艾葉提取物對(duì)禽源大腸桿菌耐藥性消除作用的研究

劉超怡，徐海瑛，李小妞，張人杰，關(guān)強(qiáng)強(qiáng)，陳志堅(jiān)，袁浩麟

(1. 黃河科技學(xué)院，河南 鄭州 450063；2. 鄭州博萊特生物科技有限公司，河南 鄭州 450016；3. 鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

大腸桿菌(Escherichiacoli)廣泛分布于自然界，血清型有上萬種之多，既是腸道的主要棲息菌又是常見的腸道病原菌。禽大腸桿菌病是指由禽致病性大腸桿菌引起的不同類型疾病的總稱，主要癥狀包括禽類急性敗血癥、氣囊炎、肝周炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎、卵黃性腹膜炎等，是集約化養(yǎng)禽場(chǎng)常發(fā)的細(xì)菌性傳染病，也是引起仔禽死亡的重要原因之一，對(duì)養(yǎng)禽產(chǎn)業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失[1]?？股乇粡V泛應(yīng)用于動(dòng)物性疾病的治療，長期的不合理應(yīng)用使細(xì)菌的耐藥性問題日趨嚴(yán)重。大腸桿菌是由質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌之一，可攜帶含有多種耐藥表型的耐藥質(zhì)粒，并通過接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式在不同菌株之間傳遞，使得耐藥性在細(xì)菌間快速播散，呈現(xiàn)出多重耐藥、耐藥率高、耐藥范圍廣的特點(diǎn)[2]。其耐藥形勢(shì)越來越嚴(yán)峻，給疾病防治帶來困難。

艾葉性溫味苦、具有平喘止咳，去瘀散寒、抗毒消炎等功效。艾葉化學(xué)成分較為復(fù)雜，其主要成分為揮發(fā)油，油中含有桉油素、β-石竹烯、一萜品烯醇、芳樟醇等，此外含有黃酮類、鞣質(zhì)類、多糖類等物質(zhì)，研究表明，艾葉具有良好的抑菌殺菌作用[3]。本試驗(yàn)用艾葉的水提物和醇提物，作用于多重耐藥的雞源大腸桿菌，研究其抑菌效果，比較不同提取物對(duì)逆轉(zhuǎn)大腸桿菌的作用，為中藥防控禽源多重耐藥菌的感染與流行奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑

艾葉，由河南省張仲景大藥房股份有限公司提供；M-H(B)培養(yǎng)基(即水解酪蛋白肉湯培養(yǎng)基)、M-H(A) 培養(yǎng)基(即水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基)、LB瓊脂，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；0.9% NaCl注射液，山東齊都藥業(yè)有限公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；藥敏紙片由杭州微生物有限公司提供；60/90 mm平板，泰興市萬通醫(yī)療器械廠。

1.2 供試菌種

禽源大腸桿菌菌株來源于規(guī)模養(yǎng)禽場(chǎng)臨床分離，已完成耐藥性檢測(cè)，編號(hào)DRE1、DRE2、DRE3，質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922，購自中國醫(yī)學(xué)菌種保藏管理中心。

1.3 供試品的制備

1.3.1 菌液制備

冷凍保存的大腸桿菌質(zhì)控菌株、3株大腸桿菌分離株(DRE1、DRE2、DRE3)分別接種至平板上，37 ℃溫箱培育18 h進(jìn)行活化。無菌條件下取1環(huán)活化菌接種至M-H(B)肉湯，37 ℃震蕩培養(yǎng)24 h，校正濃度至1.5×108CFU/mL，用生理鹽水稀釋至1.5×106CFU/mL備用。

1.3.2 藥液制備

艾葉水提物的制備：稱取100 g艾葉，浸泡于800 mL水中過夜，武火煎煮，待其沸騰后文火煮30 min，8層紗布濾渣，藥渣加200 mL蒸餾水煮30 min，合并2次濾液濃縮至100 mL，抽濾，1 000 r/min離心10 min，取上清液[4]。110 ℃、20 min高壓滅菌，置于4 ℃冰箱中備用。

艾葉醇提物的制備：按文獻(xiàn)[5]的方法制備醇提物，合并濾液后置于蒸發(fā)皿內(nèi)，加熱揮發(fā)酒精至析出結(jié)晶，收集烘干，于4 ℃冰箱中備用。

