銀杏-杜仲葉復(fù)合發(fā)酵工藝優(yōu)化及發(fā)酵物對(duì)肉雞腸道功能的影響

曹銀娣，張旭暉，孫智遠(yuǎn)，汪貴斌，曹福亮*

(1. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)科技處，山東 青島 266109；3. 江蘇農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 句容 212400)

近幾年來(lái)，大規(guī)模的銀杏和杜仲經(jīng)濟(jì)林栽培項(xiàng)目已經(jīng)啟動(dòng)，中國(guó)的銀杏葉產(chǎn)量大約每年有4萬(wàn)噸，杜仲葉的產(chǎn)量也在3萬(wàn)噸以上。如何將這些林產(chǎn)資源有效利用，成為實(shí)際生產(chǎn)中需要解決的問(wèn)題。我國(guó)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部公告第194號(hào)：自2020年1月1日起，畜禽類(lèi)飼料全面禁抗，人們將視角轉(zhuǎn)向可飼用天然產(chǎn)物飼料添加劑的開(kāi)發(fā)。銀杏葉、杜仲葉作為林產(chǎn)資源天然產(chǎn)物，它們除具有一般樹(shù)葉的營(yíng)養(yǎng)外，還富含黃酮類(lèi)化合物、綠原酸、萜內(nèi)酯、聚戊烯醇等生物活性物質(zhì)。微生物在植物資源發(fā)酵過(guò)程中起到分解轉(zhuǎn)化作用，在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及生物活性方面，經(jīng)過(guò)發(fā)酵的銀杏葉飼料添加劑均有大幅度的提高[1]。幼齡仔雞的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，機(jī)能不健全，對(duì)環(huán)境應(yīng)激因素易感，益生素正逐漸成為增強(qiáng)禽類(lèi)生產(chǎn)性能、改善腸道健康和功能的重要途徑[2]。預(yù)期通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控措施進(jìn)行腸道健康的管理越來(lái)越受到專(zhuān)家學(xué)者的認(rèn)可。多項(xiàng)研究表明，使用銀杏葉、杜仲葉及其提取物作為禽畜及水產(chǎn)動(dòng)物的飼料添加劑，能減少預(yù)防用藥，增加食用安全性[3]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于復(fù)合發(fā)酵銀杏-杜仲葉作為飼料添加劑對(duì)肉雞生長(zhǎng)發(fā)育的研究報(bào)道尚比較缺乏[4]。

本研究采用產(chǎn)阮假絲酵母和黑曲霉菌復(fù)合發(fā)酵按一定比例復(fù)配的杜仲葉和銀杏葉，同時(shí)提升總黃酮和綠原酸等活性成分的含量，制備出一種生物飼料添加劑，選用AA肉雞作為研究對(duì)象，探討外源添加銀杏-杜仲葉混合發(fā)酵物(簡(jiǎn)稱(chēng)“FGE”)對(duì)肉雞的生長(zhǎng)發(fā)育、腸道結(jié)構(gòu)與消化功能的作用，以期為銀杏葉和杜仲葉作為飼料添加劑在家禽飼料中的使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料

銀杏葉：南京林業(yè)大學(xué)銀杏園，10月樹(shù)上采摘，自然晾曬葉；杜仲葉：河南理工大學(xué)杜仲園，12月落葉收集，自然晾曬葉。以上材料均60 ℃烘干后、粉碎機(jī)磨成粉，40目過(guò)篩，裝入自封袋密封保存。

菌種：產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)和黑曲霉(Aspergikrsniger)均來(lái)自南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院微生物菌種保藏室。于土豆葡萄糖斜面培養(yǎng)基 (PDA)上保存。

固體培養(yǎng)基：以銀杏-杜仲葉為主要發(fā)酵原料80%；適量添加麩皮，添加量為20%，含2.0%葡萄糖、3.0% (NH4)2SO4、2.0% KH2PO4、0.5% MgSO4·7H2O。水分含量60%。

所有培養(yǎng)基都需在121 ℃條件下滅菌30 min。在優(yōu)化試驗(yàn)過(guò)程中，培養(yǎng)基的組成會(huì)有所變化。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

360只1日齡健康A(chǔ)A肉仔雞(購(gòu)自山東煙臺(tái)蘇佳麗禽業(yè)有限公司)，體重平均為(49.24±3.89)g，差異不顯著(P>0.05)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)：采用250 mL錐形瓶作發(fā)酵容器，固體重量50 g，厚度1～2 cm，加60%的水，滅菌后接種產(chǎn)朊假絲酵母量1.0%(按培養(yǎng)基的干重比例配)。

