miRNA-21及PTEN在肺腺癌組織中的表達(dá)及意義

莫俊賢 冼磊

摘要：目的? 觀察肺腺癌組織中miRNA-21的表達(dá)情況，為miRNA-21成為新的肺腺癌靶點(diǎn)基因提供臨床依據(jù)。方法? 收集自2017年6月～2019年6月廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院共53例肺腺癌患者的癌組織、配對(duì)癌旁組織以及12例非癌疾病肺組織。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（qPCR）檢測(cè)其miRNA-21和PTEN的表達(dá)情況，并分析二者的相關(guān)性。結(jié)果? 肺腺癌組織中miRNA-21表達(dá)高于癌旁組織和非癌肺組織，其中Ⅲ～Ⅳ期患者中高于Ⅰ～Ⅱ期患者;肺腺癌組織中PTEN低于癌旁組織和非癌肺組織，其中Ⅲ～Ⅳ期患者中低于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）; miRNA-21和PTEN的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.663，P<0.05）。結(jié)論? miRNA-21在肺腺癌組織中抑制了PTEN的表達(dá)，miRNA-21極有可能成為肺腺癌的治療靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：肺腺癌;miRNA-21;PTEN;實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.09.022

文章編號(hào)：1006-1959（2020）09-0077-03

Expression and Significance of miRNA-21 and PTEN in Lung Adenocarcinoma

MO Jun-xian1，XIAN Lei2

（1.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery，the Seventh Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，

Wuzhou 543000，Guangxi，China;

2.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery，the Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，

Nanning 530007，Guangxi，China）

Abstract：Objective? To observe the expression of miRNA-21 in lung adenocarcinoma tissues and provide a clinical basis for miRNA-21 to become a new target gene for lung adenocarcinoma.Methods? From June 2017 to June 2019， 53 cases of lung adenocarcinoma patients' cancer tissues， paired paracancerous tissues and 12 cases of non-cancer disease lung tissues were collected from the Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University. Real-time fluorescence quantitative PCR （qPCR） was used to detect the expression of miRNA-21 and PTEN， and to analyze the correlation between the two.Results? The expression of miRNA-21 in lung adenocarcinoma tissues was higher than that in paracancerous tissues and non-cancerous lung tissues. Among them， stage III to IV patients were higher than those in stage I to II patients; PTEN in lung adenocarcinoma tissues was lower than that in paracancerous tissues and noncancerous lung tissues.Among them， the patients in stage III to IV were lower than those in stage I to II， the difference was statistically significant （P<0.05）; the expression of miRNA-21 and PTEN was negatively correlated（r=-0.663，P<0.05）.Conclusion? miRNA-21 inhibits the expression of PTEN in lung adenocarcinoma tissues. miRNA-21 is very likely to be a therapeutic target for lung adenocarcinoma.

Key words：Lung adenocarcinoma;miRNA-21;PTEN;Real-time fluorescence quantitative PCR

