甘薯G病毒吉林分離物的全基因組序列測定與分析

馬俊豐 李小宇 張春雨 周雪平 王永志

摘要? 利用RT-PCR結(jié)合RACE方法，從感染SPVG的甘薯葉片中獲得甘薯G病毒吉林分離物Jilin-gzl的全基因組序列。測序獲得的Jilin-gzl分離物（GenBank No.Mk392509）基因組為10 797 nt。該病毒基因組含有一個(gè)10 464 nt的開放閱讀框，編碼由3 488個(gè)氨基酸構(gòu)成的多聚蛋白。在P1和P3基因中也發(fā)現(xiàn)了由移碼翻譯產(chǎn)生的PISPO蛋白和PIPO蛋白。比對(duì)分析顯示，在開放閱讀框水平上Jilin-gzl與6個(gè)不同分離物核苷酸序列一致性為79%～99%，氨基酸一致性為92%～99%，其中與SC11、IS103、HG167和Jesus_Maria分離物一致性最高，與WT325和AI一致性最低。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，Jilin-gzl與HG167和WCFR11系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，與中國臺(tái)灣地區(qū)分離物WT325系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)。這是中國大陸地區(qū)關(guān)于SPVG分離物全基因序列的首次報(bào)道，同時(shí)也是首次在中國東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)SPVG。該研究探明了Jilin-gzl分離物的基因結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，豐富了SPVG基因組序列信息，為后續(xù)開展SPVG種群的遺傳進(jìn)化及功能研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞? 甘薯G病毒（SPVG）; 全基因組; 比對(duì)分析; 系統(tǒng)發(fā)育

中圖分類號(hào)： S 432.41

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019163

Complete genome sequencing and analysis of Sweet potato

virus G isolate from Jilin， China

MA Junfeng1，2， LI Xiaoyu2， ZHANG Chunyu2， ZHOU Xueping3， WANG Yongzhi2

（1. Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China; 2. Jilin Academy of Agricultural

Sciences， Gongzhuling 136100， China; 3. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of

Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

The complete genome of Jilin-gzl was determined by using rapid-amplification of cDNA ends （RACE） and RT-PCR. The complete sequence of Jilin-gzl （GenBank No.Mk392509） had 10 797 nucleotides， excluding the 3′-terminal poly （A） tail. Its genome contained an open reading frame of 10 464 nucleotides and encoded a polyprotein of 3 488 amino acids. Two additional proteins， termed ‘PISPO and ‘PIPO， were also translated by frame shifting within the P1 and P3 cistron. The results of sequence identity analysis of Jilin-gzl isolate with the 6 reference SPVG isolates showed that Jilin-gzl isolate shared a 79%-99% nucleotide identity and 92%-99% amino acid identity with other SPVG isolates at the ORF sequence level. Jilin-gzl isolate shared a highest sequence identity with SC11， IS103， HG167， Jesus_Maria isolates， and a lowest identity with WT325 and AI isolates. Phylogenetic analysis indicated that Jilin-gzl shared high sequence homology with HG167 and WCFR11 isolates， and shared low sequence homology with WT325 isolate from Taiwan， China. This work was the first report about the complete sequence of SPVG in Mainland China and it was also the first time that SPVG has been found in Northeast China. This research elucidated the genetic structure and phylogenetic relationship of Jilin-gzl isolate， and enriched the information of SPVG genome sequence. These will provide useful information for further study of the phylogenesis and function of this pathogen.

