漁用配合飼料中左旋肉堿含量的測定

馬瑞欣 李同慶 張志華

摘要：建立了親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HILIC-MS/MS）檢測漁用配合飼料中左旋肉堿含量的方法。樣品用超純水超聲提取提取液稀釋后經(jīng) HILIC色譜柱分離以乙腈和乙酸銨（含0.15%甲酸）溶液為流動相梯度洗脫三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式掃描外標(biāo)法定量。結(jié)果表明左旋肉堿在0.2～100 ng/mL范圍線性良好（r>0.999）;檢出限0.5 μg/kg定量限1.5 μg/kg。在20、50和100 mg/kg添加水平下回收率為75.2%～111%相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.4%～9.9%（n=6）。該方法前處理簡單、快速定性定量準(zhǔn)確適合于漁用配合飼料中左旋肉堿的準(zhǔn)確定性定量。

關(guān)鍵詞：親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;左旋肉堿;漁用配合飼料

左旋肉堿（L-carnitine）是一種促使脂肪轉(zhuǎn)化為能量的類氨基酸廣泛分布于自然界是生物體的基本成分其中肉類和乳制品中左旋肉堿的含量最高而蔬菜和水果類左旋肉堿的含量最低[1-2]。水產(chǎn)動物自身能在肝臟和組織中合成左旋肉堿但在幼體時期體內(nèi)合成的肉堿遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足水產(chǎn)動物快速生長的需要此時其飼料中必須添加一定量的左旋肉堿[3]。近年來國內(nèi)外就左旋肉堿對水產(chǎn)動物生長性能的研究表明：左旋肉堿能明顯提高魚類增長速度提高飼料蛋白質(zhì)的效率降低飼料系數(shù)提高魚肉品質(zhì)提高養(yǎng)殖成活率和繁殖率[3-5]。

文獻(xiàn)中有關(guān)左旋肉堿的檢測方法有很多[6]研究樣品多數(shù)為血漿[7-8]、乳制品[9-11]、尿液[12]、食品[1-2，13]、保健品[14-15]、減肥產(chǎn)品[16-17]等， 未見到有關(guān)飼料中左旋肉堿的檢測方法報道。筆者建立了親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HILIC-MS/MS）檢測漁用配合飼料中左旋肉堿含量的方法該方法通過液相色譜柱分離質(zhì)譜選擇離子的方法進(jìn)行定性和定量減少了干擾可快速準(zhǔn)確地檢測漁用配合飼料中左旋肉堿的含量。

1實驗部分

1.1儀器、試劑與材料

LC-20AD液相色譜（日本島津）;QTRAP 4500三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX ）;十萬分之一電子天平（賽多利斯CPA225D）;千分之一電子天平（賽多利斯CP323S）渦旋振蕩器（IKAMS3-digital）;高速離心機(jī)（安徽科大創(chuàng)新股份有限公HC-3518）;中草藥粉碎機(jī)（天津泰斯特FW135）。

左旋肉堿對照品（北京索萊寶科技有限公司純度≥98%）;實驗所用超純水由Milli-Q超純水機(jī)制備;正己烷（色譜純Honeywell）。

一次性針式濾器（Pall25 mm0.22 μm）。

1.2實驗條件

1.2.1色譜條件色譜柱GOLDHILIC（50 mm×2.1 mm×1.9 umThermoscientific公司 ）流動相5 mmol/L乙酸銨（含V/V 0.15%甲酸）（A）和乙腈（B）;梯度洗脫：0～1 min 98% B; 1 min～3 min 98% B～10% B;3 min～3.1 min 10% B～98% B;3.1～6 min 98% B。流速0.5 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣體積2 μL。

1.2.2質(zhì)譜條件電離模式：ESI+多反應(yīng)離子檢測（MRM）模式;噴霧電壓5 500 V;氣簾氣40 PSi; 碰撞氣Medium;離子源溫度550 ℃;霧化氣（GS1）55 PSi; 輔助加熱氣（GS2）55 PSi;去簇電壓60 V;碰撞池出口電壓（CXP）6.0 V。左旋肉堿母離子為m/z 162.0;定性離子對為m/z 162.0>85.0碰撞能26 eV;定量離子對為m/z 162.0>103.0碰撞能22 eV。