銀杏-杜仲葉發(fā)酵選擇常規(guī)條件：銀杏葉與杜仲葉配比為2∶1，黑曲霉菌為2.0%(按培養(yǎng)基的干重比例配)，發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時(shí)間為96 h。選取銀杏葉與杜仲葉配比1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，黑曲霉菌0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，發(fā)酵溫度為23、25、28、30、32 ℃，發(fā)酵時(shí)間為48、72、84、96、120 h作為工藝參數(shù)探討值，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn)。每個(gè)處理做3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)做3次平行試驗(yàn)，取平均值。

1.2.2 動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在確定最佳的銀杏葉與杜仲葉配比和最佳發(fā)酵工藝條件后，選用1日齡(1 d)健康、體重相近的AA肉仔雞360只(公雞苗，P>0.05)，完全隨機(jī)設(shè)計(jì)分為6個(gè)處理組，每個(gè)處理組含6個(gè)重復(fù)(每個(gè)重復(fù)10只雞)。分為：基礎(chǔ)日糧對(duì)照組；未發(fā)酵銀杏-杜仲葉(NFGE組)，分別在基礎(chǔ)日糧中添加NFGE前期0.3%，后期0.6%；4個(gè)FGE組(FGE1、FGE2、FGE3、FGE4)，即在基礎(chǔ)日糧中添加FGE前期分別為0.2%、0.3%、0.4%和0.5%，后期分別為0.4%、0.6%、0.8%和1.0%。

試驗(yàn)期42 d，分別在試驗(yàn)的第1、21、42天的早晨07:00空腹稱(chēng)重并結(jié)料，逐只將試雞進(jìn)行稱(chēng)重。稱(chēng)重前1 d的晚上7:00斷料，但持續(xù)喂水，計(jì)算以重復(fù)為單位進(jìn)行，記錄不同生長(zhǎng)階段雞的采食量、體增重及料重比(F/G)。試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧采用玉米-豆粕型，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。日糧分前期(0～21 d)和后期(21～42 d)2個(gè)階段，在不同的日糧處理組中，采用重量替代法配制，使用麩皮來(lái)補(bǔ)齊試驗(yàn)添加物的量。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

含量0～21 d22～42 d豆粕 30.8224.03玉米 60.7464.08玉米蛋白粉 2.04.0豆油 2.032.83石粉 1.101.27日糧組成/磷酸氫鈣1.391.27%麩皮 0.51.01%預(yù)混料a 1.51.0食鹽 0.200.25L-賴(lài)氨酸0.070.16蛋氨酸 0.150.10粗蛋白/%21.219.3代謝能/(MJ·kg-1)12.2712.77日糧營(yíng)養(yǎng)成分*L-賴(lài)氨酸/%1.080.95鈣/%1.000.91蛋+胱/%0.820.74蛋氨酸/%0.500.44有效磷/%0.430.38

注：*為計(jì)算值。a：每kg日糧提供：鐵，60 mg；銅，7.5 mg；鋅，65 mg；錳，110 mg；碘，1.1 mg；硒，0.4 mg；維生素A，90 mg；維生素B1，2.2 mg；維生素B2，10 mg；維生素B3，50 mg；維生素B5，4 mg；維生素B6，10 mg；維生素B11，1 mg；維生素B12，1.013 mg；維生素D3，20 mg；維生素K，1.3 mg；膽堿，400 mg；維生素H，0.04 mg。

1.3 采樣與測(cè)定方法

1.3.1 提取方法

稱(chēng)取干燥發(fā)酵產(chǎn)物5.0 g，在超聲波功率500 W條件下，固液比1∶15、乙醇濃度70%、提取溫度為50 ℃條件下，提取20 min，累計(jì)提取2次，合并提取液。

1.3.2 樣品的采集與制備

每個(gè)處理于每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)抓取1只雞，頸靜脈采血制備血清，置-20 ℃冰箱待測(cè)，頸部放血致死。取新鮮的十二指腸、空腸、回腸組織，于每段組織截取1 cm左右的腸段，輕輕用生理鹽水沖洗掉腸道食糜，放入4%甲醛溶液中固定，備用于形態(tài)檢測(cè)分析分離胰腺、十二指腸、空腸和回腸，均要輕輕擠出腸道各段的食糜，再分別將各段腸管剪開(kāi)，先輕輕用載玻片刮去各腸段表層的殘留食糜，再用適度刮取黏膜，將黏膜分別于-70 ℃的冰箱保存，備用。

