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    AMD3100聯(lián)合G-CSF對2型糖尿病小鼠骨髓EPCs動員的培養(yǎng)

    2020-06-08 10:52:33潘滿昌林曉瑩汪虹冷敏
    醫(yī)學(xué)信息 2020年9期
    關(guān)鍵詞:移植糖尿病

    潘滿昌 林曉瑩 汪虹 冷敏

    摘要:目的? 研究AMD3100聯(lián)合G-CSF對糖尿病骨髓內(nèi)皮祖細胞的培養(yǎng)方法和生物學(xué)功能。方法? 選用6周齡健康雄鼠,將10只db/db小鼠設(shè)為db/db組,10只db/+小鼠設(shè)為db/+組。采用AMD3100與CSF聯(lián)合動員骨髓內(nèi)皮祖細胞的方法,每只小鼠第1天注射AMD3100,后續(xù)連續(xù)注射5 d G-CSF,在第10天心臟采血制備EPCs。采用流式細胞儀檢測CD34+/CD133+/CD309+細胞的比例進行鑒定,鑒定成功的EPCs采用CCK-8法、Matrigel檢測細胞增殖及成管功能。采用PCR檢測細胞表面標志物:血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)細胞衍生因子(SDF-1)、趨化因子受體4(CXCR4)基因表達情況。結(jié)果? ①從處理后的第3天開始,db/+組的OD450值較db/db組增高(P=0.05);②0和48 h db/+組EPCs遷移面積分別為(204088.100±219.200)μm、 (144724.900±199.400)μm,大于db/db組的(200985.700±232.600)μm、(155075.300±213.100)μm(P<0.05);③db/+組管腔形成數(shù)量為(29.330±1.764)個,多于db/db組的(24.000±2.082)個(P<0.05)。結(jié)論? 采用AMD3100聯(lián)合G-CSF動員2型糖尿病骨髓內(nèi)皮祖細胞的方法成功從外周血中分離出EPCs,經(jīng)體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)2型糖尿病狀態(tài)下EPCs的增殖,遷移和成管等功能均受損。

    關(guān)鍵詞:糖尿病;內(nèi)皮祖細胞;聯(lián)合動員;移植

    中圖分類號:R587.2;R-33? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼:A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI:10.3969/j.issn.1006-1959.2020.09.018

    文章編號:1006-1959(2020)09-0057-06

    Cultivation of Bone Marrow EPCs in Type 2 Diabetic Mice by AMD3100 and G-CSF

    PAN Man-chang,LIN Xiao-ying,WANG Hong,LENG Min

    (Department of Burns,the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650000, Yunnan,China)

    Abstract:Objective? To study the culture method and biological function of AMD3100 combined with G-CSF on diabetic bone marrow endothelial progenitor cells.Methods? Six-week-old healthy male rats were selected, 10 db/db mice were set as db/db group, and 10 db/+ mice were set as db/+ group. AMD3100 and CSF were used to mobilize bone marrow endothelial progenitor cells. Each mouse was injected with AMD3100 on the first day, followed by continuous injection of G-CSF for 5 d, and blood was collected on the 10th day to prepare EPCs. Flow cytometry was used to detect the ratio of CD34+/CD133+/CD309+ cells for identification. Successful EPCs were identified by CCK-8 method and Matrigel to detect cell proliferation and tube formation function. PCR was used to detect cell surface markers: vascular endothelial growth factor (VEGF), stromal cell-derived factor (SDF-1), and chemokine receptor 4 (CXCR4) gene expression.Results? ①From the third day after treatment, the OD450 value of the db/+ group was higher than that of the db/db group (P=0.05); ②The migration area of EPCs in the 0 and 48 h db/+ groups was (204088.100±219.200) μm, (144724.900±199.400) μm,(200985.700±232.600) μm and (155075.300±213.100) μm (P<0.05) greater than the db/db group; ③The number of lumens formed in the db/+group was (29.330±1.764), which was more than (24.000±2.082) in the db/db group (P<0.05).Conclusion? In this experiment, AMD3100 and G-CSF were used to mobilize type 2 diabetic bone marrow endothelial progenitor cells. EPCs were successfully isolated from peripheral blood, and the proliferation, migration and tube formation of EPCs in type 2 diabetes were impaired by in vitro culture.

