• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    滅字脊虎天牛CSP基因的鑒定、表達譜及XquaCSP7基因的功能研究

    2020-06-08 10:55:23莊翔麟吉帥帥趙昱杰尹寧娜劉乃勇
    植物保護 2020年3期

    莊翔麟 吉帥帥 趙昱杰 尹寧娜 劉乃勇

    摘要 基于已發(fā)表的滅字脊虎天牛Xylotrechus quadripes的觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),采用BLAST同源搜索的方法從轉(zhuǎn)錄組中一共鑒定到14個CSP基因,所有CSP均具有全長序列、信號肽序列和4個保守的半胱氨酸。序列比對結(jié)果表明,滅字脊虎天牛CSP間氨基酸一致性差異較大(12%~73%),平均值為34%;具有C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4的半胱氨酸保守模式。進化分析表明,除XquaCSP8和XquaCSP12外,其余XquaCSPs聚類到不同分支。表達譜分析表明,XquaCSP7基因在觸角特異表達;XquaCSP4、CSP5、CSP12和CSP14基因在觸角高表達;XquaCSP13基因在足特異表達;其余XquaCSPs基因在多個組織中有表達。結(jié)合測定結(jié)果發(fā)現(xiàn),XquaCSP7與測試的21種寄主氣味結(jié)合能力均較弱,熒光取代率在4.5%~13.5%之間,其中與苯乙酮的結(jié)合能力最強,熒光取代率為13.5%。研究結(jié)果可為后續(xù)滅字脊虎天牛CSP基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞 滅字脊虎天牛; 化學(xué)感受蛋白; 基因鑒定; 表達譜; 熒光競爭性結(jié)合測定

    中圖分類號: S 433.5

    文獻標識碼: A

    DOI: 10.16688/j.zwbh.2019123

    Identification and expression pattern of chemosensory protein genes

    from Xylotrechus quadripes Chevrolat (Coleoptera: Cerambycidae) and

    functional studies of XquaCSP7 gene

    ZHUANG Xianglin1, JI Shuaishuai1,2, ZHAO Yujie1, YIN Ningna1, LIU Naiyong1

    (1. Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province, Southwest Forestry University, Kunming

    650224, China; 2. Deyang Administration Branch of Giant Panda National Park, Deyang 618000, China)

    Abstract

    In this study, we identified 14 chemosensory protein genes from the antennal transcriptome of Xylotrechus quadripes by using a BLAST homology-based approach. All identified XquaCSPs had full-length sequences with signal peptides and four conserved cysteines. Sequence alignment results showed a varied amino acid identities with a range of 12%-73% (mean: 34%) among XquaCSPs. A conserved cysteine pattern of C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4 was presented among XquaCSPs. Phylogenetic analysis indicated that XquaCSP8 and XquaCSP12 were grouped into a small clade and others were classified into different clades. Expression pattern analysis revealed that XquaCSP7 showed an antennae-specific expression, while XquaCSP4, CSP5, CSP12 and CSP14 were highly expressed in the antennae; XquaCSP13 expression was limited to legs. The remaining XquaCSP genes had a broad expression in various tissues. Binding assays showed that XquaCSP7 exhibited weak binding affinities to 21 odorants derived from host plants, with a range of fluorescent displacements of 4.5%-13.5%. Among these, acetophenone was the best ligand with a fluorescent displacement of 13.5%. The results laid a foundation for future functional studies of XquaCSP genes in this species.

    Key words

    Xylotrechus quadripes; chemosensory protein; gene identification; expression pattern; fluorescence competitive binding assay

    云南省是我國小??Х菴offea arabica Linn.的主產(chǎn)區(qū),種植面積和產(chǎn)量均居全國之首[1]。長期以來,滅字脊虎天牛Xylotrechus quadripes嚴重威脅和制約云南省小??Х犬a(chǎn)業(yè)的發(fā)展,有學(xué)者對定植5年的小粒咖啡調(diào)查發(fā)現(xiàn)滅字脊虎天牛為害率高達80.6%[2]。該蟲隸屬于鞘翅目Coleoptera,天??艭erambycidae,天牛亞科Cerambycinae,主要以幼蟲蛀食小??Х葮涓?,為害較為隱蔽,目前主要采取人工捕殺幼蟲、成蟲和噴灑化學(xué)農(nóng)藥等方法進行防治,成本高昂且防治效果不理想,亟待研發(fā)新型的綠色防治技術(shù)[3]。

    觸角是天牛等昆蟲的重要嗅覺感受器官,其表面著生有不同類型的感器,感器內(nèi)部的淋巴液中有兩種參與識別和運輸氣味分子的嗅覺蛋白:氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)和化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)[46]。昆蟲CSP是一類小分子可溶性蛋白,分子質(zhì)量約為15~17 kDa,一般多肽鏈全長100~120個氨基酸,具有4個保守的半胱氨酸殘基(cysteine,Cys),能夠形成兩對二硫鍵,起穩(wěn)定蛋白三級結(jié)構(gòu)的作用[5,78]。1994年,在黑腹果蠅Drosophila melanogaster觸角中分別發(fā)現(xiàn)OS-D(olfactory specific-D)和A-10兩個CSP基因,這也是在昆蟲觸角中最早發(fā)現(xiàn)的CSP基因[910]。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展以及轉(zhuǎn)錄組和基因組測序技術(shù)的不斷更新,大量昆蟲的CSP基因已被鑒定,如在鞘翅目昆蟲云斑天牛Batocera horsfieldi[11]、紅脂大小蠹Dendroctonus valens[12]、松褐天牛Monochamus alternatus[13]、光肩星天牛Anoplophora glabripennis[14]、星天牛A.chinensis[15]和赤擬谷盜Tribolium castaneum[16]中分別鑒定到3、6、12、12、16和20個CSP基因;在非鞘翅目昆蟲家蠶Bombyx mori[8,17]、棉鈴蟲Helicoverpa armigera[18]、黑腹果蠅和意大利蜜蜂Apis mellifera[8]中分別鑒定到22、29、4和6個CSP基因。另外,研究發(fā)現(xiàn)昆蟲的CSP基因在觸角、頭、胸、腹、足、翅、下唇須等多個組織中均有表達,說明其功能具有多樣性[6,1417,19]。目前,一般認為昆蟲的CSP具有嗅覺感受、運輸氣味分子、發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)等功能[2021],如日本弓背蟻Camponotus japonicus的CjapCSP能夠特異性識別非同種巢穴螞蟻表皮的烴類物質(zhì)[22];2007年,Maleszka等人利用RNAi技術(shù)證明意大利蜜蜂的AmelCSP5基因參與了胚胎覆蓋膜的形成[23]。