1.3.3 活性成分測(cè)定

總黃酮濃度測(cè)定：以蘆丁為對(duì)照品制備溶液，505 nm波長(zhǎng)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程：A=11.155 6C+0.006 1，R2=0.999 7。適用濃度0～48.0 mg/L。

綠原酸濃度的測(cè)定：以綠原酸為對(duì)照品制備溶液，328 nm波長(zhǎng)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程：C=19.049 0A-0.074 4，R2=0.998 4。適用濃度0～38.4 mg/L。

總黃酮、綠原酸含量計(jì)算方法：分別在505 nm、328 nm下測(cè)定其吸光值，代入相應(yīng)回歸方程，計(jì)算總黃酮、綠原酸濃度C1、C2，計(jì)算提取率Y1、Y2。

計(jì)算公式為：Y=100%C×N×V/m。式中:Y：發(fā)酵物總黃酮或綠原酸提取率；C：樣液中總黃酮或綠原酸濃度，mg/L；N：稀釋倍數(shù)；V：提取液體積，L；m：原料質(zhì)量，mg。

1.3.4 蛋白質(zhì)和氨基酸含量的測(cè)定

采用凱氏定氮法測(cè)定復(fù)合發(fā)酵物中粗蛋白含量(GB/T 14771-93)。發(fā)酵物樣品用6 mol/L的HCl在110 ℃水解22 h后測(cè)總氨基酸含量，用HP-1050型液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定[5]。

1.3.5 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)與酶活性的測(cè)定

腸道形態(tài)采用對(duì)腸道切片進(jìn)行HE染色，采集圖像，分析獲得。測(cè)定酶活性試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，按說(shuō)明操作。

1個(gè)淀粉酶活力單位為：37 ℃條件下，每克組織或食糜或每毫克蛋白與底物作用，30 min，每水解10 mg淀粉，定義為1個(gè)淀粉酶活力單位。

1個(gè)脂肪酶活力單位為：每克組織及食糜(或每毫克蛋白)37 ℃下，于反應(yīng)體系中和底物反應(yīng)1 min，每消耗l μmol底物，定義為1個(gè)脂肪酶活力單位。

1個(gè)總蛋白酶單位為：在40 ℃和pH=6.0條件下，每克組織及食糜或每毫克蛋白每分鐘水解酪素產(chǎn)生1 μL酪氨酸，定義為1個(gè)總蛋白酶活力單位。

1.3.6 小腸黏膜堿性磷酸酶(AKP)活性的測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定十二指腸、空腸和回腸黏膜中AKP活性。組織勻漿上清液中蛋白質(zhì)含量采用文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.7 血清D-木糖濃度和血清尿素氮的測(cè)定

均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定血清D-木糖濃度和血清尿素氮，按說(shuō)明操作。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析 (One-way ANOVA)；以IBM SPSS Statistics 19.0軟件采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異顯著性水平設(shè)為P<0.05；采用Duncan氏多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，差異顯著性水平設(shè)為P<0.05(或P<0.01)。數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏-杜仲葉發(fā)酵工藝參數(shù)研究

2.1.1 銀杏與杜仲葉配比對(duì)總黃酮和綠原酸含量的影響

如圖1，隨著銀杏葉質(zhì)量比重的增加，總黃酮含量有明顯增加(P<0.05)，綠原酸含量有所降低，在比例2∶1開(kāi)始，綠原酸含量降低明顯。隨著杜仲葉比例的增加，綠原酸含量增加明顯(P<0.05)，總黃酮含量呈降低趨勢(shì)，總黃酮和綠原酸總含量出現(xiàn)先增加后降低的情況。綜合考慮，正交試驗(yàn)銀杏葉與杜仲葉配比為1∶1、2∶1、3∶1。