    Key words:Diabetes;Endothelial progenitor cells;Joint mobilization;Transplantation

    內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一類旁分泌各種血管生成因子參與內(nèi)皮細胞功能的前體細胞。自1997年首次用磁珠法從成人外周血(PB)中分離出來,越來越多證據(jù)表明EPCs在病理生理下參與血管新生[1-3]。近年大量研究發(fā)現(xiàn)糖尿病狀態(tài)下EPCs被“拘留”于骨髓,致EPCs在外周血中數(shù)量減少、功能障礙及生物學(xué)活性降低[3,4]。因此,糖尿病EPCs的動員和體外分離培養(yǎng)成為研究的熱點。近年雖國內(nèi)外很多有關(guān)EPCs報道[5-7]。但有關(guān)糖尿病EPCs聯(lián)合動員后外周血的分離培養(yǎng)研究報道尚少。既往研究發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠聯(lián)合動員第10天EPCs達到峰值。本研究以期通過聯(lián)合動員獲得糖尿病狀態(tài)下峰值的EPCs進行體外培養(yǎng),獲得外周血EPCs分離培養(yǎng)方法,并通過細胞增殖、遷移和成管等情況,獲得EPCs體外培養(yǎng)的可靠來源,為深入研究糖尿病EPCs的功能障礙及以后臨床應(yīng)用作參考。

    1材料與方法

    1.1實驗動物? 選取6 周齡SPF級db/db小鼠(25~30 g)和db/+小鼠(25~30 g)各10只雄性,db/db小鼠(糖尿病狀態(tài)) 是由C57小鼠(非糖尿病狀態(tài))近親交配株常染色體隱性純合子遺傳衍化建立的2型糖尿病模型;db/+小鼠是由C57小鼠近親交配株常染色體雜合子遺傳衍化,無糖尿病癥狀。購自常州卡文斯實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(蘇)2016-0010。飼養(yǎng)于昆明泉港生物科技有限公司實驗動物中心飼養(yǎng)。

    1.2主要的試劑和器材? AMD3100(Selleck 公司),rhG-CSF(齊魯制藥有限公司),0.9%氯化鈉注射液(上海百特醫(yī)療用品有限公司),肝素鈉注射液(江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司),PE/Cy7 anti-mouse CD34(abcam公司),APC anti-mouse CD133(abcam公司),PE anti-mouse CD309(Flk-1)(abcam公司),F(xiàn)AC SCantoⅡ流式儀(BD 公司)。

    1.3實驗動物的分組及給藥方法? 選取6周齡健康雄鼠,將10只db/db小鼠設(shè)為db/db組,10只db/+小鼠設(shè)為db/+組。①db/db組動員方案為AMD3100+G-CSF:取10只db/db雄鼠,每只小鼠第1天注射AMD3100,后續(xù)連續(xù)注射5 d G-CSF,在第10天心臟采血制備EPCs。②db/+組:方法同db/db組。

    1.4 AMD3100、G-CSF的注射劑量及配制? AMD3100和G-CSF動員EPCs皮下注射劑量參照國內(nèi)外文獻:AMD3100 6 mg/(kg·d),G-CSF 100 mg/(kg·d)[8,9]。AMD3100 注射液配制方法如下:將AMD3100用PBS溶解,配制成濃度為50 mg/ml的溶液,并置于-20 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩6鳪-CSF可直接進行皮下注射,置于4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5實驗方法