    在昆蟲體外,熒光競爭性結(jié)合測定技術(shù)被廣泛用于研究CSP和氣味分子的結(jié)合能力,如華山松大小蠹Dendroctonus armandi的DarmCSP2與月桂烯和3-蒈烯具有較強的結(jié)合能力[24]。苜蓿盲蝽Adelphocoris lineolatus的AlinCSP1-3與順-3-己烯-1-醇、2-己烯醛和戊二醛具有較強的結(jié)合能力[25]。據(jù)此研究CSP與氣味分子(植物揮發(fā)物和性信息素)的結(jié)合能力,結(jié)合電生理測定、室內(nèi)行為學(xué)研究和田間誘捕試驗,在篩選到害蟲防治潛在分子靶標的同時,還可進一步研發(fā)基于植物揮發(fā)物或性信息素的行為引誘劑或驅(qū)避劑。

    國內(nèi)外學(xué)者在滅字脊虎天牛的蟲情調(diào)查、種群動態(tài)和發(fā)生規(guī)律等方面已做了大量的研究[23,2628],但是在分子生物學(xué)尤其是嗅覺方面的研究較少。先前,我們采用轉(zhuǎn)錄組測序、生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)研究了滅字脊虎天牛的5類化感基因家族:OBPs、氣味受體(odorant receptors,ORs)、味覺受體(gustatory receptors,GRs)、離子型受體(ionotropic receptors,IRs)和化學(xué)感受神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)[2930]?;谝褱y序的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),本文進一步鑒定了該天牛的CSP基因家族,并采用PCR研究了這些CSP基因的組織表達特征;在此基礎(chǔ)上選取觸角特異表達的XquaCSP7基因進行原核表達和純化,研究了XquaCSP7與不同寄主氣味的結(jié)合特性。研究結(jié)果不僅豐富了滅字脊虎天牛的化感基因家族,還可為后續(xù)該種害蟲基于寄主揮發(fā)物的行為調(diào)控劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 試驗昆蟲

    滅字脊虎天牛采自云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所咖啡種植園,緯度24°1′32″N,經(jīng)度97°51′18″E,海拔767 m。田間采集受害的咖啡樹干,帶回室內(nèi)后將其用紗網(wǎng)套住,每天不定時觀察,將羽化當天的滅字脊虎天牛雌雄成蟲分開飼養(yǎng),并提供咖啡枝葉和蜂蜜水作為食物。然后,分別收集3~5日齡成蟲觸角、頭(去除觸角)、胸、腹、足、翅等組織。將雌雄成蟲同一組織按1∶1的比例混合,以便后續(xù)RT-PCR試驗中同一組織雌雄蟲cDNA模板濃度相等。收集好的組織立即用液氮速凍,保存于-80℃冰箱。

    1.1.2 試驗試劑

    TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit、DNA rTaq酶、dNTP Mixture、10×PCR Buffer (Mg2+)和6×Loading buffer購自TaKaRa寶生物工程有限公司;SuperRed/GelRed核酸染料購自BioSharp公司。

    1.2 基因的鑒定

    基于已發(fā)表的滅字脊虎天牛觸角轉(zhuǎn)錄組(SRA登錄號:SRP143591),采用BLAST同源搜索的方法鑒定滅字脊虎天牛的CSP基因。首先,從NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中下載松褐天牛、星天牛、光肩星天牛、赤擬谷盜、大猿葉蟲Colaphellus bowringi的CSP作為目標序列,在BioEdit中采用本地BLAST鑒定候選的CSP基因。然后,將鑒定的所有CSP基因再次在NCBI nr蛋白序列(NCBI non-redundant protein sequence database)數(shù)據(jù)庫中進行比對,確定候選的CSP基因。最后,根據(jù)鞘翅目昆蟲CSP氨基酸序列中4個保守Cys及其位置(C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4),進一步確定候選的CSP基因[8,16,3132]。

    1.3 序列分析

    利用NCBI上的open reading frame finder(ORF finder)預(yù)測開放閱讀框(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)。利用在線軟件SingalP 4.1 Sever(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SingalP)預(yù)測信號肽[33]。CSP氨基酸序列間的一致性采用GeneDoc進行計算;序列比對采用Clustal X 1.83。在進化樹分析中,選取了天??评ハx松褐天牛、云斑天牛、光肩星天牛和星天牛共42條CSP序列,利用MEGA 7.0軟件鄰位相連法(neighbour-joining)構(gòu)建進化樹,對結(jié)果進行1 000次bootstrap驗證[34]。

    1.4 基因的表達譜分析

    根據(jù)TRIzol試劑盒使用說明書,分別提取滅字脊虎天牛各組織總RNA;然后,采用NanoDrop 1000測定其濃度。利用DNase Ⅰ去除各組織中的基因組DNA,之后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit合成cDNA。選取滅字脊虎天牛肌動蛋白actin基因作為內(nèi)參基因[32],以檢測各組織cDNA模板質(zhì)量及完整性。采用RT-PCR研究CSP基因在以上各組織的表達情況。PCR引物采用Primer Premier 5軟件設(shè)計,引物序列送昆明奧基生物科技有限公司進行合成(表1)。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸40 s,35個循環(huán);72℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖膠進行電泳分析,最后根據(jù)目的條帶的有無及亮度判斷CSP基因在不同組織中的表達情況。

    1.5 重組蛋白XquaCSP7的表達和純化

    1.5.1 原核表達載體的構(gòu)建

    根據(jù)XquaCSP7基因的開放閱讀框序列(去除信號肽)設(shè)計原核表達引物,并在正向和反向引物中分別加入Nde Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位點(表1),從而將目的基因更好地連入載體pCzn1中。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶(Nde Ⅰ和Xba Ⅰ)酶切表達載體pCzn1,然后與PCR擴增獲得的XquaCSP7基因進行連接,獲得重組質(zhì)粒pCzn1-XquaCSP7。重組質(zhì)粒陽性克隆進一步通過測序進行驗證,以確定序列及插入方向的正確性。

