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    VTA Nesfatin-1信號通路參與調(diào)節(jié)糖尿病大鼠攝食及葡萄糖敏感神經(jīng)元活動 ?

    2020-06-08 15:23梁琰冷慧徐珞
    中外醫(yī)學(xué)研究 2020年9期
    關(guān)鍵詞:攝食微量葡萄糖

    梁琰 冷慧 徐珞

    【摘要】 目的:探究大鼠腹側(cè)背蓋區(qū)(VTA)微量注射nesfatin-1對正常大鼠及糖尿病大鼠攝食及葡萄糖敏感神經(jīng)元活動的影響。方法:通過向VTA微量注射nesfdatin-1及黑皮質(zhì)素3/4受體拮抗劑SHU9119觀察對正常大鼠及糖尿病大鼠葡萄糖敏感(GS)神經(jīng)元放電活動的影響;通過綜合實驗室動物監(jiān)測系統(tǒng)(CLAMS,Columbus Instruments,Ohio)觀察向VTA微量注射nesfdatin-1及黑皮質(zhì)素3/4受體拮抗劑SHU9119對正常大鼠及糖尿病大鼠攝食的影響。結(jié)果:VTA微量注射nesfatin-1后,正常大鼠和糖尿病大鼠GS-E神經(jīng)元放電活動顯著升高(P<0.05),且GS-I神經(jīng)元放電活動顯著下降(P<0.05),但糖尿病大鼠VTA注射nesfatin-1對GS反應(yīng)性神經(jīng)元的興奮/抑制作用更加顯著(P<0.05);VTA微量注射nesfatin-1后,正常大鼠和糖尿病大鼠攝食量均顯著下降(P<0.05),但糖尿病大鼠攝食量下降更為顯著(P<0.05)。結(jié)論:大鼠VTA nsfatin-1信號通路參與正常大鼠及糖尿病大鼠葡萄糖敏感神經(jīng)元放電活動及攝食量的調(diào)控。

    【關(guān)鍵詞】 腹側(cè)背蓋區(qū) Nesfatin-1 糖尿病大鼠 攝食 葡萄糖敏感神經(jīng)元

    [Abstract] Objective: To investigate the effects of microinjection of nesfatin-1 into ventral dorsal tegmental area (VTA) on the feeding and glucose sensitive neuron activities in normal and diabetic rats. Method: The effects on the activity of glucose sensitive (GS) neurons in normal and diabetic rats were observed by microinjection of nesfatin-1 and melanocortin 3/4 receptor antagonist SHU9119 into VTA, the effects of microinjection of nesfdatin-1 and melanocortin 3/4 receptor antagonist SHU9119 into VTA on the feeding of normal and diabetic rats were observed by means of the integrated laboratory animal monitoring system (CLAMS, Columbus Instruments, Ohio). Result: VTA neuronal firing activity increased significantly in normal and diabetic rats after microinjection nesfatin-1 (P<0.05), and decreased significantly in GS-I neurons (P<0.05), but the excitatory/inhibitory effect of injection nesfatin-1 on GS reactive neurons was more significant in diabetic rats (P<0.05). After VTA microinjection of nesfatin-1, both normal and diabetic rats decreased significantly (P<0.05), but the food intake of diabetic rats decreased more significantly (P<0.05). Conclusion: The signal pathway of VTA nsfatin-1 is involved in the discharge activity of glucose sensitive neurons and the change of food intake in normal and diabetic rats.

    2006年,研究人員發(fā)現(xiàn)一種新的腦腸肽,命名為nesfatin-1[1]。Nesfatin-1是由前體蛋白2(NUCB2)衍生而來的一種含有82個氨基酸的多肽[2-3]。Nesfatin-1起初被發(fā)現(xiàn)與攝食相關(guān),分布于大鼠下丘腦腹側(cè)背蓋區(qū)(VTA)、室旁核(PVN)、弓狀核(ARC)和孤束核(NTS)等[1]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),nesfatin-1具有廣泛的中樞和外周分布,且參與調(diào)節(jié)胃腸功能、糖和脂類代謝、能量代謝、情緒調(diào)節(jié)及心血管功能等[4-6]。