    1.5.1小鼠外周血中EPCs的分離培養(yǎng)及收集? 采用1%的戊巴比妥將實驗小鼠麻醉,用2.5 ml含有肝素的注射器在胸前心尖搏動最明顯部位采血。然后采用密度梯度離心法提取單個核細胞,用PBS洗滌? ?2次,用含10%胎牛血清的內(nèi)皮組細胞培養(yǎng)液重懸細胞,制成單細胞懸液分別接種到50 ml培養(yǎng)瓶中,37℃、5% CO2件下培養(yǎng),每3 d換液1次,收集15 d細胞進行實驗。

    1.5.2流式細胞術(shù)分析鑒定? 將細胞消化后用100 μl staining buffer重懸細胞,加入適量熒光標記表面抗體(PE/Cy7 anti-mouse CD34/APC anti-mouse CD133/PE anti-mouse CD309)染色,室溫避光染色30 min,然后洗滌細胞并使用Guava easyCyteTM流式細胞儀(Millipore,Billerica,USA)分析。

    1.5.3 EPCs熒光雙染色鑒定? 取14 d的細胞在含Dil-acLDL(10 μg/ml)和FITC-UEA-1(10 μg/ml)的培養(yǎng)液中避光孵育,然后在激光共聚焦熒光顯微鏡進行觀察。

    1.5.4 CCK-8細胞增殖實驗? 將細胞傳代在96孔板中,并處于對數(shù)生長期的各細胞消化、計數(shù),均勻的鋪在96孔板(5000個/孔)。各孔加入10 μl CCK8試劑測定第1、3、5、7 天增殖情況,用酶標儀檢測OD450(optical density),單位:nm,繪制曲線。

    1.5.5劃痕遷移實驗? 將EPCs制成單細胞懸液接種到6孔細胞培養(yǎng)板。EPCs接種48 h后用槍頭在單細胞層上輕輕劃一道傷痕。劃痕結(jié)束后用 PBS洗去除劃下細胞,拍照記錄0 、48 h對遷移面積拍照6張照片,并放大(×40),重復(fù)實驗3次。用軟件 Image J 計算細胞遷移率(Rn):Rn(%)=24h遷移面積(0 h的劃痕面積-24 h的劃痕面積)與0 h面積的比值。

    1.5.6管腔形成實驗? 在6孔板中加入100 μl基質(zhì)膠,常溫離心20 min、 1500 r/min。在培養(yǎng)箱放置1 h,水化1 ml EPCs后將其緩慢預(yù)鋪基質(zhì)膠孔內(nèi),8 h后在顯微鏡(×100)下拍照,每個孔隨機拍照8張,重復(fù)實驗3次,每孔平均值為管腔形成數(shù)目,統(tǒng)計分析。

    1.6統(tǒng)計學(xué)處理? 使用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件處理所有的數(shù)據(jù),計量資料采用(x±s)表示,相同時間點不同組別之間采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t法,同一組別不同時間點之間的比較采用配對樣本t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2結(jié)果

    2.1實驗動物的基本情況? 兩組小鼠在動員藥物皮下注射結(jié)束后,精神狀況良好,飲食、體重無明顯變化,均無意外死亡情況。

    2.2細胞的形態(tài)學(xué)觀察? 分離的單個核細胞第2天細胞密集,較小的類圓形,呈懸浮狀態(tài);第6天細胞在倒置顯微鏡觀察下活力比較旺盛,折光度好,細胞形態(tài)呈橢圓形或梭形,大小不等,可以見部分細胞已貼壁。傳至第15天細胞逐漸變大,伸出偽足樣突起,成紡錘體形細胞,形態(tài)此時較穩(wěn)定,倒置顯微鏡下貼壁細胞透亮度增強,成單層細胞貼壁生長,見圖1。

    2.3培養(yǎng)后EPCs鑒定

    2.3.1流式細胞術(shù)分析? db/+小鼠外周血培養(yǎng)第15天 EPCs表達CD34、CD133及CD309,表達率分別為(72.23±3.84)%、(75.09±17.92)%及(80.98±0.53)%。db/db小鼠培養(yǎng)的第15 天EPCs表達CD34、CD133及CD309,表達率分別為(64.49±4.64)%、(85.19±18.39)%及(88.90±0.56)%,以上培養(yǎng)的細胞都是EPCs,見圖2。