    1.5.2 重組蛋白的表達和純化

    將測序正確的重組質(zhì)粒pCzn1-XquaCSP7轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細胞Arctic-Express中,離心后全部涂于含50 μg/mL氨芐青霉素(ampicillin,Amp+)的LB平板上,挑取單克隆接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基(50 μg/mL Amp+)中,37℃,220 r/min振蕩過夜。次日,按1∶100的比例接種于1 L LB液體培養(yǎng)基(50 μg/mL Amp+)中,37℃,220 r/min培養(yǎng)至菌體OD600值為0.6~0.8時,向培養(yǎng)液中加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG);然后,在37℃,220 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h進行誘導(dǎo)表達。

    4℃離心后棄上清;然后用磷酸鹽緩沖液重懸菌體,超聲波破碎后分別取上清和沉淀進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,以確定重組蛋白的可溶性。采用鎳離子親和層析柱對目的蛋白進行純化,純化后的目的蛋白液采用超濾管對其進行濃縮。

    1.6 熒光競爭性結(jié)合測定

    在熒光競爭性結(jié)合測定中,N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)和所有化合物均購自Sigma Aldrich有限公司,純度大于或等于90%(表2)。以色譜級甲醇為溶劑,分別配制濃度為10 mmol/L的熒光探針1-NPN和21種氣味配基的母液,-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用時再用色譜級甲醇將探針和氣味配基母液稀釋為1 mmol/L的工作液。

    首先,在96 Micro Well TM微孔板(Nunclon TM)加入2 μmol/L的蛋白和2 μmol/L的1-NPN,判斷XquaCSP7與探針是否能夠結(jié)合;然后,在2 μmol/L蛋白液中加入終濃度為2、4、6、8、12、16 μmol/L和20 μmol/L的1-NPN,計算XquaCSP7與1-NPN的結(jié)合常數(shù)(Kd);最后,在2 μmol/L蛋白和2 μmol/L 1-NPN的混合液中分別加入不同濃度的氣味配基,用多功能酶標儀(VARIOSKAN FLASH)進行結(jié)合測定。測定參數(shù)為:激發(fā)波長為337 nm,發(fā)射波長為370~550 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 滅字脊虎天牛CSP基因的鑒定

    利用BLAST同源性搜索的方法,從滅字脊虎天牛觸角轉(zhuǎn)錄組中共鑒定到14個CSP基因。所有CSP基因均具有完整的開放閱讀框,編碼101~148個氨基酸,且在N端均具有信號肽序列(16~26個氨基酸)。NCBI BLAST比對結(jié)果表明,所有CSP均比對到鞘翅目其他昆蟲的CSP,其中XquaCSP6與松褐天牛的MaltCSP2具有最高的氨基酸一致性,為87%;而XquaCSP14與中歐山松大小蠹的DponCSP1的氨基酸一致性最低,僅為50%(表3)。

    2.2 滅字脊虎天牛CSP的序列及進化分析

    利用Clustal X 1.83對滅字脊虎天牛14個CSP的氨基酸序列進行比對,結(jié)果表明所有CSP均具有4個保守的Cys,模式為C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4(圖1)。

    為了明確滅字脊虎天牛14個CSP與鞘翅目其他昆蟲CSP的進化關(guān)系,我們構(gòu)建了星天牛、光肩星天牛、云斑天牛、松褐天牛和滅字脊虎天牛CSP的進化樹。結(jié)果表明,除XquaCSP8和XquaCSP12聚類到同一個小分支外,其余XquaCSPs聚類到不同的分支(圖2)。

    2.3 滅字脊虎天牛CSP基因的表達譜分析

    為了明確CSP基因的可能功能,利用RT-PCR技術(shù)研究了14個CSP基因在觸角、頭(去除觸角)、胸、腹、足和翅等組織的表達情況。結(jié)果表明,除XquaCSP13基因外,其他XquaCSPs基因在觸角中均有表達。其中XquaCSP7基因在觸角特異表達;XquaCSP4、CSP5、CSP12和CSP14基因在觸角高表達;XquaCSP13基因在足特異表達;其余XquaCSPs基因在除觸角以外的多個組織中有表達(圖3)。

    2.4 滅字脊虎天牛XquaCSP7的表達及純化

    首先,檢測了重組蛋白pCzn1-XquaCSP7在大腸桿菌的可溶性表達形式,超聲波破碎后分別取上清液和沉淀進行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明,pCzn1-XquaCSP7主要以包涵體的形式存在,因此采用包涵體變性和復(fù)性的方法進行純化。將處理好的蛋白混合液過柱,純化后得到約14 kDa的高純度單一目的蛋白(圖4)。

    2.5 滅字脊虎天牛XquaCSP7與不同配基的結(jié)合能力測定

    采用熒光競爭性結(jié)合測定方法,研究了XquaCSP7與21種寄主氣味的結(jié)合能力。首先,測定了XquaCSP7與1-NPN的結(jié)合能力。結(jié)果表明,該蛋白與1-NPN探針具有好的結(jié)合能力,結(jié)合常數(shù)Kd為6.50 μmol/L(圖5)。結(jié)合測定結(jié)果表明,XquaCSP7與21種氣味配基的結(jié)合能力均較弱,1-NPN的熒光取代率在4.5%~13.5%之間。在測試的所有化合物中,XquaCSP7與苯乙酮的結(jié)合能力最強,熒光取代率為13.5%;XquaCSP7與順-3-己烯乙酸酯的結(jié)合能力最弱,熒光取代率僅為4.5%(圖6)。