同指標(biāo)相比，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

圖1 銀杏葉與杜仲葉配比對(duì)總黃酮和綠原酸含量的影響

2.1.2 黑曲霉菌接種量對(duì)總黃酮和綠原酸含量的影響

如圖2，隨著黑曲霉菌接種量的增加，總黃酮和綠原酸的含量均出現(xiàn)明顯提升趨勢(shì)(P<0.05)，當(dāng)接種量達(dá)到2.0%時(shí)，總黃酮量增勢(shì)減緩。綜合考慮，正交試驗(yàn)黑曲霉菌接種量設(shè)計(jì)為1.5%、2.0%、2.5%。

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)總黃酮和綠原酸含量的影響

如圖3，隨著發(fā)酵溫度的升高，總黃酮和綠原酸的含量呈先升后降，根據(jù)變化趨勢(shì)，正交試驗(yàn)發(fā)酵溫度設(shè)計(jì)為25、28、30 ℃。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總黃酮和綠原酸含量的影響

如圖4，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮和綠原酸的含量均有明顯提升，總黃酮含量出現(xiàn)明顯下降，綜合考慮，正交試驗(yàn)發(fā)酵時(shí)間設(shè)計(jì)為72、84、96 h。

圖2 黑曲霉菌接種量對(duì)總黃酮和綠原酸含量的影響

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)總黃酮和綠原酸含量的影響

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)總黃酮和綠原酸含量的影響

2.1.5 銀杏-杜仲葉復(fù)合發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定銀杏葉與杜仲葉的質(zhì)量比例(A)、黑曲霉菌接種量(B)、發(fā)酵溫度(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)為試驗(yàn)因素，如表2來(lái)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素水平，優(yōu)化銀杏-杜仲葉復(fù)合植物資源發(fā)酵工藝結(jié)果如表3。

表2 銀杏-杜仲葉復(fù)合發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)因素水平

水平AB/%C/℃D/h11∶11.5%257222∶12.0%288433∶12.5%3096

表3 銀杏-杜仲葉復(fù)合發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)號(hào)ABCD總黃酮量/%綠原酸含量/%111111.57±0.04c0.43±0.03ab212221.77±0.03bc0.50±0.02a313331.64±0.03c0.40±0.02ab421232.08±0.02ab0.42±0.03ab522311.83±0.02b0.36±0.02b623121.99±0.05b0.40±0.02b731331.81±0.03b0.27±0.01c832122.14±0.05a0.32±0.01b933212.02±0.04ab0.30±0.02c

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。

表3數(shù)據(jù)所示，4個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率和綠原酸含量影響均有顯著性差異，對(duì)總黃酮含量影響力依次為A>C>D>B，總黃酮含量最高的工藝組合為A3B2C1D2；對(duì)綠原酸提取率影響力依次為A>C>D>B，綠原酸含量最高的工藝組合為A1B2C2D2。分析單因素試驗(yàn)趨勢(shì)和正交試驗(yàn)結(jié)果，取A2B2C2D3和A2B2C3D3進(jìn)行最優(yōu)化工藝參數(shù)比較確定試驗(yàn)，結(jié)果顯示總黃酮和綠原酸的含量分別為2.13%、0.50%和2.12%、0.43%。最終選定A2B2C2D3為最佳工藝條件，此條件下固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品總黃酮含量為2.13%，綠原酸的含量為0.50%。

2.1.6 銀杏-杜仲葉發(fā)酵產(chǎn)物的主要營(yíng)養(yǎng)成分及活性成分分析

對(duì)選定條件下銀杏-杜仲葉發(fā)酵產(chǎn)品中主要營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性成分進(jìn)行分析，經(jīng)t檢驗(yàn)分析如表4，發(fā)酵后相對(duì)應(yīng)發(fā)酵前各項(xiàng)主要營(yíng)養(yǎng)成分和活性成分均有顯著提高(P<0.05)。粗蛋白的含量從發(fā)酵前的12.41%增加到25.23%，提高了103.30%；總氨基酸、必需氨基酸含量分別從發(fā)酵前的9.76%和3.74%增加到17.49%和6.34%，分別提高了79.20%和69.52%；總黃酮含量發(fā)酵前的1.67%增加到2.13%，提高了27.55%；綠原酸含量由發(fā)酵前的0.42%增加到0.50%，提高了19.48%。

表4 銀杏-杜仲葉發(fā)酵產(chǎn)物主要營(yíng)養(yǎng)成分及活性成分分析 %

注：肩標(biāo)*表示與發(fā)酵前對(duì)應(yīng)值差異顯著(P<0.05)。

2.2 動(dòng)物試驗(yàn)