近年來(lái)，肺癌的發(fā)病率一直高居各種惡性腫瘤中首位，并呈上升趨勢(shì)，每年在全球范圍內(nèi)造成近200萬(wàn)人死亡，其中腺癌已成為肺癌中最常見(jiàn)的病理類(lèi)型[1]。雖然針對(duì)不同靶點(diǎn)基因的多種靶向藥物的廣泛應(yīng)用，使得肺腺癌的患者五年生存率有所上升，但總體生存率依然不高，因此尋找潛在的新的基因靶點(diǎn)有助于進(jìn)一步改善患者預(yù)后。miRNA是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于真核生物中的一類(lèi)非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸，其參與許多細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中的發(fā)育、代謝、生存、分化、增殖、凋亡和免疫應(yīng)答等過(guò)程[2]。相關(guān)研究結(jié)果表明[3-5]，在胃癌、前列腺癌、乳腺癌等患者中，miRNA能夠調(diào)控抑癌基因第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因（phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10，PTEN）的表達(dá)，然而在肺腺癌患者中的miRNA與PTEN關(guān)系研究相對(duì)較少。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法檢測(cè)miRNA-21與PTEN在肺腺癌患者的肺癌組織、癌旁組織（距離癌組織>5 cm）、非癌疾病肺組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步證實(shí)肺腺癌中miRNA-21與PTEN的關(guān)系，以期能為miRNA-21成為肺腺癌的靶點(diǎn)基因提供臨床實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料? 收集自2017年6月～2019年6月廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院通過(guò)手術(shù)切除的未經(jīng)術(shù)前放、化療的原發(fā)性肺腺癌53例，以及同期患肺部良性疾病切除的非癌肺組織標(biāo)本12例，其中支氣管擴(kuò)張3例，炎性假瘤6例，結(jié)核球3例。肺癌患者男33例，女20例，年齡39～78歲，平均年齡（55.32±8.91）歲;非肺癌患者男8例，女4例，年齡28～65歲，平均年齡（46.78±13.13）歲。肺癌患者與非肺癌患者性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，并同患者的家屬簽署相關(guān)知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1資料收集? 肺腺癌患者取手術(shù)切除的腫瘤組織以及其相對(duì)應(yīng)的距離癌組織邊緣>5 cm的癌旁組織，非肺癌患者組中取相應(yīng)病變組織標(biāo)本。所有標(biāo)本均在離體后30 min內(nèi)放置-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 qPCR檢測(cè)? miRNA-21及PTEN mRNA的表達(dá)? 使用mRNA提取試劑盒（購(gòu)自TIGEN公司）按照說(shuō)明書(shū)步驟嚴(yán)格在低溫環(huán)境下提取標(biāo)本的總mRNA，用分光儀根據(jù)D260/D280的比值來(lái)評(píng)估所提取mRNA的質(zhì)量，并通過(guò)測(cè)定值計(jì)算mRNA的濃度。將提取的mRNA根據(jù)濃度稀釋配比后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TIGEN公司）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后采用SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版（TIANGEN公司）qPCR技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本中的miRNA-21及PTEN mRNA的表達(dá)量，引物及內(nèi)參均由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。miRNA-21 forward：5'-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3';reverse：5'-CAG TGCAGGGTCCGAGGTAT-3'。PTEN forward：5'-AC CCACCACAGCTAGAACTT-3';reverse：5'-GGGA AT AGTTACTCCCTTTTTGTC-3'。GAPDH引物序列：forward ：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'，reverse：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 2 min，94 ℃變性 20 s，53 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。所有試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，反應(yīng)結(jié)束后， 保存溶解曲線、擴(kuò)增曲線及對(duì)應(yīng)Ct值（達(dá)到閾值循環(huán)數(shù)）。mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算， 計(jì)算公式為：△CT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因;△△CT=△CT目的基因-對(duì)照組目的基因△CT平均值;2-△△Ct表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3觀察指標(biāo)? 分析不同組織中miRNA-21及PTEN mRNA的表達(dá)情況、比較肺腺癌患者不同臨床特征miRNA-21及PTEN mRNA的表達(dá)情況及肺腺癌組織中miRNA-21與PTEN的表達(dá)的相關(guān)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，兩指標(biāo)間的相關(guān)性經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同組織中miRNA-21及PTEN的mRNA表達(dá)情況? 肺腺癌組織中的miRNA-21表達(dá)量高于癌旁組織和非癌肺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;但癌旁組織與非癌肺組織miRNA-21表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。肺腺癌組織中的PTEN表達(dá)量低于癌旁組織和非癌肺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;但癌旁組織與非癌肺組織PTEN表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