    3 討論

    滅字脊虎天牛是小??Х壬蠟楹^為嚴重的蛀干害蟲之一,嗅覺在其寄主定位中起著重要作用。與其他大部分昆蟲的觸角功能類似,天牛的觸角能夠感受同種性信息素和普通植物氣味,在其種群繁衍和生存中必不可少[3537]。近年,轉(zhuǎn)錄組測序已成為基因鑒定的主要手段,基于觸角轉(zhuǎn)錄組可鑒定到嗅覺相關(guān)的基因及害蟲防治的潛在分子靶標,然后采用反向化學(xué)生態(tài)學(xué)技術(shù)可篩選到用于害蟲防治的行為調(diào)控劑。從滅字脊虎天牛的觸角轉(zhuǎn)錄組中我們已鑒定了該種害蟲的5類化感基因家族:ORs、GRs、IRs、SNMPs和OBPs,并研究了它們各自的進化關(guān)系及組織表達特征[2930]。為了進一步完善該天牛的化感基因家族,本文研究了參與嗅覺感受的另一類重要化感蛋白基因:CSPs。研究結(jié)果極大地豐富了滅字脊虎天牛的化感基因家族,并為后續(xù)化感基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

    從滅字脊虎天牛的觸角轉(zhuǎn)錄組中,一共鑒定到14個CSP基因,其數(shù)量多于銅綠異麗金龜Anomala corpulenta(5個)[37]、云杉八齒小蠹Ips typographus(6個)[31]、紅脂大小蠹(6個)[12]、華山松大小蠹(9個)[24]、中歐山松大小蠹Dendroctonus ponderosae(11個)[31]、大猿葉蟲(12個)[38]、松褐天牛(12個)[13]、光肩星天牛(12個)[14]和紅棕象甲Rhynchophorus ferrugineus(12個)[39],考慮到以上鞘翅目昆蟲的CSP基因均來自于成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組,因此推測滅字脊虎天牛有更多的CSP基因參與嗅覺感受;此外,也有可能是由于不同昆蟲觸角轉(zhuǎn)錄組測序深度和組裝技術(shù)的差異導(dǎo)致。但是少于星天牛(16個)[15]和赤擬谷盜(20個)[16],其中與赤擬谷盜CSP基因的數(shù)量差異較大,原因很可能是赤擬谷盜的CSP基因來源于基因組,而滅字脊虎天牛的CSP基因僅從觸角轉(zhuǎn)錄組中獲得,在其他組織特異或高表達的CSP基因并未被鑒定。

    在滅字脊虎天牛中,所有CSP均具有4個保守的Cys,其保守模式“C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4”與鞘翅目其他昆蟲的CSP類似[8,16,3131],這種保守的Cys模式極大地幫助了鞘翅目昆蟲CSP基因的鑒定。此外,研究發(fā)現(xiàn)不同物種同源的CSP間氨基酸一致性較高,如云南切梢小蠹Tomicus yunnanensis的CSP與鞘翅目其他昆蟲的CSP一致性大于45%[32];星天牛[15]和光肩星天牛[14]的CSP與鞘翅目其他昆蟲的CSP一致性均大于50%;類似的結(jié)果在滅字脊虎天牛中也有發(fā)現(xiàn)。然而,同一物種不同CSP間氨基酸一致性差異較大,如光肩星天牛CSP間的一致性為8.9%~71.8%[14];家蠶CSP間的一致性為20%~60%[17]。與其他昆蟲的CSP類似,滅字脊虎天牛的14個CSP間氨基酸一致性變化較大(12%~73%),其中XquaCSP8和XquaCSP12一致性最高,在進化樹中聚類到同一個小分支,且它們具有相似的組織表達特征,說明它們很可能具有相似的功能。

    昆蟲的CSP基因具有多樣性的組織表達特征,說明其在嗅覺和非嗅覺感受中均具有重要功能。在鞘翅目中,光肩星天牛的CSP基因在觸角、足、下顎須、下唇須等組織中均有表達[14],類似的結(jié)果在星天牛[15]、銅綠異麗金龜[37]、赤擬谷盜[16]、黃曲條跳甲Phyllotreta striolata[40]、榆紫葉甲Ambrostoma quadriimpressum[41]等昆蟲中也有發(fā)現(xiàn)。在滅字脊虎天牛中,除XquaCSP7和XquaCSP13基因外,其余XquaCSPs基因在除觸角以外的多個組織中有表達,說明這些CSP基因具有多種功能。其中,XquaCSP7基因呈現(xiàn)觸角特異表達的特點,很可能參與性信息素或是寄主氣味的感受;XquaCSP13基因在足特異表達,與光肩星天牛[14]和赤擬谷盜[16]的部分CSP基因表達特征類似。在美洲大蠊Periplaneta americana中,PameCSP10(p10)基因在再生足中表達,很可能與足的再生有關(guān)[42],滅字脊虎天牛的XquaCSP13基因是否與足的發(fā)育有關(guān)仍需進一步的功能驗證。在功能研究中,選取觸角特異表達的XquaCSP7基因,主要考慮到觸角是滅字脊虎天牛主要的嗅覺器官,在其寄主定位中具有重要作用。此外,在結(jié)合測定中主要選取了寄主植物的氣味。雖然XquaCSP7能夠很好地與熒光探針1-NPN結(jié)合(Kd=6.50 μmol/L),但是在測試的21種氣味物質(zhì)中,XquaCSP7與所有氣味配基的結(jié)合能力均較弱,沒有一種配基的相對熒光值下降到50%以下。據(jù)此分析認為XquaCSP7可能是一個非廣譜的結(jié)合蛋白,即結(jié)合譜較窄,僅對一種或幾種氣味具有結(jié)合能力;而在結(jié)合測定中,由于測試的配基數(shù)量有限,因此沒能夠篩選到XquaCSP7親和力較好的配基。

    參考文獻

    [1] WALLER J M, BIGGER M, HILLOCKS R J. 咖啡病蟲害防治[M]. 劉杰, 申科,李福榮,譯.北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2016: 12.

    [2] 舒梅, 成文章, 李忠恒,等. 思茅咖啡滅字脊虎天牛發(fā)生與危害調(diào)查[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 36(5): 8184.

    [3] 周又生, 趙忠喜, 李松林, 等.咖啡滅字虎天牛生物生態(tài)學(xué)及發(fā)生危害規(guī)律和治理研究[J].西南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2002, 24(1): 14.

    [4] LEAL W S.Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes [J]. Annual Review of Entomology, 2013, 58(1): 373391.