1.3樣品前處理

飼料經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后稱取1.000 g于50 mL離心試管中加入10 mL超純水渦旋振蕩2 min超聲提取20 min4 000 r/min離心10 min ，上清液倒入25 mL比色管中;再加入10 mL超純水重復(fù)提取一次合并上清液用超純水定容至25 mL。取3 mL上清液于10 mL離心試管中加入3 mL正己烷渦旋30 s10 000 r/min離心10 min去掉上層正己烷層取下層清液過0.22 μm濾膜后用超純水稀釋200倍供上機(jī)測試。

2結(jié)果與討論

2.1色譜柱的選擇

實驗中考察了左旋肉堿在Hypersil gold C18Accucore aQ， ZORBAX RX-C8和Kinetex F5Hypersil GOLD HILIC色譜柱上的保留和分離能力。結(jié)果表明左旋肉堿在Hypersil gold C18Accucore aQ和ZORBAX RX-C8上不保留在死時間出峰。在Kinetex F5上保留較差出峰時間0.94 min且峰形極差;在Hypersil GOLD HILIC色譜柱上能夠得到峰形尖銳的色譜峰。這是因為左旋肉堿為小分子極性化合物在弱極性C18和 C8填料的反相色譜柱上不保留。親水作用色譜（HILIC）采用極性固定相有機(jī)溶劑-水相緩沖液為流動相能有效地保留反相色譜中保留不完全或不保留的強(qiáng)極性樣品并具有良好的分離效果[18]。

2.2流動相的選擇

實驗中考察了甲醇和水、乙腈和水、乙腈和乙酸銨溶液（含V/V0.15%甲酸）作為流動相時左旋肉堿在Hypersil GOLD HILIC色譜柱的洗脫分離情況。結(jié)果表明：使用甲醇和水作為流動相洗脫時保留時間0.27 min峰形擴(kuò)散嚴(yán)重響應(yīng)很低;使用乙腈和和水作為流動相洗脫時保留時間合理但峰形拖尾嚴(yán)重;使用乙腈和乙酸銨（含V/V0.15%甲酸）溶液作為流動相洗脫時峰形尖銳響應(yīng)明顯提高對稱性增強(qiáng)。這是由于對HILIC色譜甲醇的洗脫能力強(qiáng)于乙腈且甲醇增加了分離的不確定性和較差的峰形[18]。因此在HILIC中一般采用乙腈-水作為流動相。水相中加入一定比例的乙酸銨和甲酸可以提高離子化效率改善峰形。故選用乙腈和乙酸銨（含V/V0.15%甲酸）溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫。標(biāo)準(zhǔn)溶液的HILIC-MS/MS譜圖見圖1。

2.3質(zhì)譜條件的確定

將1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液通過蠕動泵注入質(zhì)譜儀通過優(yōu)化去簇電壓、碰撞能等參數(shù)確定定性離子對為m/z 162.0>85.0和m/z 162.0>103.0m/z 162.0>103.0為定量離子對。

2.4樣品前處理條件的確定

左旋肉堿易溶于水所以本實驗中采用水作為提取劑。考察水、0.2 mol/L鹽酸溶液、0.2%乙酸溶液的提取結(jié)果發(fā)現(xiàn)測試結(jié)果無差別所以采用超純水作為提取劑直接提取。

由于左旋肉堿廣泛分布于自然界是生物體的基本成分。它在植物性飼料干物質(zhì)中的含量要低于其在動物性飼料中的含量但都在幾～幾百mg/kg數(shù)量級范圍[4]。由于質(zhì)譜的靈敏度高為防止對質(zhì)譜造成污染同時為降低基質(zhì)效應(yīng)和保證測試液落在線性范圍內(nèi)對提取液進(jìn)行了200倍稀釋后上機(jī)測試。

