伯氏疏螺旋體套式PCR檢測(cè)方法建立及應(yīng)用

王婭，劉麗婭，謝彩云，馬曉菁，葉鋒，谷文喜，馬俊杰，鐘旗，易新萍*

(1. 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆 烏魯木齊 830000；2. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000)

萊姆病是一種由伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)感染引起，經(jīng)硬蜱叮咬吸血時(shí)進(jìn)行傳播的自然疫源性人畜共患病[1]?？汕趾θ梭w多系統(tǒng)及臟器，臨床表現(xiàn)多樣化。該病分布廣、傳播快、致殘率高，近年來(lái)疫源地及發(fā)病率均呈現(xiàn)出擴(kuò)大和上升趨勢(shì)，已成為嚴(yán)重的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題[2-3]。

收稿日期：2019-08-29；修回日期：2020-04-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFC1200500)

第一作者：王婭(1997-)，女，碩士研究生；劉麗婭(1984-)，女，碩士，副研究員。#共同第一作者

*通信作者：易新萍，研究員，研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病，E-mail：821489803@qq.com。

新疆的氣候條件、植被資源為蜱蟲(chóng)的孕育及蜱傳疫病的傳播提供了良好的生態(tài)條件，是我國(guó)萊姆病的重要疫區(qū)[4]。據(jù)報(bào)道至少能在 35 種蜱和少數(shù)吸血蚊、蠅、虻、螨、蚤類(lèi)體內(nèi)分離到萊姆病螺旋體，但具有保持和傳播萊姆病螺旋體能力的只有硬蜱類(lèi)[5]。本研究選擇伯氏疏螺旋體5S-23S rRNA基因間隔區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，建立萊姆病套式PCR檢測(cè)方法，對(duì)2018—2019年采集的硬蜱樣本進(jìn)行檢測(cè)，以此來(lái)了解新疆北疆地區(qū)硬蜱攜帶伯氏疏螺旋體的流行現(xiàn)狀，以期為疫病的防控提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

伯氏疏螺旋體B31標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC35210)、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC1531)、沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC3762)、鉤端螺線體基因組DNA(DSM21537)均由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

1.1.2 試劑

PCR Mix，北京莊盟生物技術(shù)有限公司；1×PBS稀釋液、TE稀釋液、DNA Marker，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；BSK培養(yǎng)基，美國(guó)Sigma公司；LB培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照樣品DNA的提取

將伯氏疏螺旋體B31標(biāo)準(zhǔn)株、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)后，按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明分別提取DNA。

1.2.2 套氏PCR檢測(cè)方法

1.2.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

在伯氏疏螺旋體5S-23S rRNA基因(GenBank登錄號(hào)JX564636.1)間隔區(qū)設(shè)計(jì)套式PCR引物，并委托昆泰銳生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 5S-23S rRNA間隔區(qū)套式PCR引物序列

名稱引物序列(5'→3')退火溫度/℃片段大小/bp23SN1ACCATAGACTCTTACTTTGAC23SC1TAAGCTGACTAATACTAATTACCC5538023SN2ACCATAGACTCTTATTACTTTGACCA5SCBGAGAGTAGGTTATTGCCAGGG62225

1.2.2.2 反應(yīng)體系

進(jìn)行2輪PCR反應(yīng)，每輪體系均為25 μL：包括2×TaqMasterMix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，雙蒸水8.5 μL，第1輪模板為2 μL，第2輪模板為第1輪PCR產(chǎn)物2 μL。

1.2.2.3 反應(yīng)條件

第1輪PCR使用引物為23SN1和23SC1，擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；再72 ℃延伸10 min，16 ℃終止反應(yīng)。第2輪PCR使用引物為23SN2和5SCB，擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；再72 ℃延伸10 min，16 ℃終止反應(yīng)。

1.2.2.4 產(chǎn)物檢測(cè)

用TAE電泳稀釋液配置1%瓊脂凝膠，取5 μL套式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別加入樣品孔，以100 V恒壓電泳，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，陽(yáng)性可見(jiàn)約為225 bp左右的條帶。

1.2.2.5 敏感性試驗(yàn)

將提取的伯氏疏螺旋體B31標(biāo)準(zhǔn)株DNA應(yīng)用分光光度計(jì)進(jìn)行含量測(cè)定，稀釋至1 ng/μL后進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)瑵舛确謩e為10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL，取2 μL為模板進(jìn)行套式PCR 擴(kuò)增，以檢測(cè)其敏感性。

1.2.2.6 特異性試驗(yàn)

以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鉤端螺旋體、伯氏疏螺旋體B31標(biāo)準(zhǔn)株DNA為模板，進(jìn)行套式 PCR 擴(kuò)增以檢測(cè)其特異性。

1.2.3 檢測(cè)蜱蟲(chóng)樣本DNA提取

在新疆伊犁地區(qū)、阿拉山口、呼圖壁縣、青河縣、福?？h和五家渠縣采集游離蜱和吸血蜱共534只。將蜱浸泡于75%酒精中15 min，再用1×PBS稀釋液或生理鹽水清洗3次，放置于干凈的濾紙上吸水干燥。干燥后用鑷子將蜱夾放在無(wú)菌載玻片上縱切，加適量TE進(jìn)行研磨，煮沸10 min，8 000 r/min離心5 min后取上清，保存于-20 ℃用于檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 套氏PCR敏感性及特異性