    研究發(fā)現(xiàn),體重的慢性改變也會影響nesfatin-1血清循環(huán)水平,在體重偏輕和厭食癥患者體內(nèi)nesfatin-1水平降低[7-8],但在肥胖患者體內(nèi),nesatin-1的血清循環(huán)水平升高,可能是因為nesfatin-1在胃中表達增加有關(guān),在胃切除等減肥手術(shù)后,患者體重下降,且nesfatin-1循環(huán)水平下降[9-10],這表明nesfatin-1與體重存在負相關(guān)。先前研究主要集中在外周或靜脈注射nesfatin-1對大鼠攝食及能量代謝的影響,而本研究通過向大鼠下丘腦腹側(cè)背蓋區(qū)(VTA)直接微量注射nesfatin-1,觀察對正常大鼠及糖尿病大鼠攝食及葡萄糖敏感(GS)神經(jīng)元放電活動的影響,對糖尿病的疾病進展及臨床靶向藥物的研發(fā)具有重要意義,具體如下。

    1 資料與方法

    1.1 實驗動物

    成年雄性Sprague Dawley大鼠,體質(zhì)量在220~250 g,均在室溫(25±2)℃、12 h∶12 h晝夜循環(huán)光照、實驗室標準飲食及自由進食和飲水的環(huán)境中飼養(yǎng)。實驗開始前,大鼠禁食24 h,但可自由飲水。VTA內(nèi)注射藥物后,大鼠自由攝食和飲水。所有動物實驗均嚴格按《青島大學(xué)實驗動物保護和使用管理辦法》執(zhí)行。

    1.2 糖尿病大鼠模型制備

    隨機選取70只大鼠,體重220~250 g,禁食12 h,不禁水。模型組大鼠單次腹腔注射35 mg/kg的鏈脲佐菌素(STZ,sigma)。STZ用滅菌0.1 mmol/L、pH 4.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成2%的溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。72 h后取尾靜脈血測空腹血糖高于7.0 mmol/L和餐后血糖均高于11.1 mmol/L為糖尿病大鼠建模成功。未成模者或成模后緩解者淘汰。

    1.3 大鼠腦核團置管

    大鼠腹腔注射10%水合氯醛 (0.3 ml/100 g)麻醉,固定于腦立體定位儀,根據(jù)Paxinos&Watson大鼠腦圖譜用微量注射儀定位,以前囟為零點,定位大鼠下丘腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA,前囟后5.2 mm,旁開1.0 mm,深8.0 mm)。用牙科鉆鉆孔,將一不銹鋼套管置于VTA,用牙科粘固劑固定,不銹鋼管探針封閉導(dǎo)管,縫合頭皮切口。大鼠分籠飼養(yǎng),自由飲食飲水。手術(shù)結(jié)束后大鼠連續(xù)3 d給予腹腔注射8萬U青霉素以防止術(shù)后感染。大鼠恢復(fù)1周后開始實驗。

    為了檢測核團或側(cè)腦室定位是否準確,實驗結(jié)束后經(jīng)套管向大鼠VTA內(nèi)緩慢注射滂胺天藍溶液,隨后麻醉大鼠,經(jīng)心臟灌注固定,斷頭取腦,50 μm冠狀冰凍切片,顯微鏡下觀察藥物注射的位置是否準確。

    1.4 葡萄糖敏感神經(jīng)元放電

    為了檢測nesfatin-1對正常大鼠和糖尿病大鼠葡萄糖敏感神經(jīng)元放電的影響,隨機選取正常大鼠和糖尿病大鼠各30只。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100g)麻醉,并固定于腦立體定位儀,暴露顱骨,參照大鼠腦圖譜定位VTA(前囟后5.2 mm,旁開1.0 mm,深8.0 mm)。牙科鉆顱骨鉆孔,剝除腦膜暴露腦實質(zhì),使用 30~40 g/L 的瓊脂生理鹽水覆蓋腦表面。將五管玻璃微電極(電極尖端直徑 15~20 μm,電極阻抗 5~15 MΩ)用液壓推進器送至VTA。在五管玻璃微電極中:記錄電極充以20 g/L的滂胺天藍和0.5 mmol/L乙酸鈉,另外四管分別充以5 mmol/L葡萄糖(pH 7.4)、0.9%生理鹽水(NS),10 nmol/L nesfatin-1和1 nmol/L SHU9119,與四通液壓推進泵相連。注射葡萄糖(GS)后,其中部分神經(jīng)元對GS有反應(yīng),被鑒定為GS反應(yīng)神經(jīng)元。因此,將GS反應(yīng)神經(jīng)元作為后續(xù)電生理實驗基礎(chǔ)。通過短脈沖氣壓(1 500 ms, 5.0~15.0 psi)向GS反應(yīng)神經(jīng)元表面先后噴灑0.9%生理鹽水(NS),10 nmol/L nesfatin-1、1 nmol/L SHU9119和10 nmol/L nesfatin-1+1 nmol/L SHU9119,待前一藥物作用消失后,再噴灑后一藥物,觀察不同藥物對大鼠GS反應(yīng)神經(jīng)元放電活動的影響。

