L）GT. The results of sequence comparison and phylogenetic analysis showed that SinAK shared more than 95% amino acid sequence identity with AKs from Spodoptera exigua， Spodoptera frugiperda and Spodoptera litura， while CsuAK shared more than 95% amino acid sequence identity with AKs from Plodia interpunctella and Ostrinia furnacalis. The amino acid sequence identities of SinAK and CsuAK with other insect AKs were also higher than 80%， while those with creatine kinases （CK） which play the same role in some vertebrates were lower than 40%. These results indicated that the function of AKs gene is highly conserved but they shared very low homology with vertebrate CK. Our results lay a foundation for further study of the functions of SinAK and CsuAK， and for the development of new pest control technologies targeting AK genes， which is safe for higher animal.

Key words

rice stem borer; Sesamia inferens; Chilo suppressalis; AK gene; clone; sequence

磷酸原激酶是一大類酶的總稱，多位于動(dòng)物體內(nèi)能量消耗較大的組織，對(duì)動(dòng)物體內(nèi)能量的儲(chǔ)存、代謝和利用具有至關(guān)重要的作用[12]。精氨酸激酶（arginine kinase， AK， EC 2.7.3.3）是無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)主要的磷酸原激酶[3]，起著類似于脊椎動(dòng)物肌酸激酶（creatine kinase， CK）的作用，它通過(guò)催化精氨酸和ATP之間的可逆性反應(yīng)，將能量存儲(chǔ)于磷酸精氨酸的高能磷酸鍵中，或?qū)⒘姿峋彼岱纸猱a(chǎn)生ATP[4]。近年來(lái)，關(guān)于AK的研究主要集中在基因序列?；蚓幋a氨基酸，氨基酸序列決定著蛋白的空間構(gòu)型，因此，分析AK基因編碼的氨基酸序列及其特征，能夠明確酶的活性中心，為后續(xù)的AK功能研究奠定基礎(chǔ)[5]。迄今為止，人們已在鞘翅目、鱗翅目、膜翅目、直翅目、雙翅目和蜚蠊目等昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)AK[59]，并克隆分析了AK基因及其序列特征。主要包括南美沙漠蝗Schistocerca americana[10]、西方蜜蜂Apis mellifera[11]、印度谷螟Plodia interpunctella[12]、家蠶Bombyx mori[4， 13]、東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis[1415]、大紅芫菁Cissites cephalotes[16]、美洲大蠊Periplaneta americana[1718]、棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera[19]、紅火蟻Solenopsis invicta[20]、意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica[21]、煙青蟲(chóng)Helicoverpa assulta[22]、家蠅Musca domestica[23]等多種昆蟲(chóng)，推動(dòng)了昆蟲(chóng)AK相關(guān)研究工作的開(kāi)展。

稻蛀莖夜蛾（原稱大螟）Sesamia inferens（Walker）和二化螟Chilo suppressalis（Walker）是水稻的主要鉆蛀性害蟲(chóng)，是大部分水稻產(chǎn)區(qū)的蛀莖害蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)種，分別屬于鱗翅目夜蛾科Noctuidae和螟蛾科Pyralidae，東亞地區(qū)主要發(fā)生分布在中國(guó)、韓國(guó)、日本水稻產(chǎn)區(qū)，直接威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[24]。目前，對(duì)于水稻蛀莖害蟲(chóng)的防治，我國(guó)多施用化學(xué)藥劑。但由于化學(xué)藥劑的長(zhǎng)期、大量、不合理使用等原因，導(dǎo)致害蟲(chóng)抗藥性水平不斷提高，田間防效下降，從而加劇了蛀莖害蟲(chóng)危害，而且對(duì)環(huán)境生態(tài)安全和食品安全造成嚴(yán)重的影響。因此，在控制害蟲(chóng)抗藥性的策略上，篩選新的殺蟲(chóng)劑作用靶標(biāo)已成為農(nóng)藥創(chuàng)新領(lǐng)域的重要方向。

已有研究表明，AK是昆蟲(chóng)肌肉中唯一有效形成ATP 的磷?；w，這就意味著昆蟲(chóng)具有與脊椎動(dòng)物完全不同的能量代謝途徑[5， 1617， 22， 2526]，若將AK作為靶標(biāo)，開(kāi)發(fā)害蟲(chóng)防治新技術(shù)，不僅可以開(kāi)辟害蟲(chóng)分子調(diào)控的新領(lǐng)域，而且對(duì)高等動(dòng)物也比較安全[22， 27]。本文以兩種重要的水稻害蟲(chóng)為研究對(duì)象，利用本實(shí)驗(yàn)室建立的cDNA文庫(kù)和RACE技術(shù)，克隆其AK基因并分析該基因的序列特征，旨在為深入研究AK的表達(dá)、調(diào)控、功能以及探求水稻蛀莖害蟲(chóng)綠色防控的分子靶標(biāo)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