1.3.3 含藥平板的制備

艾葉水提物以生理鹽水在試管中進(jìn)行2倍梯度稀釋，質(zhì)量濃度依次為500、250、125、62.5、31.25 mg/mL，分別取水提物10 mL與M-H(A) 培養(yǎng)基10 mL混勻后倒入90 mm平板，平板中藥物濃度依次為250、125、62.5、31.25、15.625 mg/mL，同時(shí)做不含藥物的M-H(A)平板為空白對(duì)照。

艾葉醇提物以二甲基亞砜(DMSO)為溶劑進(jìn)行梯度稀釋，質(zhì)量濃度依次為312.5、156.25、78.125、39.062 5、19.531 25 mg/mL，取配制好的各濃度醇提物原藥液0.8 mL分別加入含9.2 mL M-H(A)培養(yǎng)基的試管中，混勻后倒入60 mm的平板，使藥物的終濃度為25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 mg/mL，同時(shí)做不含藥物的空白對(duì)照和只含有等劑量DMSO的對(duì)照平板。

1.4 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

以瓊脂稀釋法進(jìn)行MIC的測(cè)定，在無菌操作臺(tái)中，取已制備好的4種菌液各2 μL，分別點(diǎn)種至含不同濃度水提物或醇提物的平板上，培養(yǎng)16～18 h后取出，在平板上各點(diǎn)種細(xì)菌處加0.5% TTC 10 μL，置于37 ℃溫箱培育0.5～2 h后觀察結(jié)果。點(diǎn)種處出現(xiàn)紅色代謝產(chǎn)物表示細(xì)菌生長；細(xì)菌未生長平板中最小的藥物濃度即為該藥物對(duì)該種細(xì)菌的MIC。

1.5 中藥耐藥消除試驗(yàn)

以耐藥株的亞抑菌濃度(即1/2 MIC)艾葉水提物及醇提物進(jìn)行耐藥消除試驗(yàn)。在無菌試管中用LB肉湯把藥液濃度稀釋至1/2 MIC，同時(shí)設(shè)立不加藥物的空白對(duì)照組；將新鮮培養(yǎng)的3株臨床耐藥株及標(biāo)準(zhǔn)菌株稀釋至106CFU/mL，取菌液100 μL分別接種至各試管內(nèi)，37 ℃震蕩培養(yǎng)，間隔12 h傳代接種；傳代4次后，分別取24、48、72 h各組菌液培養(yǎng)物20 μL，在無菌管中稀釋至10-6倍，取各組菌液1 mL于90 mm的平板上，與50 ℃的LB營養(yǎng)瓊脂混勻，待其冷卻凝固后，37 ℃溫箱倒置培養(yǎng)18 h，取出備用。

采用影印培養(yǎng)法，以無菌牙簽挑取單個(gè)菌落分別對(duì)應(yīng)點(diǎn)種于 LB 瓊脂平板(慶大霉素100 μg/mL) 和不加抗生素的 LB 平板。耐藥消除的細(xì)菌在慶大霉素LB培養(yǎng)基上不能生長，選取在含慶大霉素的LB平板上不生長而在無抗生素的LB平板上生長的菌落，即為消除子。對(duì)大腸桿菌耐藥性消除率進(jìn)行計(jì)算，消除率=耐藥性消除菌落數(shù)/檢測(cè)菌落總數(shù)×100%。

1.6 藥物敏感試驗(yàn)

挑取1.5試驗(yàn)中的24 h培養(yǎng)物的消除子和未處理的原始菌株分別進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，方法是采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的紙片擴(kuò)散法?？股毓?0種，分別是慶大霉素(GEN)、環(huán)丙沙星(CIP)、阿米卡星(AMK)、氨曲南(AZN)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢吡肟(FEP)、美羅培南(MEM)、頭孢西丁(FOX)、阿莫西林/克拉維酸(AMC)，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，每次試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，結(jié)果參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀，試驗(yàn)均用大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922質(zhì)控。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α= 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾葉提取物對(duì)大腸桿菌的MIC值

經(jīng)測(cè)定，艾葉水提物對(duì)大腸桿菌ATCC25922的MIC值為31.25 mg/mL，對(duì)耐藥株DRE1、DRE3的MIC值為62.50 mg/mL，耐藥株DRE2的MIC值為31.25 mg/mL。艾葉醇提物對(duì)大腸桿菌ATCC25922的MIC值為6.25 mg/mL，對(duì)耐藥株DRE1、DRE2、DRE3的MIC值均為12.50 mg/mL。