    [5] PELOSI P, IOVINELLA I, FELICIOLI A, et al.Soluble proteins of chemical communication: an overview across arthropods [J/OL].Frontiers in Physiology,2014, 5: 320. DOI:10.3389/fphys.2014.00320.eCollectien.2014.

    [6] PELOSI P,IOVINELLA I,ZHU Jiao, et al. Beyond chemoreception: diverse tasks of soluble olfactory proteins in insects [J]. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society, 2018, 93(1): 184200.

    [7] PELOSI P, CALVELLO M, BAN Liping. Diversity of odorant-binding proteins and chemosensory proteins in insects [J].Chemical Senses, 2005, 30(S1): i291i292.

    [8] VIEIRA F G, ROZAS J. Comparative genomics of the odorant-binding and chemosensory protein gene families across the Arthropoda: origin and evolutionary history of the chemosensory system[J]. Genome Biology and Evolution, 2011, 3: 476490.

    [9] MCKENNA M P, HEKMATSCAFE D S, GAINES P, et al. Putative Drosophila pheromone-binding proteins expressed in a subregion of the olfactory system[J].Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(23): 1634016347.

    [10]PIKIELNY C W, HASAN G, ROUYER F, et al. Members of a family of Drosophila putative odorant-binding proteins are expressed in different subsets of olfactory hairs [J]. Neuron, 1994, 12(1): 3549.

    [11]LI Hui, ZHANG Guoan, WANG Manqun. Chemosensory protein genes of Batocera horsfieldi (Hope): identification and expression pattern [J]. Journal of Applied Entomology, 2012, 136(10): 781792.

    [12]GU Xiaocui, ZHANG Yanan, KANG Ke,et al. Antennal transcriptome analysis of odorant reception genes in the red turpentine beetle (RTB), Dendroctonus valens [J/OL]. PLoS ONE,2015, 10(5): e0125159.

    [13]WANG Juan, LI Dongzhen, MIN Shuifa, et al. Analysis of chemosensory gene families in the beetle Monochamus alternatus and its parasitoid Dastarcus helophoroides [J].Comparative Biochemistry and Physiology Part D-Genomics and Proteomics, 2014, 11(9): 18.

    [14]HU Ping, WANG Jingzhen, CUI Mingming, et al. Antennal transcriptome analysis of the Asian longhorned beetle Anoplophora glabripennis [J/OL]. Scientific Reports, 2016, 6: 26652. DOI:10.1038/srep26652.

    [15]WANG Jingzhen, HU Ping, GAO Peng, et al. Antennal transcriptome analysis and expression profiles of olfactory genes in Anoplophora chinensis [J/OL].Scientific Reports, 2017, 7(1):15470. DOI:10.1038/s41598017154252.

    [16]DIPPEL S,OBERHOFER G,KAHNT J,et al. Tissue-specific transcriptomics, chromosomal localization, and phylogeny of chemosensory and odorant binding proteins from the red flour beetle Tribolium castaneum reveal subgroup specificities for olfaction or more general functions [J/OL]. BMC Genomics, 2014, 15: 1141. DOI:10.1186/14712164151141.

    [17]GONG Daping, ZHANG Huijie, ZHAO Ping, et al. Identification and expression pattern of the chemosensory protein gene family in the silkworm,Bombyx mori [J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2007, 37(3): 266277.

    [18]PEARCE S L, CLARKE D F, EAST P D, et al. Genomic innovations, transcriptional plasticity and gene loss underlying the evolution and divergence of two highly polyphagous and invasive Helicoverpa pest species [J/OL]. BMC Biology, 2017, 15: 69. DOI:10.1186/s1291501704026.

    [19]LI Zhaoqun, ZHANG Shuai, LUO Junyu, et al. Expression analysis and binding assays in the chemosensory protein gene family indicate multiple roles in Helicoverpa armigera[J]. Journal of Chemical Ecology, 2015, 41(5): 473485.

    [20]LARTIGUE A, CAMPANACCI V, ROUSSEL A, et al. X-ray structure and ligand binding study of a moth chemosensory protein [J]. Journal of Biological Chemistry, 2002, 277(35):3209432098.

    [21]PICIMBON J F, DIETRICH K, ANGELI S, et al. Purification and molecular cloning of chemosensory proteins from Bombyx mori [J]. Archives of Insect Biochemistry & Physiology, 2000, 44(3):120129.

    [22]OZAKI M, WADA-KATSUMATA A, FUJIKAWA K, et al. Ant nestmate and non-nestmate discrimination by a chemosensory sensillum [J]. Science, 2005, 309(5732):311314.

    [23]MALESZKA J, FORT S, SAINT R, et al. RNAi-induced phenotypes suggest a novel role for a chemosensory protein CSP5 in the development of embryonic integument in the honeybee (Apis mellifera) [J]. Development Genes & Evolution, 2007, 217(3):189196.

    [24]LI Zhumei, DAI Lulu, CHU Honglong, et al. Identification, expression patterns, and functional characterization of chemosensory proteins in Dendroctonus armandi (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae) [J/OL]. Frontiers in Physiology, 2018, 9: 291. https:∥doi.org/10.3389/fphys.2018.00291.

    [25]GU Shaohua, WANG Songying, ZHANG Xueying, et al. Functional characterizations of chemosensory proteins of the alfalfa plant bug Adelphocoris lineolatus indicate their involvement in host recognition[J/OL]. PLoS ONE, 2012, 7(8): e42871. DOI:10.1371/journal/pone.0042871.

    [26]VENKATESHA M G AND DINESH A S. The coffee white stemborer Xylotrechus quadripes (Coleoptera: Cerambycidae): bioecology, status and management [J]. International Journal of Tropical Insect Science, 2012, 32(4): 177188.

    [27]SHU Mei, CHENG Wenzhang, LI Zhongheng, et al. Survey of occurrence and damage of Xylotrechus quadripes Chevr on Simao coffee in Puer city [J]. Plant Diseases and Pests, 2016, 7(5/6): 57.

    [28]THAPA S, LANTINGA E A. Growing coffee in the shade: a strategy to minimize the prevalence of coffee white stem borer, Xylotrechus quadripes [J]. Southwestern Entomologist, 2017, 42(2): 357362.