稻蛀莖夜蛾和二化螟室內(nèi)種群采自浙江省杭州市蕭山區(qū)義橋鎮(zhèn)（30°07′ N， 120°21′ E）水稻田，采用人工飼料在人工氣候室飼養(yǎng)，飼料配方及飼養(yǎng)方法參考中國(guó)水稻研究所的方法（稻蛀莖夜蛾[28]，二化螟[29]）。飼養(yǎng)條件：溫度 27℃±1℃，相對(duì)濕度（70±5）%，光周期L∥D=16 h∥8 h。成蟲(chóng)利用10%的蜂蜜水飼養(yǎng)。

1.2 總RNA提取

兩種蛀莖害蟲(chóng)總RNA的提取采用TRIzol試劑，具體步驟參照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)（Invitrogen）。取1 μL RNA樣品測(cè)定OD260/280（Nanodrop 2000），比值在1.8～2.2之間的樣品用于cDNA合成。

1.3 AK基因全長(zhǎng)序列的獲得

通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室建立的稻蛀莖夜蛾和二化螟cDNA文庫(kù)測(cè)序，分別獲得了這兩種水稻害蟲(chóng)AK基因的cDNA序列，利用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)RACE引物（表1）。取這兩種害蟲(chóng)的3齡幼蟲(chóng)，按照上述操作步驟提取總RNA，取1.0 μg RNA，按照RACE試劑盒（TaKaRa-Clontech）的操作說(shuō)明合成5′RACE-Ready cDNA和3′RACE-Ready cDNA。用RACE引物F1和R1分別與試劑盒提供的UPM引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，以RACE引物F2和R2分別與試劑盒提供的NUP引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。兩輪PCR擴(kuò)增程序同為：95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。擴(kuò)增片段與pMD-18T載體（TaKaRa）連接，轉(zhuǎn)化，菌落PCR鑒定正確后進(jìn)行測(cè)序（南京擎科生物科技有限公司）。

1.4 序列分析

測(cè)序結(jié)果采用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，獲得兩種水稻害蟲(chóng)AK基因的全長(zhǎng)cDNA序列。序列同源性比對(duì)采用ClustalW軟件（http：∥www.genome.jp/tools/clustalw/）。利用MEGA 5.1軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種水稻害蟲(chóng)AK基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆與特征分析

克隆獲得兩種水稻害蟲(chóng)AK基因的全長(zhǎng)cDNA序列，分別命名為SinAK（稻蛀莖夜蛾）和CsuAK（二化螟）。SinAK基因cDNA全長(zhǎng)為1 422 bp，CsuAK基因cDNA全長(zhǎng)為1 597 bp。開(kāi)放閱讀框（ORF）均為1 065 bp，編碼355個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白的分子量為40 kDa，等電點(diǎn)為5.88。GenBank登錄號(hào)分別為，稻蛀莖夜蛾MK559476、二化螟MK559475（圖1～2）。預(yù)測(cè)到一個(gè)底物識(shí)別域S62G63V64-Y67;酶活性中心序列CP（S/T）N（I/L）GT，位于氨基酸270-276;一個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合域ENKTFLVWCNE，位于氨基酸213-223（圖1～2）。

2.2 兩種水稻害蟲(chóng)與其他動(dòng)物AK或CK序列的比對(duì)

將克隆獲得的稻蛀莖夜蛾和二化螟AK基因與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中注冊(cè)的部分昆蟲(chóng)AK和其他物種的CK編碼氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與鱗翅目昆蟲(chóng)的AK基因編碼的氨基酸序列同源性最高，在90%以上;與其他昆蟲(chóng)，例如褐飛虱Nilaparvata lugens（Stl）（半翅目）和黑腹果蠅Drosophila melanogaster（雙翅目）的同源性較高，在80%左右;與幾種害蟲(chóng)的天敵昆蟲(chóng)如蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum、茶足柄瘤蚜繭蜂Lysiphlebus testaceipes、小峰熊蜂Bombus hypocrita、二化螟盤絨繭蜂Cotesia chilonis的同源性也較高，在80%左右;而與人Homo sapiens、電鰩Tetronarce californica、褐家鼠Rattus norvegicus的CK的同源性較低，低于40%（圖3，表2）。

2.3 兩種水稻害蟲(chóng)與其他動(dòng)物AK或CK序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

采用MEGA 5.1軟件對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)的部分昆蟲(chóng)的AK和部分脊椎動(dòng)物的肌酸激酶的氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化樹(shù)顯示兩個(gè)大的分支，一支為精氨酸激酶類，另一支為肌酸激酶類（圖4）。進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果顯示：SinAK和CsuAK氨基酸序列歸屬于AK分支。SinAK與甜菜夜蛾Spodoptera exigua、草地貪夜蛾S.frugiperda和斜紋夜蛾S.litura的同源性最高，達(dá)95%左右;CsuAK與印度谷螟Plodia interpunctella、亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis的進(jìn)化關(guān)系較近，同源性在95%左右;雖然與幾種害蟲(chóng)的天敵昆蟲(chóng)如蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum、茶足柄瘤蚜繭蜂Lysiphlebus testaceipes、小峰熊蜂Bombus hypocrita也屬于同一AK分支，但同源性相對(duì)低一些，在80%左右（圖4）。