    2.3.2 EPCs熒光雙染色鑒定? 熒光顯微鏡觀察可見:PBMC提取培養(yǎng)15 d的EPC,細胞吞噬FITC-UEA-1示綠色熒光;細胞吞噬Dil-acLDL示紅色熒光;Merge為前兩張照片的融合圖,即EPCs是雙陽性染色攝取Dil-acLDL并結(jié)合FITC-UEA-1,呈現(xiàn)黃色熒光的細胞認為是分化狀態(tài)的EPCs,見圖3。

    2.4 CCK-8細胞增殖實驗? 通過對db/db與db/+小鼠外周血培養(yǎng)15天的EPCs,在第1、3、5、7天的增殖情況顯示:db/+小鼠EPCs的增殖曲線較陡。比較各時間點各組OD450時發(fā)現(xiàn),從處理后的第3天開始,db/+組的OD450值較db/db組均顯著增高(F=9.777,P=0.000),見表1。

    2.5 劃痕遷移實驗? 將EPCs接種到6孔細胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)0 h與48 h遷移距離,結(jié)果顯示:0 h 和48 h db/+組EPCs遷移面積分別為(204088.1±219.2)μm、(144724.9±199.4)μm,大于db/db組的(200985.7±232.6)μm、(155075.3±213.1)μm,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

    2.6管腔形成實驗? 將培養(yǎng)的EPCs 種植在 Matrigel 上8 h形成毛細血管樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。db/+組管腔形成數(shù)量(29.330±1.764)個,大于db/db組的(24.000±2.082)個,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖5。

    3討論

    目前全球有4.25億糖尿病患者,每11位成人中就有1位罹患糖尿病,此外還有3.5億多糖尿病高危人群。預(yù)計到2045年,將會有近7億糖尿病患者。流行病學(xué)研究顯示,超過1/3的慢性難愈合創(chuàng)面患者是因糖尿病造成的,已經(jīng)代替創(chuàng)傷成為造成慢性難愈合創(chuàng)面的首要原因[10]。利用EPCs趨化到受損血管部位,修復(fù)受損內(nèi)皮細胞并增殖分化新的內(nèi)皮細胞進而修復(fù)血管功能,近年來成為創(chuàng)面修復(fù)領(lǐng)域成為一個新策略。

    EPCs可從骨髓、臍血、胚胎肝和外周血中(15∶10∶2∶1)分離培養(yǎng)獲得,而骨髓中所占比例最大[11]。成年后主要來源于骨髓,能夠替代損傷的血管內(nèi)皮細胞,維持血管內(nèi)皮的完整性[12]。外周血中EPCs主要來源于骨髓[13]。而糖尿病EPCs數(shù)量稀少,功能障礙及活性降低,成功培養(yǎng)糖尿病EPCs成為學(xué)者進一步研究的難點。而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)通過AMD3100聯(lián)合G-CSF可增加外周血中EPCs的數(shù)量,即EPCs在db/db小鼠外周血比例約占1.88%,在db/+小鼠外周血約占2.35%[9];而正常情況下EPCs僅占骨髓和外周血的0.01%[14]。該方法已經(jīng)大幅度提高了外周血中EPCs的含量,且占比高于骨髓。但其相關(guān)功能和活性變化還未明確,因此,本研究對糖尿病小鼠動員后的EPCs進行分析。