2.5基質(zhì)效應(yīng)

本方法為外標(biāo)法采用了稀釋和減小進(jìn)樣量的方法來減小基質(zhì)效應(yīng)。由于左旋肉堿天然存在無法獲得飼料空白樣品。本文取適量已知含量的稀釋前提取液添加一定量（體積盡可能小）的標(biāo)準(zhǔn)溶液和適量超純水使得最終得到的溶液中提取液稀釋200倍且添加濃度和原濃度保持基本相當(dāng)。通過上機(jī)測試由標(biāo)準(zhǔn)曲線給出提取液添加標(biāo)準(zhǔn)溶液前后左旋肉堿的含量。通過比較添加標(biāo)準(zhǔn)溶液前后左旋肉堿的含量變化來考察基質(zhì)效應(yīng)。實驗中利用三種飼料考察了基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果見表1。基質(zhì)效應(yīng)=1-[ρ2/（ρ0+ρ1）] ×100%?；|(zhì)抑制呈現(xiàn)鱉飼料>鯽魚飼料>錦鯉飼料的現(xiàn)象與飼料中動物源性成分的含量一致。由于基質(zhì)抑制<20%且回收率>75%見表2故本測定方法忽略基質(zhì)效應(yīng)。

2.6標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

用十萬分之一的電子天平稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品用超純水溶解并定容配制成100 μg/mL的儲備液用超純水逐級稀釋成0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列按濃度由低到高進(jìn)LC-MS/MS測試以左旋肉堿定量離子對m/z 162.0>103.0的峰面積y對質(zhì)量濃度x做標(biāo)準(zhǔn)曲線得到線性方程y=6.469 26 x 104x+35 475.1相關(guān)系數(shù)r=0.999 73。根據(jù)鱉飼料、鯽魚飼料和錦鯉飼料中左旋肉堿的信噪比得出檢出限為0.5 μg/kg定量限為1.5 μg/kg。由于不同試樣中所含的左旋肉堿含量水平有差異如果測定結(jié)果超出了本方法的線性范圍需對樣品溶液稀釋后再測定。

2.7精密度和回收率

稱取鱉飼料、鯽魚飼料、錦鯉飼料三種飼料樣品各12份6份做本底6份做標(biāo)準(zhǔn)溶液添加。按照本文建立的方法進(jìn)行前處理和測定考查方法的回收率和精密度結(jié)果見表2。

2.8實際樣品的測定

用本文建立的實驗方法對客戶的6份樣品進(jìn)行測定測定值分別為562、51、168、360、466、288 mg/kg與客戶預(yù)期值一致。實際樣品的色譜圖見圖2。3結(jié)論

本研究建立了親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定漁用配合飼料中左旋肉堿的分析方法。該方法前處理簡單精密度高、定性定量準(zhǔn)確適合于漁用配合飼料中左旋肉堿的準(zhǔn)確定性定量。

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Abstract：An analytical method was developed for the determination of L-carnitine in fish formula feed by using hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry （HILIC-MS/MS）. The samples were extracted with ultrapure water by ultrasonic. The separation of L-carnitine was carried out on a Hypersil GOLD HILIC column using ammonium acetate （0.15% formic acid） and acetonitrile as mobile phases. The quantification analysis of the target compound was performed? under multiple reaction monitoring （MRM） mode by external standard method. A good linear relationship was obtained between the peak area and concentration of L-carnitine? in the range of 0.2～100 ng/mL with the correlation coefficient more than 0.999. The limit of detection （LOD）was 0.5 μg/kg and the limit of? quantification （LOQ）? was 1.5 μg/kg.? At spiked levels of 20，50 and 100 mg/kg， the? recoveries ranged from 75.2% to 111%， and the relative standard deviation ranged from 3.4% to 9.9%.The sample preparation was simple and rapid， and the results? were accurate. The developed? method is suitable for the determination of L-carnitine in in fish formula feed.

Key words：hydrophilic liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HILIC-MS/MS）; L-carnitine; fish formula feed

（收稿日期：2020-04-26）