    [29]吉帥帥, 莊翔麟, 劉乃勇. 滅字脊虎天牛觸角轉(zhuǎn)錄組中氣味結(jié)合蛋白基因的鑒定及表達譜分析[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2018, 36(2): 193202.

    [30]PANG Jixin, ZENG Xin, ZHU Jiayin, et al. Chemosensory transmembrane protein families in the coffee white stemborer, Xylotrechus quadripes (Coleoptera: Cerambycidae) [J]. Environmental Entomology, 2018, 47(4): 969981.

    [31]ANDERSSON M N, GROSSEWILDE E, KEELING C I, et al. Antennal transcriptome analysis of the chemosensory gene families in the tree killing bark beetles, Ips typographus and Dendroctonus ponderosae (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae) [J/OL]. BMC Genomics, 2013, 14(1): 198. http:∥www.biome-dcentral.com/14712164/14/198.

    [32]LIU Naiyong, LI Zongbo, ZHAO Ning, et al. Identification and characterization of chemosensory gene families in the bark beetle, Tomicus yunnanensis [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part D-Genomics and Proteomics, 2018, 25: 7385.

    [33]PETERSEN T N, BRUNAK S, VON H G, et al.SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions [J]. Nature Methods, 2011, 8(10): 785786.

    [34]KUMAR S, STECHER G, TAMURA K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0 for bigger datasets [J]. Molecular Biology & Evolution,2016, 33(7): 18701874.

    [35]ALLISON D J, BORDEN H J, SEYBOLD J S.A review of the chemical ecology of the Cerambycidae (Coleoptera) [J].Chemoecology, 2004, 14: 123150.

    [36]GINZEL M D, HANKS L M. Role of host plant volatiles in mate location for three species of longhorned beetles [J]. Journal of Chemical Ecology, 2005, 31: 213217.

    [37]LI Xiao, JU Qian, JIE Wencai, et al. Chemosensory gene families in adult antennae of Anomala corpulenta Motschulsky (Coleoptera: Scarabaeidae: Rutelinae)[J/OL]. PLoS ONE, 2015, 10(4): e0121504. https:∥doi.org/10.1371/journal.pone.0121504.

    [38]LI Xiaoming, ZHU Xiuyun, WANG Zhiqiang, et al. Candidate chemosensory genes identified in Colaphellus bowringi by antennal transcriptome analysis [J/OL]. BMC Genomics, 2015, 16: 1028. DOI:10.1186/s1286401522363.

    [39]ANTONY B, SOFFAN A, JAKE J, et al. Identification of the genes involved in odorant reception and detection in the palm weevil Rhynchophorus ferrugineus, an important quarantine pest, by antennal transcriptome analysis [J/OL]. BMC Genomics, 2016, 17(1): 69. DOI:10.1186/s1286401623626.

    [40]WU Zhongzhen, BIN Shuying, HE Hualiang, et al. Differential expression analysis of chemoreception genes in the striped flea beetle Phyllotreta striolata using a transcriptomic approach [J/OL].PLoS ONE, 2016, 11(4): e0153067. DOI:10.1371/journal.pone.0153067.

    [41]WANG Yinliang, CHEN Qi, ZHAO Hanbo, et al. Identification and comparison of candidate olfactory genes in the olfactory and non-olfactory organs of elm pest Ambrostoma quadriimpressum (Coleoptera: Chrysomelidae) based on transcriptome analysis [J/OL]. PLoS ONE, 2016, 11(1): e0147144. https:∥doi.org/10.1371/journal.pone.0147144.

    [42]KITABAYASHI A N, ARAI T, KUBO T, et al. Molecular cloning of cDNA for p10, a novel protein that increases in the regenerating legs of Periplaneta americana (American cockroach) [J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 1998, 28(10): 785790.

    (責任編輯:田 喆)

    收稿日期: 20190313?? 修訂日期: 20190425

    基金項目:云南省科技廳青年項目(2017FD101)