2.2 艾葉提取物對(duì)大腸桿菌耐藥性的消除

艾葉提取物對(duì)大腸桿菌的消除率及與處理時(shí)間關(guān)系見圖1?？瞻讓?duì)照組的自然消除率<3%，艾葉醇提劑組和水提劑組消除率均高于該數(shù)值，3株耐藥菌株消除率結(jié)果有較大差異，消除率最高可達(dá)28.50%，最低為4.65%；且消除率隨著菌株處理時(shí)間增長而增高，但72 h培養(yǎng)物的消除率增幅相對(duì)平緩。

A.DRE1；B.DRE2；C.DRE3

圖1 艾葉提取物對(duì)3株耐藥菌的消除率與處理時(shí)間的關(guān)系

2.3 艾葉提取物作用后消除子藥物敏感性試驗(yàn)

原始菌株和艾葉提取物作用于耐藥菌DRE1、DRE2、DRE3后形成的消除子對(duì)10種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。

艾葉水提劑作用于DRE1后，消除子對(duì)AZN、FEP、MEM、FOX的抑菌圈直徑平均值較原始菌株有不同程度的增大，但藥物敏感程度沒有改變；消除子對(duì)GEN、CIP、AMK、CAZ、CTX、AMC的藥敏試驗(yàn)結(jié)果無變化。艾葉醇提劑作用DRE1后，消除子對(duì)MEM的抑菌圈結(jié)果增加，藥敏程度由耐藥恢復(fù)至敏感；消除子對(duì)GEN、AMK、AZN、FEP、FOX 的抑菌圈結(jié)果均增加，但藥物敏感程度無變化；消除子對(duì)CIP、CAZ、CTX、AMC的抑菌圈結(jié)果無變化。

艾葉水提劑和醇提劑作用于DRE2后，消除子對(duì)10種抗菌藥物的抑菌圈結(jié)果較原始菌株均有增加，其中對(duì)6種抗生素的藥敏程度發(fā)生變化。艾葉水提劑作用DRE2后，消除子對(duì)CAZ、CTX、AMC的藥敏程度由耐藥恢復(fù)到中介，對(duì)GEN、AZN和FEP由耐藥恢復(fù)到敏感。艾葉醇提劑作用DRE2后，消除子對(duì)AMC的藥敏程度由耐藥恢復(fù)到中介，對(duì)GEN、AZN、CAZ、CTX、FEP 5種抗菌藥物恢復(fù)了敏感性，其中以CAZ、CTX和FEP的抑菌圈增幅最為明顯。

艾葉水提劑作用于耐藥大腸桿菌DRE3，消除子對(duì)CIP和AMK的抑菌圈結(jié)果較原始菌株無變化；對(duì)GEN、AZN、CAZ、CTX、FEP、ROX的抑菌圈結(jié)果均有不同程度的增大，但藥物敏感程度沒有改變；消除子對(duì)MEM、AMC的抑菌圈結(jié)果均有增加，且恢復(fù)了敏感性。艾葉醇提劑作用于耐藥大腸桿菌DRE3后，消除子對(duì)GEN、CIP、AMK的抑菌圈結(jié)果較原始菌株無變化；消除子對(duì)其與抗菌藥物的抑菌圈結(jié)果均有增加，對(duì)MEM、AMC的增幅最大，消除子對(duì)兩者的藥敏程度恢復(fù)至敏感。

表1 原始菌株和艾葉提取物作用后的消除子對(duì)10種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 mm

注：敏感(S)；耐藥(R)；中度敏感(I)。

3 討論

細(xì)菌耐藥主要有獲得性耐藥和固有性耐藥2個(gè)遺傳途徑，其中以獲得性耐藥為主，且危害最大[6]。獲得性耐藥主要通過遺傳因子的轉(zhuǎn)移和傳播，遺傳因子主要包括耐藥質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子和噬菌體，它們可以通過融合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等方式在不同致病性大腸埃希菌的遺傳物質(zhì)之間轉(zhuǎn)移或集聚重排，引起多重耐藥菌發(fā)生率大幅上升[7]。因此找到合適的消除劑，用于消除細(xì)菌耐藥遺傳因子，使細(xì)菌恢復(fù)對(duì)抗菌藥物的敏感性，是治療多重耐藥菌的新方法。