    當玻璃微電極尖端進入空氣與瓊脂界面時,監(jiān)聽器的聲音會發(fā)生明顯的變化。當玻璃微電極進入VTA,搜尋VTA內(nèi)神經(jīng)元,并開始記錄細胞外的放電活動。待放電頻率穩(wěn)定后(至少記錄120 s),注入5 mmol/L葡萄糖(pH 7.4),觀察神經(jīng)元放電頻率的變化,鑒別GS神經(jīng)元,以神經(jīng)元放電頻率的變化率超過20%作為神經(jīng)元興奮或抑制指標,神經(jīng)元表現(xiàn)興奮的定為葡萄糖興奮性(GE)神經(jīng)元,表現(xiàn)為抑制的定為葡萄糖抑制性(GI)神經(jīng)元。之后注射藥物,觀察藥物對GS神經(jīng)元放電頻率的影響。

    1.5 攝食量測定

    為了檢測nesfatin-1對正常大鼠和糖尿病大鼠攝食量的影響,另隨機選取正常大鼠和糖尿病大鼠各20只,各分為4組,每組5只,分別為NS組(0.5 μl NS)、Nesfatin-1組(0.5 μl 0.5 μg nesfatin-1)、SHU9119組(0.5 μl 0.25 μg SHU9119)、nesfatin-1+SHU9119組(0.5 μl 0.5 μg nesfatin-1+ 0.5 μl 0.25 μg SHU9119)。

    大鼠被安置[平均體重(205±3)g],并使其適應(yīng)環(huán)境。實驗開始前,大鼠禁食12 h,不禁水。在核團給藥之前記錄大鼠的體重。將大鼠轉(zhuǎn)移至綜合實驗室動物監(jiān)測系統(tǒng)(CLAMS;Columbus Instruments,Ohio)籠中以適應(yīng)環(huán)境,并在第一次研究之前監(jiān)測飼養(yǎng)和代謝參數(shù)4 d。分別記錄大鼠0~4 h每小時攝食量。使用與第一組大鼠體重匹配的第二組大鼠重復(fù)進行實驗,獲得相似的結(jié)果。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS 18.0和PPMS 1.5軟件分析數(shù)據(jù),計量資料均以(x±s)表示,多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩組間樣本均數(shù)比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 VTA注射nesfatin-1對正常大鼠GS敏感神經(jīng)元放電活動的影響

    在30只正常大鼠VTA共記錄到88個放電神經(jīng)元,其中64個(72.73%,64/88)神經(jīng)元對GS有反應(yīng),被鑒定為GS反應(yīng)神經(jīng)元。在64個GS反應(yīng)神經(jīng)元中,35個(54.69%,35/64)神經(jīng)元放電頻率顯著增加,鑒定為GS-E神經(jīng)元;而29個(45.31%,29/64)神經(jīng)元放電頻率下降,鑒定為GS-I神經(jīng)元。

    在35個GS-E神經(jīng)元中,nesfatin-1組中神經(jīng)元(65.71%,23/35)放電頻率高于NS組(P<0.05),平均升高(84.95±7.59)%,見表1、圖1B;若VTA微量注射黑皮質(zhì)素3/4受體拮抗劑SHU9119可部分阻斷nesfatin-1誘導(dǎo)的興奮效應(yīng)(P<0.05),見表1、圖1A;單獨注射SHU9119,正常大鼠VTA GS-E反應(yīng)神經(jīng)元放電活動無顯著改變(P>0.05),見表1、圖1A。