Key words

Sweet potato virus G （SPVG）; complete genome; comparative analysis; phylogeny

甘薯Ipomoea batatas為旋花科Convolvulaceae薯蕷屬Dioscorea代表植物，是中國主要糧食作物之一。中國是世界第一大甘薯生產(chǎn)國[1]，據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，2017年中國甘薯總產(chǎn)量約7 203萬t，占世界甘薯總產(chǎn)量（11 283萬t）的63.8%。甘薯作為無性繁殖作物，主要通過塊莖進(jìn)行繁殖，這種繁殖方式極易積累病毒。被侵染后的甘薯，其產(chǎn)量和品質(zhì)大幅降低，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)Clark等2012年報(bào)道，在世界范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的能夠侵染甘薯的病毒共有30多種[2]，其中有20多種病毒已經(jīng)在中國被發(fā)現(xiàn)[39]。甘薯G病毒Sweet potato virus G（SPVG），是馬鈴薯Y病毒科Potyviridae馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus成員之一，于1994年最早在中國被發(fā)現(xiàn)，之后美國、秘魯、韓國、阿根廷等國家也相繼報(bào)道了該病毒[1013]。SPVG在自然條件下通過蚜蟲以非持久性方式傳播，同時(shí)也可以通過汁液摩擦、嫁接等機(jī)械方式傳播。近幾年在中國各個(gè)甘薯種植區(qū)，SPVG時(shí)有發(fā)生，并且已成為影響甘薯品質(zhì)與產(chǎn)量的重要病毒之一。

SPVG基因組由正單鏈RNA組成，含有一個(gè)較大開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼一個(gè)多聚蛋白（polyprotein）?；蚪M5′和3′端各有一段非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs），3′非編碼區(qū)末尾具有poly（A）尾序列。多聚蛋白經(jīng)自身編碼的蛋白酶切割后，得到不同的功能蛋白。除此之外，SPVG基因組中還有兩個(gè)小的開放閱讀框，通過移碼翻譯（read frame shift）的方式編碼蛋白PISPO和蛋白PIPO，這兩個(gè)蛋白分別與P1和P3蛋白的N端以P1N-PISPO和P3N-PIPO融合形式存在[14]。SPVG基因組通過這兩種方式生成12個(gè)成熟的功能蛋白，使各個(gè)基因呈現(xiàn)不同程度的遺傳多樣性。目前，中國大陸地區(qū)關(guān)于SPVG基因組序列的報(bào)道僅集中在部分基因區(qū)段，如外殼蛋白（CP）基因等[15]，尚未見有關(guān)SPVG全基因組序列的報(bào)道。本次研究擬通過對(duì)SPVG吉林分離物Jilin-gzl的全基因序列測定，對(duì)其序列特征、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等進(jìn)行系統(tǒng)分析，為后續(xù)開展SPVG相關(guān)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2018年11月至2019年1月在吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所微生物實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)材料

SPVG吉林分離物Jilin-gzl于2018年9月采集自吉林省長春市甘薯種植區(qū)，呈典型明脈、花葉癥狀，前期經(jīng)血清學(xué)檢測和CP基因擴(kuò)增初步確定為SPVG分離物，將新鮮樣品置于密封袋中，于-80℃凍存。

1.2 主要試劑

RNeasy Plant Mini Kit為QIAGEN公司產(chǎn)品，ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit為賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）產(chǎn)品，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit為愛思進(jìn)生物技術(shù)公司（Axygen）產(chǎn)品，SMARTer RACE 5′/3′ Kit、TaKaRa LA Taq、pMD18-T Vector Cloning Kit、RNA Marker、DNA Marker為寶生物工程公司（TaKaRa）產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 RNA提取及基因組克隆

采用TRIzol試劑法從確定感染SPVG的甘薯葉片中提取總RNA，提取步驟參照RNeasy Plant Mini試劑盒（QIAGEN）說明書。以總RNA為模板，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系：Oligo dT Primer 1 μL、dNTP Mixture 1 μL、Total RNA 1 μL、RNase Free H2O 7 μL，于65℃溫浴5 min，然后立即冰上冷卻，并依次加入：RNase Inhibitor （40 U/μL） 0.5 μL、PrimeScript Ⅱ RTase （200 U/μL） 1 μL、5×PrimeScript Ⅱ Buffer 4 μL，30℃反應(yīng)10 min，42℃反應(yīng)60 min。根據(jù)GenBank中已登錄的12個(gè)SPVG不同分離物（登錄號(hào)及名稱見圖3）全基因序列的保守區(qū)，設(shè)計(jì)用于合成全基因序列的簡并引物和特異性引物（表1），以上引物委托吉林省庫美生物科技有限公司合成。