基于清熱類中藥的消炎殺菌作用，將其應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)且部分替代抗生素，以降低細(xì)菌的耐藥程度和獸藥在動(dòng)物體內(nèi)的殘留，取得了很好的效果。在此過程中發(fā)現(xiàn)清熱類中藥對(duì)細(xì)菌耐藥性有一定的消除作用[8]。韋嬪等[9]通過黃連、金銀花、艾葉、五倍子4種中藥對(duì)豬源大腸埃希菌慶大霉素耐藥性的消除試驗(yàn)，亞抑菌濃度下黃連、金銀花、艾葉、五倍子作用24 h后對(duì)致病性大腸埃希菌慶大霉素耐藥性的消除率分別7.3%、3.5%、10.9%、13.7%。張文波等[10]用艾葉水煮液可使雞源致病性大腸桿菌耐藥質(zhì)粒消除率達(dá)60%，消除耐藥質(zhì)粒的細(xì)菌恢復(fù)了對(duì)環(huán)丙沙星、青霉素、氧氟沙星、氟哌酸、林可霉素和復(fù)方新諾明的敏感性。

在本研究中，亞抑菌濃度下艾葉水提劑作用72 h對(duì)3株大腸桿菌耐藥菌株的消除率分別是4.65%、24.34%、7.58%；艾葉醇提劑作用72 h對(duì)3株大腸桿菌耐藥菌株的消除率分別是5.17%、28.50%、11.83%，艾葉醇提劑的消除效果優(yōu)于艾葉水提劑，這可能與不同提取方法提取物中的有效成分不同有關(guān)。艾葉提取物中揮發(fā)油是活性成分之一，主要為萜類及其含氧衍生物及少量的醛、醇、酮及芳香類化合物，目前已發(fā)現(xiàn)的成分接近100種，與水不相混溶，可隨水蒸氣蒸餾揮發(fā)[11]。艾葉提取物中的黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抑菌等藥效，但大部分難溶或不溶于水，而易溶于甲醇、乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑[12]。由于提取物溶解性差異及活性成分的損耗程度不同，2種方法的提取產(chǎn)物在消除耐藥性方面存在差異。

根據(jù)已報(bào)道過的研究中可以發(fā)現(xiàn)中藥的消除率并不穩(wěn)定，不同研究者報(bào)道的結(jié)果往往有很大的差異，可能與所用藥材的采集地、制備方法或者菌株分離地、菌種等不同有關(guān)[13]。這其中尤其與菌株本身有較大關(guān)系。本研究的3株耐藥菌株在前期做了超廣譜β內(nèi)酰胺酶群(ESBLs酶)、AmpC β內(nèi)酰胺酶(AmpC酶)、碳青霉烯酶、美羅培南(MEM)外排泵等4種耐藥酶的檢測(cè)(尚未發(fā)表)：DRE1產(chǎn)生 ESBLs酶、金屬碳青霉烯酶、MEM 外排泵，艾葉提取物作用后，DRE1消除率最低，消除子抑菌圈增幅較小，沒有對(duì)任何藥物恢復(fù)敏感性；DRE2的檢測(cè)結(jié)果是4種耐藥酶均為陰性，艾葉提取物作用后，其消除率最高，其消除子在艾葉醇提物作用下，藥物敏感性有大幅增高，對(duì)10種抗菌藥物中的5種恢復(fù)了敏感性；DRE3的檢測(cè)結(jié)果是ESBLs酶陽性，消除子在艾葉醇提物作用下對(duì)美羅培南、阿莫西林/棒酸恢復(fù)了敏感性。

一定程度消除耐藥性的菌株，恢復(fù)了對(duì)部分抗生素的敏感性，對(duì)防控細(xì)菌感染性疾病及阻斷耐藥菌群的傳播具有重要意義。但是菌體耐藥機(jī)制復(fù)雜，藥物作用與耐藥譜型發(fā)生了哪些改變有待深入研究；耐藥酶與菌株毒力、致病力的關(guān)系有待進(jìn)一步研究；導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性消除的藥物具體成分有待純化研究，以此為獸醫(yī)臨床消除細(xì)菌耐藥性、防控感染性疾病提供理論支撐。