    在29個GS-I神經(jīng)元中,nesfatin-1組中神經(jīng)元放電頻率低于NS組(P<0.05),平均降低(48.74±2.19)%,見表1、圖1B。Nesfatin-1對正常大鼠GS-I神經(jīng)元的抑制作用可被預(yù)先VTA注射SHU9119部分阻斷(P<0.05),見表1、圖1B。提示,nesfatin-1可能通過黑皮質(zhì)素3/4受體通路參與調(diào)控正常大鼠VTA GS-E或GS-I神經(jīng)元的興奮性,單獨注射SHU9119,正常大鼠VTA GS-E反應(yīng)神經(jīng)元的放電活動無顯著改變(P>0.05),見表1、圖1B。

    2.2 VTA注射nesfatin-1對糖尿病大鼠GS敏感神經(jīng)元放電活動的影響

    在30只糖尿病大鼠VTA共記錄到94個放電神經(jīng)元,其中67個(71.28 %,67/94)神經(jīng)元對葡萄糖有反應(yīng),被鑒定為GS反應(yīng)神經(jīng)元。在67個GS反應(yīng)神經(jīng)元中(GS組),39個(58.21%,39/67)神經(jīng)元放電頻率顯著增加,鑒定為GS-E神經(jīng)元;而28個(41.79%,28/67)神經(jīng)元放電頻率下降,鑒定為GS-I神經(jīng)元。

    在39個GS-E神經(jīng)元中,nesfatin-1組中神經(jīng)元(66.67 %,26/39)放電頻率高于NS組(P<0.05),平均升高(98.10±9.14)%,見表2、圖2A;若VTA微量注射黑皮質(zhì)素3/4受體拮抗劑SHU9119可部分阻斷nesfatin-1誘導(dǎo)的興奮效應(yīng)(P<0.05),見表2、圖2A,單獨注射SHU9119,糖尿病大鼠VTA GS-E反應(yīng)神經(jīng)元的放電活動無顯著改變(P>0.05),見表2、圖2A。

    在28個GS-I神經(jīng)元中,nesfatin-1組中神經(jīng)元放電頻率低于NS組(P<0.05),平均降低(59.90±3.09)%,見表2、圖2B。Nesfatin-1對糖尿病大鼠GS-I神經(jīng)元的抑制作用可被預(yù)先VTA注射SHU9119部分阻斷(P<0.05),見表2、圖2B。提示,nesfatin-1可能通過黑皮質(zhì)素3/4受體通路參與調(diào)控糖尿病大鼠VTA GS-E或GS-I神經(jīng)元的興奮性,單獨注射SHU9119,糖尿病大鼠VTA GS-E反應(yīng)神經(jīng)元的放電活動無顯著改變(P>0.05),見表2、圖2B。

    2.3 VTA注射nesfatin-1對正常和糖尿病大鼠GS敏感神經(jīng)元放電頻率變化率比較

    為進一步比較正常及糖尿病大鼠VTA注射nesfatin-1對大鼠GS反應(yīng)神經(jīng)元放電活動的影響,本研究以放電頻率變化率對放電頻率的變化進行量化[放電頻率變化率(%)=(放電頻率nesfatin-1-放電頻率NS)/放電頻率NS×100%]。結(jié)果顯示,與正常大鼠nesfatin-1組相比,nesfatin-1對糖尿病大鼠GS-E神經(jīng)元的興奮效應(yīng)顯著增加(P<0.05),見圖1C、圖2C、表3;且nesfatin-1對糖尿病大鼠GS-I神經(jīng)元的抑制作用明顯強于正常大鼠(P<0.05),見圖1C、圖2C、表3。

    2.4 VTA注射nesfatin-1對正常和糖尿病大鼠攝食量的影響

    在正常大鼠,與NS組相比,VTA微量注射nesfatin-1,大鼠0~4 h每小時攝食量顯著降低(P<0.05),見表4。若VTA預(yù)注射SHU9119,nesfatin-1的抑攝食效應(yīng)部分消失(P<0.05),見表4,即nesfatin-1對攝食的抑制作用可能是通過黑皮質(zhì)素3/4受體信號通路而實現(xiàn)的。而單獨注射SHU9119對大鼠攝食無顯著影響(P>0.05),見表4。