PCR擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系：TaKaRa LATaq（5 U/μL） 0.5 μL、10×LA PCR Buffer Ⅱ （Mg2+Plus） 5 μL、dNTP Mixture 5 μL、cDNA 1 μL、正向引物（10 μmol/L）1 μL、反向引物（10 μmol/L）1 μL、超純水36.5 μL。PCR反應(yīng)體系：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，退火30 s（退火溫度視基因片段而定，表1），72℃延伸若干分鐘（延伸時(shí)間按1 kb/min計(jì)算），共30個(gè)循環(huán);最后72℃再延伸5 min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取3 μL產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，檢測后切取目的條帶，利用膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。通過菌落PCR篩選出陽性克隆子，隨機(jī)選取3～5個(gè)，委托吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增5′非編碼區(qū)的引物（表1），5′非編碼區(qū)的擴(kuò)增采用SMARTer RACE 5′/3′試劑盒（TaKaRa），步驟依照說明書進(jìn)行。

1.3.2 序列分析

利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列拼接，在網(wǎng)站http：∥www.dpvweb.net/potycleavage/index.html上進(jìn)行多聚蛋白剪切位點(diǎn)分析，在http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/上進(jìn)行序列一致性分析。

1.3.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

為探究SPVG不同分離物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，從GenBank中選取11個(gè)其他SPVG分離物的核苷酸序列作為參考，使用最大似然法（maximum likehood， ML）基于全基因序列編碼區(qū)（coding sequence， CDS）核苷酸序列構(gòu)建SPVG系統(tǒng)發(fā)育樹。建樹之前，采用DAMBE軟件檢測核苷酸序列替換是否飽和。利用MEGA 6軟件選擇最優(yōu)化的核苷酸替換模型，并參照BIC（Bayesian information criterion）標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置相應(yīng)參數(shù)，最后通過自舉法（bootstrap）來對(duì)各分支節(jié)點(diǎn)的置信度（bootstrap confidence level）進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果與分析

2.1 Jilin-gzl分離物的全基因組序列特征

Jilin-gzl分離物全基因組分段擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，各片段大小均符合預(yù)期。

通過測序、拼接獲得的Jilin-gzl分離物基因組全長為10 797 nt （GenBank No.Mk392509），5′端和3′端非編碼區(qū)（untranslated regions， UTRs）的長度分別為113 nt和238 nt，其中3′末端具有poly（A）尾序列（圖2）。該分離物僅包含一個(gè)開放閱讀框，位于11410 577 nt，翻譯出一個(gè)包含3 488個(gè)氨基酸殘基的多聚蛋白，屬于典型的Potyvirus屬病毒的基因結(jié)構(gòu)。剪切位點(diǎn)分析顯示，Jilin-gzl分離物的9個(gè)剪切位點(diǎn)分別為PYMEQY/S、KHYLVG/G、DEVQHQ/A、GPVYHQ/S、NCVQHQ/S、EIVQHQ/A、TVVEHE/S、VPVYTQ/S、NNVHHQ/S。Jilin-gzl分離物不同基因的位置、大小以及編碼蛋白的大小如表2所示。

2.2 Jilin-gzl分離物的序列一致性分析

序列一致性分析顯示，在開放閱讀框水平上Jilin-gzl與其他6個(gè)分離物的核苷酸和氨基酸相似性分別為79%～99%、92%～99%（表2），其中與Jesus_Maria、SC11、IS103、HG167相似性最高，均為99%，與WT325相似性最低，僅為79%和88%。在5′和3′非編碼區(qū)上，核苷酸一致性分別為65%～98%和91%～99%，其中在5′非編碼區(qū)上Jilin-gzl與Jesus_Maria、WT325一致性較低，僅為76%和65%，而與SC11、IS103、HG167、AI一致性較高，均超過90%;在3′非編碼區(qū)上一致性較高，均超過90%。在單個(gè)基因區(qū)段上Jilin-gzl與Jesus_Maria、SC11、IS103、HG167的核苷酸和氨基酸一致性分別為98%～99%和97%～100%，一致性均非常高;而與WT325和AI的核苷酸和氨基酸一致性為66%～87%和37%～97%，一致性較低。綜上所述，Jilin-gzl與分離物SC11、IS103、HG167、Jesus_Maria一致性非常高，與WT325、AI一致性較低。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