    本研究采用db/db小鼠是由C57小鼠近親交配株常染色體隱性遺傳衍化建立的2型糖尿病模型,以胰島素抵抗和胰島β細胞功能減退為特征,該模型是未經(jīng)任何有意識的人為處置,在自然條件下發(fā)生糖尿病的小鼠模型,其優(yōu)點為模型小鼠糖尿病的發(fā)生發(fā)展進程與人類2型糖尿病相似,近階段具有較高的應(yīng)用價值[15,16]。首先,動員后采集外周血提取單個核細胞,用內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng),經(jīng)流式細胞術(shù)檢測EPCs特異性的表達產(chǎn)物CD34、CD133及CD309表達率達80%~90%,以及EPCs可攝取植物凝集素(UEA-1)和結(jié)合乙酰化低密度脂蛋白(acLDL),并表達內(nèi)皮細胞和祖細胞的混合表型,證實絕大多數(shù)的細胞是EPCs。細胞的形態(tài)和功能檢測也表明已經(jīng)成功分離培養(yǎng)出EPCs。本實驗采用密度離心法從動員后的小鼠外周血中分離單個核細胞,經(jīng)離心制成重懸的細胞,移入含有血管內(nèi)皮生長因子等多種生長因子的特殊培養(yǎng)基,誘導(dǎo)細胞分化成EPCs。在第6天倒置顯微鏡下觀察細胞成橢圓形或梭形,大小不等,細胞密集,可見有部分細胞貼壁;此時細胞形態(tài)還未穩(wěn)定。到達第15天可見細胞逐漸伸出偽足,形成紡錘體樣,細胞基本完全貼壁,細胞融合成鋪路石樣生長。經(jīng)流失細胞術(shù)和攝取UEA-1和結(jié)合acLDL雙熒光染色鑒定已經(jīng)成功分離。

    EPCs具有增殖,遷移和成管的生物學(xué)特性,在一定的刺激下可募集,歸巢到血管受損處,參與血管的重建和修復(fù)。目前認為 EPCs 促進血管新生的機制包括兩個方面:一方面是通過自身的分化增殖而形成新生血管,無需依賴原來的血管系統(tǒng);另一方面,EPCs 本身可以分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等細胞因子,通過旁分泌效應(yīng)增強局部血管內(nèi)皮細胞,即增強血管生成效應(yīng)[17]。而大量研究發(fā)現(xiàn)糖尿病狀態(tài)下的EPCs功能和活性受到抑制[3,4]。Maiorino MI等[18]發(fā)現(xiàn)循環(huán)CD34+細胞水平的降低提示日本2型糖尿病患者冠心病的發(fā)生有關(guān),此外,與非糖尿病患者相比,2型糖尿病損害了急性心肌梗死后CD133+細胞數(shù)量的增加和趨化反應(yīng),這可能解釋了缺血后血管延遲愈合和心肌恢復(fù)[19]。有研究將健康人和糖尿病患者的EPCs移植到裸鼠損傷的頸動脈內(nèi),發(fā)現(xiàn)與健康人EPCs比,糖尿病患者EPCs在體內(nèi)再內(nèi)皮化和抑制內(nèi)膜增厚能力更低。

    本實驗檢測了2型糖尿病EPCs的體外功能,發(fā)現(xiàn)功能較正常小鼠低,這與之前的研究一致。糖尿病狀態(tài)下EPCs的數(shù)量和功能是修復(fù)創(chuàng)面的關(guān)鍵因素。目前雖有大量有關(guān)改善糖尿病環(huán)境下EPCs功能文獻報道。如抑制炎癥反應(yīng),氧化應(yīng)激,促進動員,抑制凋亡等。但闡明糖尿病EPCs功能障礙的機制對于將其應(yīng)用于創(chuàng)面修復(fù)是至關(guān)重要。而通過體內(nèi)動員,外周血體外擴大增殖培養(yǎng)自體移植可以避免免疫反應(yīng)及骨髓穿刺的痛苦。這有望成為治療和預(yù)防糖尿病等難治愈創(chuàng)面的新希望。

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    收稿日期:2020-03-10;修回日期:2020-03-22

    編輯/肖婷婷

    基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(編號:81660321)。

    作者簡介:潘滿昌(1990.1-),男,云南昆明人,碩士,住院醫(yī)師,主要從事慢性創(chuàng)面愈合方向的研究

    通訊作者:汪虹(1963.10-),男,云南昆明人,碩士,主任醫(yī)師,主要從事創(chuàng)面修復(fù)方向的研究

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