2.1.1 敏感性

應(yīng)用建立的套式PCR檢測(cè)方法，對(duì)稀釋后的伯氏疏螺旋體B31標(biāo)準(zhǔn)株DNA進(jìn)行擴(kuò)增，電泳后檢測(cè)，其檢測(cè)限約為1.0×10-3ng/μL，結(jié)果如圖1所示。

2.1.2 特異性

應(yīng)用建立的套式PCR檢測(cè)方法，以伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)菌株B31和金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鉤端螺旋體的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，電泳后顯示，除伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)菌株B31擴(kuò)增出225 bp大小的目的條帶，其他未見(jiàn)條帶，結(jié)果如圖2所示。

2.2 螺旋體的檢測(cè)

應(yīng)用建立的套式PCR檢測(cè)方法，對(duì)在新疆北疆6個(gè)地區(qū)采集的534只硬蜱進(jìn)行檢測(cè)，共檢出81份陽(yáng)性，總陽(yáng)性率為15.17%。其中青河縣檢測(cè)蜱110只，陽(yáng)性26只，陽(yáng)性率最高為23.64%；福海縣檢測(cè)蜱18只，全為陰性；其余地區(qū)陽(yáng)性率由高到低依次為呼圖壁縣22.73%、阿拉山口市18.06%、伊犁地區(qū)17.75%、五家渠縣2.5%，具體結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。

M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對(duì)照；2～7.伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)菌株B31陽(yáng)性質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照(1 ng/μL)、100、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL

圖1 套式PCR敏感性檢測(cè)

M. DL2000 DNA Marker；1.伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)菌株B31；2.金黃色葡萄球菌；3.大腸桿菌；4.沙門(mén)菌；5.鉤端螺旋體

圖2 套式PCR特異性檢測(cè)

表2 蜱樣本巢氏PCR 檢測(cè)結(jié)果

采樣地檢測(cè)數(shù)陽(yáng)性數(shù)陽(yáng)性率/%伊犁地區(qū)4縣市1602213.75阿拉山口市1442618.06呼圖壁縣22522.73青河縣1102623.64福?？h1800.00五家渠縣8022.50總 計(jì)5348115.17

M. DL2000 DNA Marker；1.伯氏疏螺旋體標(biāo)準(zhǔn)菌株B31；2.陰性對(duì)照；3～17.檢測(cè)蜱樣本

圖3 部分蜱樣本套式PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

萊姆病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”是從樣本中分離出伯氏疏螺旋體，但其體外分離培養(yǎng)難度大，耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、易污染，且分離率較低。血清學(xué)檢測(cè)方法敏感性和靈敏性又不高，因而分子生物學(xué)檢測(cè)方法越來(lái)越多的被應(yīng)用于萊姆病的檢測(cè)。套式PCR(Nested-PCR)是一種普通PCR的優(yōu)化模式，原理是設(shè)計(jì)2對(duì)引物，第2對(duì)引物在第1對(duì)引物的內(nèi)部，將第1輪PCR的產(chǎn)物作為第2輪PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增[6]。其敏感度和特異性均高于普通PCR，被認(rèn)為是臨床檢測(cè)螺旋體菌屬最敏感的方法之一[7]。本研究選擇伯氏疏螺旋體5S-23S rRNA基因間隔區(qū)成功設(shè)計(jì)嵌套式引物，以此為基礎(chǔ)建立了套式PCR檢測(cè)體系，評(píng)估了該方法的敏感性和特異性，并成功應(yīng)用于檢測(cè)臨床樣本。

自1987年以來(lái)，新疆已先后被證實(shí)存在多個(gè)萊姆病自然疫源地[8-10]。萊姆病通過(guò)蜱作為媒介進(jìn)行傳播，要深入地探討萊姆病的發(fā)生與傳播的機(jī)制，首先需要了解各地蜱伯氏疏螺旋體的帶菌情況。本研究對(duì)新疆北疆6個(gè)地區(qū)采集的硬蜱攜帶伯氏疏螺旋體流行現(xiàn)狀進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示6個(gè)地區(qū)硬蜱伯氏疏螺旋體平均攜帶率為15.17%。其中青河縣最高，達(dá)23.64%，福?？h未檢測(cè)到。不同地區(qū)間存在差別，與采集的樣本數(shù)量有關(guān)，也可能與采集區(qū)域是否是疫源地或萊姆病高發(fā)區(qū)有關(guān)[11]。

牛、羊、犬、兔、鹿和鼠等動(dòng)物均可感染萊姆病，又通過(guò)蜱叮咬后傳播給人，該病對(duì)人類(lèi)健康和畜牧業(yè)發(fā)展已構(gòu)成極大危害。鑒于此次調(diào)查得知新疆北疆地區(qū)蜱萊姆病伯氏疏螺旋體攜帶率較高，應(yīng)加強(qiáng)萊姆病的防控工作，長(zhǎng)期開(kāi)展蜱蟲(chóng)分布及蜱傳疫病檢測(cè)監(jiān)測(cè)，了解其傳播和流行風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)預(yù)警預(yù)報(bào)。同時(shí)，應(yīng)做好滅蜱工作，對(duì)長(zhǎng)期在野外、戶外及蜱棲息地、萊姆病疫源地停留的人員，要加強(qiáng)萊姆病防控知識(shí)的科普宣傳，提高自我防護(hù)意識(shí)。