3 討論

目前，人們?cè)诙喾N昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)AK，主要集中在鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、直翅目、雙翅目和蜚蠊目中。許多研究表明，AK是昆蟲(chóng)體內(nèi)唯一能夠形成有效ATP 的磷酰基供體[5]，但關(guān)于稻蛀莖夜蛾和二化螟這兩種重要水稻害蟲(chóng)AK基因的研究相對(duì)較少。本研究利用已建立的cDNA文庫(kù)和RACE技術(shù)，獲得稻蛀莖夜蛾和二化螟AK基因cDNA全長(zhǎng)序列，分別命名為SinAK（GenBank登錄號(hào)：MK559476）和CsuAK（GenBank登錄號(hào)：MK559475）。ORF均為1 065 bp，編碼355個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白的分子量為40 kDa，等電點(diǎn)為5.88。這與NCBI中注冊(cè)的大部分昆蟲(chóng)AK相似。氨基酸序列中預(yù)測(cè)到一個(gè)底物識(shí)別域S62G63V64-Y67，酶活性中心序列CP（S/T）N（I/L）GT，一個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合域ENKTFLVWCNE，其中酶活性中心序列中含有保守的半胱氨酸C270，這些都是AK基因的功能位點(diǎn)。Gattis等研究表明，酶活性中心序列中的半胱氨酸在精氨酸激酶的催化過(guò)程中起關(guān)鍵作用[31]。將克隆獲得的SinAK、CsuAK與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)的其他昆蟲(chóng)AK基因進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其與鱗翅目昆蟲(chóng)的AK基因編碼的氨基酸序列同源性最高，在90%以上;與褐飛虱和黑腹果蠅的同源性較高，高于80%，且上述幾個(gè)功能位點(diǎn)都是高度保守的，說(shuō)明AK基因的功能是高度保守的[32]。而SinAK、CsuAK與部分脊椎動(dòng)物，比如人、電鰩、倉(cāng)鼠的肌酸激酶的同源性低于40%。進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果顯示SinAK與甜菜夜蛾、草地貪夜蛾和斜紋夜蛾的同源性最高，達(dá)95%左右;CsuAK與印度谷螟、亞洲玉米螟的進(jìn)化關(guān)系較近，同源性在95%左右，這應(yīng)該與昆蟲(chóng)的分類地位相關(guān)，稻蛀莖夜蛾與甜菜夜蛾、草地貪夜蛾、斜紋夜蛾同屬于鱗翅目夜蛾科，而二化螟與印度谷螟和亞洲玉米螟同屬于鱗翅目螟蛾科。

精氨酸激酶是昆蟲(chóng)能量代謝途徑中的關(guān)鍵酶，且僅存在于無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)，與脊椎動(dòng)物中起同樣作用的肌酸激酶序列同源性較低，可作為害蟲(chóng)防治的一個(gè)分子靶標(biāo)。本文結(jié)果為揭示稻蛀莖夜蛾、二化螟AK的基因功能奠定基礎(chǔ)，為利用以SinAK、CsuAK基因?yàn)榘袠?biāo)的水稻綠色防控技術(shù)的研發(fā)提供了基礎(chǔ)依據(jù)。雖然以AK基因?yàn)榘袠?biāo)的防控策略可以保證脊椎動(dòng)物的安全，但天敵昆蟲(chóng)的AK基因序列與害蟲(chóng)較為相似，以AK基因?yàn)榘袠?biāo)可能會(huì)作用于天敵。幸運(yùn)的是天敵與害蟲(chóng)的AK基因同源性為80%左右，因此仍有空間尋找對(duì)害蟲(chóng)特異性的靶標(biāo)，導(dǎo)入雙鏈RNA（dsRNA）干擾AK基因的功能，從而導(dǎo)致害蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育受阻，甚至死亡。在后續(xù)的工作中我們將側(cè)重于在害蟲(chóng)與天敵AK基因差異較大的序列區(qū)域開(kāi)展?jié)撛诘奶禺愋园袠?biāo)研究。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）

收稿日期： 20190226?? 修訂日期： 20190627

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31672050）;浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018C02032）;浙江省“三農(nóng)六方”科技協(xié)作項(xiàng)目（CTZB-F170623LWZ-SNY1）

致? 謝： 參加本試驗(yàn)部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀(jì)燁斌等同學(xué)，特此一并致謝。

通信作者?E-mail：luzxmh@163.com

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