2.2肺腺癌患者不同臨床特征miRNA-21及PTEN mRNA的表達(dá)情況比較? 不同年齡、性別、病理分化程度患者miRNA-21和PTEN表達(dá)分別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;miRNA-21的表達(dá)在Ⅲ～Ⅳ期的肺腺癌患者的表達(dá)量高于Ⅰ～Ⅱ期患者，PTEN的表達(dá)在Ⅲ～Ⅳ期的肺腺癌患者的表達(dá)量低于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.3肺腺癌組織中miRNA-21與PTEN的表達(dá)的相關(guān)性分析? Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，肺腺癌組織中miRNA-21與PTEN的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.663，P<0.05）。

3討論

肺癌是臨床最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前腺癌已成為肺癌中最常見(jiàn)病例類(lèi)型，大部分肺腺癌患者以根治手術(shù)治療為主，其余治療手段包括化療、放療、靶向治療及生物治療等為輔助治療的綜合治療，如近年來(lái)EGFR、ALK等靶向基因的逐步明確，各種針對(duì)靶向基因的靶向藥物在世界范圍內(nèi)得到廣泛開(kāi)展，但由于服藥后腫瘤細(xì)胞的基因突變導(dǎo)致各種耐藥性的產(chǎn)生，目前患者的總體的生存率仍偏低[6，7]。因此，尋找另外的肺癌靶向位點(diǎn)將有助于改善患者的預(yù)后。

PTEN是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，PTEN基因編碼的蛋白具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重特異性磷酸酶活性，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[8]。同時(shí)，異常的細(xì)胞增殖是腫瘤生物學(xué)的一個(gè)重要特征，而miRNA在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡方面起重要作用[2]。目前已發(fā)現(xiàn)的miRNAs約有700余種，miRNA-21是其中一個(gè)重要的miRNA分子，最近研究發(fā)現(xiàn)miRNA-21在多種腫瘤組織中的呈現(xiàn)高表達(dá)，如乳腺癌、結(jié)腸癌、腦膜瘤等[9-11]。本研究中肺腺癌組織中的miRNA-21表達(dá)量高于癌旁組織和非癌肺組織，PTEN表達(dá)量低于癌旁組織和非癌肺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;但癌旁組織與非癌肺組織miRNA-21、PTEN表達(dá)量分別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與上述研究一致。但miRNA-21和PTEN在肺腺癌中的表達(dá)水平及兩者間的關(guān)系的研究報(bào)道較少。

本研究肺腺癌組織中的miRNA-21呈高表達(dá)水平，PTEN呈低表達(dá)水平，且miRNA-21與PTEN的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.663，P<0.05），提示肺腺癌組織中miRNA-21的表達(dá)上調(diào)有可能在某個(gè)通路上抑制了PTEN的表達(dá)，PTEN的表達(dá)降低導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡的功能下降，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。考慮為miRNA-21序列與PTEN基因mRNA 3'-UTR區(qū)的互補(bǔ)性結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制，從而調(diào)控PTEN基因的表達(dá)，提示miRNA-21可能主要在翻譯水平調(diào)控PTEN基因的表達(dá)，PTEN基因可能是miRNA-21的靶基因[12]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，miRNA-21及PTEN的表達(dá)與臨床分期有關(guān)，臨床分期越晚，miRNA-21的表達(dá)水平越高，而PTEN的表達(dá)水平越低，但二者表達(dá)與患者的性別、年齡以及病理分化程度無(wú)關(guān)，提示miRNA-21與肺腺癌中的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及侵襲能力可能相關(guān)。因此，本研究提示miRNA-21可能成為肺腺癌的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，在肺腺癌組織中，miRNA-21與PTEN表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，miRNA-21的高表達(dá)可通過(guò)在翻譯水平下調(diào)PTEN的表達(dá)，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，因此miRNA-21極有可能成為肺腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。

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收稿日期：2020-02-18;修回日期：2020-02-25

編輯/肖婷婷

作者簡(jiǎn)介：莫俊賢（1988.3-），男，廣西梧州人，博士研究生，主治醫(yī)師，主要從事肺癌的精準(zhǔn)治療研究