    致? 謝: 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀燁斌等同學(xué),特此一并致謝。

    通信作者?E-mail:naiyong_2013@163.com

    #?為并列第一作者

    天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲精品在线观看二区| 一a级毛片在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产成人av教育| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 看黄色毛片网站| 免费av不卡在线播放| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产成人a区在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 精华霜和精华液先用哪个| 国产黄a三级三级三级人| 丝袜美腿在线中文| 别揉我奶头 嗯啊视频| 午夜日韩欧美国产| av天堂在线播放| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲在线观看片| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲色图av天堂| 国产一级毛片七仙女欲春2| 一进一出好大好爽视频| 欧美zozozo另类| 亚洲一区高清亚洲精品| 免费av观看视频| 悠悠久久av| 欧美黑人欧美精品刺激| 人妻少妇偷人精品九色| 免费av观看视频| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产精品久久视频播放| 日本一本二区三区精品| av天堂中文字幕网| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美丝袜亚洲另类 | 观看美女的网站| 国产中年淑女户外野战色| 可以在线观看毛片的网站| 国产一区二区三区视频了| 国产私拍福利视频在线观看| 春色校园在线视频观看| 国产探花在线观看一区二区| 波多野结衣高清无吗| 床上黄色一级片| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲欧美日韩高清专用| 日日夜夜操网爽| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 中国美女看黄片| 国产精品永久免费网站| 国产一区二区三区视频了| 精品午夜福利在线看| 免费观看的影片在线观看| 级片在线观看| 全区人妻精品视频| 天堂√8在线中文| 给我免费播放毛片高清在线观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲成人久久性| 国产精品,欧美在线| 亚洲欧美清纯卡通| 色播亚洲综合网| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久香蕉精品热| 久久精品国产清高在天天线| av女优亚洲男人天堂| 联通29元200g的流量卡| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 婷婷丁香在线五月| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 深夜a级毛片| 男女之事视频高清在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品久久久久久精品电影| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产av一区在线观看免费| 久久香蕉精品热| 亚洲精品色激情综合| 久9热在线精品视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲精品一区av在线观看| 日本免费a在线| 亚洲精品456在线播放app | 亚洲欧美清纯卡通| 国产欧美日韩精品一区二区| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美在线一区亚洲| 亚洲第一电影网av| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 在线看三级毛片| 国产亚洲精品av在线| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久6这里有精品| 免费黄网站久久成人精品| 在线观看66精品国产| 久久久久久伊人网av| 午夜老司机福利剧场| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久久午夜欧美精品| 深爱激情五月婷婷| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 一本一本综合久久| 中文字幕高清在线视频| av.在线天堂| 长腿黑丝高跟| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美最新免费一区二区三区| 变态另类丝袜制服| aaaaa片日本免费| 在线观看舔阴道视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 91久久精品电影网| 99久久成人亚洲精品观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 少妇的逼好多水| 精品欧美国产一区二区三| 国产色婷婷99| 搡老岳熟女国产| 中亚洲国语对白在线视频| 又爽又黄a免费视频| 成年女人看的毛片在线观看| 欧美日韩乱码在线| 九色国产91popny在线| 国产午夜福利久久久久久| 欧美一区二区国产精品久久精品| 色视频www国产| 欧美激情国产日韩精品一区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| a在线观看视频网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 欧美在线一区亚洲| 看片在线看免费视频| 久久人人精品亚洲av| 最近中文字幕高清免费大全6 | av天堂在线播放| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 99精品久久久久人妻精品| av在线亚洲专区| 男女下面进入的视频免费午夜| 一边摸一边抽搐一进一小说| 看片在线看免费视频| av国产免费在线观看| www.www免费av| 精品国内亚洲2022精品成人| 五月伊人婷婷丁香| 简卡轻食公司| 老熟妇乱子伦视频在线观看| a级毛片a级免费在线| 91精品国产九色| 欧美日韩综合久久久久久 | 又爽又黄a免费视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产色爽女视频免费观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品嫩草影院av在线观看 | www.色视频.com| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲在线自拍视频| 日韩精品有码人妻一区| 午夜激情欧美在线| 黄色配什么色好看| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 九九在线视频观看精品| 精品久久久久久久久av| 日韩欧美在线二视频| 色哟哟哟哟哟哟| 乱人视频在线观看| 99热这里只有是精品50| 此物有八面人人有两片| 欧美成人a在线观看| 成人欧美大片| 少妇丰满av| 麻豆国产av国片精品| 国产伦在线观看视频一区| 黄色女人牲交| 国产日本99.免费观看| 伦理电影大哥的女人| 长腿黑丝高跟| 久久久久久久久久久丰满 | 久久国内精品自在自线图片| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲av.av天堂| 国产中年淑女户外野战色| 国语自产精品视频在线第100页| 有码 亚洲区| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久国内精品自在自线图片| h日本视频在线播放| 国产一区二区在线av高清观看| 一级av片app| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产三级中文精品| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 91久久精品国产一区二区三区| 欧美极品一区二区三区四区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 最后的刺客免费高清国语| 在线观看舔阴道视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美极品一区二区三区四区| 欧美又色又爽又黄视频| 午夜免费激情av| 在线观看舔阴道视频| 我的女老师完整版在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 色在线成人网| 亚洲中文字幕日韩| 成人特级av手机在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 色在线成人网| 最近在线观看免费完整版| 欧美+日韩+精品| 99热只有精品国产| 直男gayav资源| av中文乱码字幕在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 久久久久久久精品吃奶| 成人精品一区二区免费| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | a级毛片a级免费在线| 99热这里只有精品一区| av中文乱码字幕在线| 一本久久中文字幕| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 欧美一区二区亚洲| 精品一区二区三区av网在线观看| 日韩中字成人| 国产视频内射| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 色播亚洲综合网| 亚洲午夜理论影院| 变态另类丝袜制服| 成人美女网站在线观看视频| 丰满的人妻完整版| 免费黄网站久久成人精品| 欧美又色又爽又黄视频| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品精品国产色婷婷| 九色国产91popny在线| 五月伊人婷婷丁香| 女人被狂操c到高潮| 成人毛片a级毛片在线播放| 中国美女看黄片| 欧美激情国产日韩精品一区| 听说在线观看完整版免费高清| 观看免费一级毛片| 国产一区二区在线观看日韩| 国内精品久久久久久久电影| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久久久国内视频| 亚洲专区国产一区二区| 一区二区三区四区激情视频 | 老女人水多毛片| 国产真实伦视频高清在线观看 | 亚洲国产精品sss在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 1000部很黄的大片| 97热精品久久久久久| 亚洲最大成人中文| 校园人妻丝袜中文字幕| 色5月婷婷丁香| 亚洲精品粉嫩美女一区| 99热精品在线国产| 99热只有精品国产| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲美女视频黄频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 岛国在线免费视频观看| 亚洲欧美日韩东京热| 露出奶头的视频| 亚洲在线自拍视频| 亚洲精品色激情综合| 久久久久久久久久久丰满 | 一级黄片播放器| 日韩中文字幕欧美一区二区| 精品久久久久久久末码| 国产精品乱码一区二三区的特点| 免费观看人在逋| 成人精品一区二区免费| 久久久久久久午夜电影| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产欧美日韩精品亚洲av| 精品久久久久久久久久久久久| 国产 一区精品| 亚洲人与动物交配视频| 国产高清视频在线播放一区| 欧美色视频一区免费| 国产熟女欧美一区二区| 