    在糖尿病大鼠,與NS組相比,VTA微量注射nesfatin-1,大鼠0~4 h每小時攝食量顯著降低(P<0.05),見表4。若VTA預(yù)注射SHU9119,nesfatin-1抑攝食效應(yīng)部分消失(P<0.05),見表4,即nesfatin-1對攝食的抑制作用可能是通過黑皮質(zhì)素3/4受體信號通路而實現(xiàn)的。而單獨注射SHU9119對糖尿病大鼠攝食無顯著影響(P>0.05),見表4。

    對兩組大鼠攝食量改變量進行比較,正常大鼠攝食改變量=(攝食量正常大鼠nesfatin-1組-攝食量正常大鼠NS組)/攝食量正常大鼠NS組;糖尿病大鼠攝食改變量=(攝食量糖尿病大鼠nesfatin-1組-攝食量糖尿病大鼠NS組)/攝食量糖尿病大鼠NS組。結(jié)果顯示,與正常大鼠相比,VTA微量注射nesfatin-1,糖尿病大鼠攝食量降低更顯著(P<0.05),見表5。

    3 討論

    先前研究報道,nesfatin-1在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中也發(fā)揮重要作用,nesfatin-1除了在胃中大量表達外,還在嚙齒動物、狗、豬和人類中也檢測到nesfatin-1在胰腺內(nèi)分泌小島中與胰島素存在共定位[11-19],表明nesfatin-1與糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程存在密切關(guān)系。因此,本研究探究了大鼠VTA nesfatin-1信號通路對正常大鼠及糖尿病大鼠攝食及葡萄糖敏感(GS)神經(jīng)元放電活動的影響。

    本研究結(jié)果顯示,大鼠VTA微量注射nesfatin-1可使正常大鼠及糖尿病大鼠GS-E神經(jīng)元放電頻率顯著升高,而使GS-I神經(jīng)元放電頻率顯著降低;若VTA微量注射黑皮質(zhì)素3/4受體拮抗劑SHU9119可部分阻斷nesfatin-1誘導(dǎo)的興奮/抑制效應(yīng),單獨注射SHU9119,對正常及糖尿病大鼠VTA GS反應(yīng)神經(jīng)元的放電活動無顯著改變。提示,nesfatin-1可能是通過SHU9119受體信號通路參與對正常大鼠及糖尿病大鼠GS反應(yīng)性神經(jīng)元放電活動的調(diào)控。更重要的是,與正常大鼠相比,向糖尿病大鼠VTA微量注射nesfatin-1,對糖尿病大鼠GS反應(yīng)性神經(jīng)元放電活動的興奮/抑制效應(yīng)更加顯著。先前研究已知,糖尿病與肥胖等相關(guān)疾病關(guān)系密切[20],而本研究結(jié)果提示,正常大鼠及糖尿病大鼠體重攝食或體重差異可能與大鼠下丘腦VTA中GS反應(yīng)性神經(jīng)元激活有關(guān)。

    此外,本研究還發(fā)現(xiàn),向大鼠VTA微量注射nesfatin-1,正常及糖尿病大鼠0~4 h每小時攝食量顯著降低。若VTA預(yù)注射SHU9119,nesfatin-1的抑攝食效應(yīng)部分消失,即nesfatin-1對攝食的抑制作用可能是通過黑皮質(zhì)素3/4受體信號通路而實現(xiàn)的。而單獨注射SHU9119對正常及糖尿病大鼠攝食無顯著影響。此外,對兩組大鼠攝食量改變結(jié)果組間比較可見,與正常大鼠相比,VTA微量注射nesfatin-1,糖尿病大鼠的攝食量降低更為顯著。提示,nesfatin-1可能是通過SHU9119受體信號通路參與對正常大鼠及糖尿病大鼠攝食量的調(diào)控。

    已知nesfatin-1具有廣泛的中樞及外周調(diào)控,因此探究nesfatin-1在中樞對糖、脂及能量代謝相關(guān)障礙疾病的調(diào)控具有重要的臨床意義。本研究中觀察到nesfatin-1可通過SHU9119受體信號通路參與對糖尿病大鼠葡萄糖敏感神經(jīng)元放電及攝食的調(diào)控,這可能為未來代謝相關(guān)疾病的臨床治療提供新的思路。

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    (收稿日期:2019-12-05) (本文編輯:馬竹君)

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