建樹序列經(jīng)過多重比對(duì)與Gblock剪裁后，得到長度為10 231 bp的序列保守區(qū)。根據(jù)MEGA軟件的BIC標(biāo)準(zhǔn)，建樹序列最合適的核苷酸替換模型為GTR+I+G。ML法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，12個(gè)分離物共形成4個(gè)區(qū)域，其中系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近的分離物聚為一簇，GWB-2（JN613807，SPVG2）和SPFMV-UNB-01（MF185715，SPFMV）為外族。從圖中可以看到，區(qū)域Ⅲ的各個(gè)分離物并未像區(qū)域Ⅰ和區(qū)域Ⅱ那樣聚為一簇，但是從圖中的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來看，Jilin-gzl與HG167和WCFR11系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，而與該區(qū)域其他分離物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。同時(shí)Jilin-gzl與中國臺(tái)灣地區(qū)分離物WT325系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)而與兩個(gè)國外分離物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近，表明SPVG各分離物在遺傳多樣性上與地理分布無顯著聯(lián)系。

3 結(jié)論與討論

本研究通過克隆、測序等手段獲得了SPVG吉林分離物Jilin-gzl的全基因組序列，并且通過序列一致性比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等方法對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)特征及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了全面的探究與分析。這是中國大陸地區(qū)首次關(guān)于SPVG全基因組序列的報(bào)道，同時(shí)也是首次在中國東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)SPVG。本研究結(jié)果為后續(xù)深入開展SPVG種群的遺傳進(jìn)化及相關(guān)功能研究奠定了基礎(chǔ)。

序列一致性比對(duì)分析結(jié)果中有一部分?jǐn)?shù)據(jù)值得注意，首先在Jilin-gzl與Jesus_Maria和AI比對(duì)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，Jilin-gzl與Jesus_Maria在5′非編碼區(qū)核苷酸序列差異性較大，而在編碼區(qū)和3′非編碼區(qū)核苷酸序列差異性較小，與此相反的是，Jilin-gzl與AI在5′和3′非編碼區(qū)核苷酸序列差異性較小，在編碼區(qū)核苷酸序列差異性較大，類似數(shù)據(jù)差異在同為Potyvirus的馬鈴薯Y病毒Potato virus Y（PVY）全基因組序列一致性比對(duì)分析中也有發(fā)現(xiàn)，并且研究已表明這種數(shù)據(jù)差異是由PVY不同株系重組造成的[16]，據(jù)此推斷，Jilin-gzl分離物的形成也可能與不同SPVG分離物的重組有關(guān)。其次，在Jilin-gzl與WT325和AI的比較中發(fā)現(xiàn)，Jilin-gzl與這兩個(gè)分離物在全基因組水平上序列差異較大，同時(shí)在系統(tǒng)發(fā)育樹中也發(fā)現(xiàn)WT325和AI這兩個(gè)分離物與Jilin-gzl系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)，因此，SPVG可能存在多種株系。除此之外，本試驗(yàn)基于SPVG全基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，相較單基因序列建樹，全基因組序列建樹能夠從基因組水平上，更準(zhǔn)確地探究不同分離物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

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（責(zé)任編輯：田 喆）

收稿日期： 20190402?? 修訂日期： 20190601

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0201604）;吉林省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（CXGC2017JQ021）;吉林省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系馬鈴薯（甘薯）綜合栽培技術(shù)示范與推廣（2018）

致? 謝： 參加本試驗(yàn)部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀(jì)燁斌等同學(xué)，特此一并致謝。

通信作者?E-mail：周雪平zzhou@zju.edu.cn; 王永志yzwang@126.com

#??為并列第一作者