国模一区二区三区四区视频| 波野结衣二区三区在线| 夜夜爽天天搞| 婷婷精品国产亚洲av| 我要搜黄色片| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 草草在线视频免费看| 成人二区视频| 美女免费视频网站| 亚洲av不卡在线观看| 国产一区二区三区av在线 | 麻豆成人午夜福利视频| 成人av一区二区三区在线看| 成人av在线播放网站| 国产一区二区三区视频了| 一本久久中文字幕| 亚洲第一区二区三区不卡| 最后的刺客免费高清国语| 网址你懂的国产日韩在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日本免费a在线| 搡老熟女国产l中国老女人| 丰满乱子伦码专区| 免费av观看视频| 亚洲无线在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 床上黄色一级片| 亚洲三级黄色毛片| 天堂√8在线中文| 亚洲在线观看片| 亚洲精品色激情综合| 国产 一区 欧美 日韩| 一进一出好大好爽视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲男人的天堂狠狠| 一a级毛片在线观看| 精品日产1卡2卡| 精品人妻视频免费看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产精品一区www在线观看 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲男人的天堂狠狠| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 亚洲av美国av| 99热这里只有是精品50| 波多野结衣高清作品| 亚洲天堂国产精品一区在线| 免费电影在线观看免费观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 波多野结衣高清作品| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美黑人欧美精品刺激| 免费观看精品视频网站| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产精品野战在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲成av人片在线播放无| 露出奶头的视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 少妇的逼好多水| 窝窝影院91人妻| 长腿黑丝高跟| 日韩欧美在线乱码| 国产伦人伦偷精品视频| 黄色一级大片看看| 国产精品久久久久久av不卡| 国产亚洲精品久久久久久毛片| a在线观看视频网站| av.在线天堂| 一本一本综合久久| 男女啪啪激烈高潮av片| 免费在线观看成人毛片| 午夜免费成人在线视频| 免费看av在线观看网站| 在线观看一区二区三区| 在线播放国产精品三级| 91麻豆精品激情在线观看国产| 九色国产91popny在线| 亚洲18禁久久av| 99精品在免费线老司机午夜| 中文字幕熟女人妻在线| 天天一区二区日本电影三级| 天天躁日日操中文字幕| 欧美三级亚洲精品| 乱系列少妇在线播放| 日韩欧美国产一区二区入口| 一级av片app| 少妇丰满av| 亚洲第一电影网av| 波多野结衣高清作品| 免费一级毛片在线播放高清视频| 中文字幕熟女人妻在线| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产成人aa在线观看| av在线观看视频网站免费| 色视频www国产| www日本黄色视频网| 亚洲人成网站在线播| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 国产在线男女| 免费观看人在逋| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产精华一区二区三区| 欧美一区二区精品小视频在线| 一进一出抽搐动态| 国产精品福利在线免费观看| 精品久久久久久成人av| 亚洲av免费在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产成人福利小说| 亚洲,欧美,日韩| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲色图av天堂| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国内精品美女久久久久久| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 精品午夜福利视频在线观看一区| 国产免费av片在线观看野外av| 国产精品一区二区免费欧美| 国产av不卡久久| 亚洲午夜理论影院| 18+在线观看网站| 国国产精品蜜臀av免费| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美黑人巨大hd| 成年女人看的毛片在线观看| x7x7x7水蜜桃| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲不卡免费看| 亚州av有码| 国产欧美日韩精品一区二区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 成人国产综合亚洲| 亚洲av免费高清在线观看| 97碰自拍视频| 亚洲avbb在线观看| 波多野结衣高清作品| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 又爽又黄无遮挡网站| 2021天堂中文幕一二区在线观| 极品教师在线视频| 草草在线视频免费看| 久久精品国产亚洲av天美| 久久久久久伊人网av| 免费人成在线观看视频色| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国内精品一区二区在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 成人毛片a级毛片在线播放| 日本黄色片子视频| 一进一出好大好爽视频| 麻豆一二三区av精品| av在线天堂中文字幕| 亚洲av五月六月丁香网| 精品一区二区三区视频在线| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲自偷自拍三级| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲五月天丁香| 国产极品精品免费视频能看的| 少妇人妻精品综合一区二区 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 99riav亚洲国产免费| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 欧美中文日本在线观看视频| 免费电影在线观看免费观看| 免费av观看视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 免费观看在线日韩| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美潮喷喷水| 日本爱情动作片www.在线观看 | 美女黄网站色视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 欧美黑人巨大hd| 一进一出抽搐gif免费好疼| 麻豆av噜噜一区二区三区| 丰满的人妻完整版| 午夜日韩欧美国产| 色精品久久人妻99蜜桃| 成人国产一区最新在线观看| 久久99热6这里只有精品| av中文乱码字幕在线| 久久久久性生活片| 国产三级中文精品| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产高清视频在线播放一区| 99精品久久久久人妻精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 午夜精品在线福利| 国产一区二区三区视频了| 国产亚洲欧美98| 亚洲av.av天堂| 在线国产一区二区在线| 毛片一级片免费看久久久久 | 国产成人影院久久av| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲人成网站在线播| 有码 亚洲区| 日韩精品中文字幕看吧| 午夜精品久久久久久毛片777| 成人三级黄色视频| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美日韩乱码在线| 日本黄大片高清| 亚洲成a人片在线一区二区| 黄色女人牲交| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 欧美成人性av电影在线观看| 悠悠久久av| 人妻久久中文字幕网| 变态另类丝袜制服| 精品福利观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 婷婷六月久久综合丁香| 色综合婷婷激情| 久久亚洲真实| 此物有八面人人有两片| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 淫秽高清视频在线观看| 女同久久另类99精品国产91| 久久99热6这里只有精品| 美女黄网站色视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 在现免费观看毛片| 91av网一区二区| 国产探花在线观看一区二区| 91久久精品国产一区二区成人| 12—13女人毛片做爰片一| 中文字幕免费在线视频6| 变态另类丝袜制服| 亚洲av五月六月丁香网| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产在线男女| 久久久久国内视频| 无遮挡黄片免费观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产伦人伦偷精品视频| 日韩欧美 国产精品| 人妻久久中文字幕网| 久久精品综合一区二区三区| 国语自产精品视频在线第100页| 在线免费观看不下载黄p国产 | 免费av观看视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 久久久久久久亚洲中文字幕| 岛国在线免费视频观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 中文在线观看免费www的网站| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久久国产成人精品二区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 白带黄色成豆腐渣| 久久精品国产亚洲网站| 88av欧美| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 真人一进一出gif抽搐免费| www日本黄色视频网| 国产在线男女| 春色校园在线视频观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 精品一区二区三区av网在线观看| 久久6这里有精品| 亚洲av中文av极速乱 | 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 国产极品精品免费视频能看的| 午夜福利成人在线免费观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 在线观看免费视频日本深夜| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 久久精品综合一区二区三区| 在线天堂最新版资源| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 成人国产综合亚洲| 很黄的视频免费| 88av欧美| 国产黄片美女视频| 日本黄色片子视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美区成人在线视频| 国产精品久久久久久久久免| 精品久久国产蜜桃| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲国产欧美人成| 成人特级黄色片久久久久久久| 校园春色视频在线观看| 日韩强制内射视频|