2.2.1 FGE對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

由表5可知，在1～21 d的生長(zhǎng)發(fā)育階段中，各組間的日增重和日采食量均無(wú)顯著差異(P>0.05)，22～42 d和1～42 d的日增重?zé)o顯著差異(P>0.05)；FGE2和FGE3組22～42 d的日采食量與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)；F/G在1～21 d各FGE組間無(wú)顯著差異(P>0.05)，但與對(duì)照組和NFGE組相比，F(xiàn)GE2和FGE3組的F/G在22～42 d和1～42 d間有顯著降低(P<0.05)。

表5 日糧添加FGE對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

項(xiàng)目日齡/d日糧處理 對(duì)照NFGEFGE1FGE2FGE3FGE4日增重/g1～2126.67±1.2526.83±1.0626.94±1.4327.69±1.1927.90±1.5226.93±1.0622～4273.58±2.2574.16±3.1574.23±4.2174.38±3.1074.91±3.1974.92±3.171～4250.13±4.4550.50±2.5250.59±3.3451.04±2.3051.41±3.3750.93±2.29日采食量/g)1～2141.98±1.9442.10±1.9341.94±1.9042.20±1.9142.34±1.8741.94±1.9022～42135.08±6.26a134.23±7.28ab133.85±6.19ab131.72±6.36b128.88±7.18b135.02±6.32a1～4288.53±4.78a88.17±3.69a87.89±5.64ab86.96±3.59b87.16±2.67ab88.48±3.74aF/G1～211.57±0.091.57±0.081.56±0.071.52±0.061.52±0.081.56±0.0822-421.84±0.10a1.81±1.00a1.80±0.09a1.76±0.08b1.72±0.09b1.80±0.09a1～421.77±0.09a1.74±0.07a1.74±0.07a1.70±0.08b1.70±0.07b1.74±0.09a

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2.2 FGE對(duì)肉雞小腸絨毛形態(tài)的影響

由表6可見(jiàn)，與對(duì)照組相比，日糧中添加FGE顯著增加了肉雞十二指腸絨毛高度(P<0.05)。與對(duì)照組和NFGE組相比，F(xiàn)GE3和FGE4組的空腸絨毛高度顯著增加(P<0.05)，F(xiàn)GE2、FGE3、FGE4組空腸的隱窩深度顯著降低(P<0.05)。就回腸而言，與對(duì)照組和NFGE組相比，日糧中添加FGE顯著降低了肉雞回腸隱窩深度(P<0.05)，顯著提高了絨毛高度與隱窩深度之比(P<0.05)。此外，總體而言，日糧中添加FGE對(duì)十二指腸絨毛高度，空腸絨毛高度及隱窩深度產(chǎn)生了線性和二次線性影響。

表6 FGE對(duì)肉雞小腸形態(tài)及發(fā)育的影響

部位指標(biāo)日糧處理對(duì)照NFGEFGE1FGE2FGE3FGE4絨毛高度/μm1 558.00±145.61b1 633.00±156.35ab1 665.00±170.53a1 677.00±165.37a1 684.00±176.42a1 689.00±175.30a十二指腸隱窩深度/μm215.90±15.41214.87±13.46214.01±17.40213.09±19.74211.60±16.44209.19±18.59絨毛高度/隱窩深度7.25±0.357.60±0.397.78±0.427.87±0.478.05±0.488.10±0.53絨毛高度/μm1 141.00±46.78b1 162.00±48.94b1 220.00±57.94ab1 260.00±60.36ab1 287.00±40.59a1 295.00±53.73a空腸隱窩深度/μm192.74±8.54a189.56±9.47a178.62±7.39a172.13±10.48b175.52±8.97b172.67±9.20b絨毛高度/隱窩深度5.92±0.38b6.13±0.42ab6.83±0.54ab7.32±0.47a7.46±0.50a7.50±0.47a絨毛高度/μm819.00±28.43823.00±49.05839.00±50.42851.00±53.85860.00±40.47862.00±52.33回腸隱窩深度/μm109.48±5.67a106.26±6.63a103.53±7.32b101.75±6.94b100.49±7.06b99.61±6.44b絨毛高度/隱窩深度7.48±0.26b7.75±0.20b8.10±0.29a8.36±0.38a8.56±0.37a8.65±0.45a

2.2.3 FGE對(duì)肉雞消化酶活性的影響

與對(duì)照組相比，F(xiàn)GE2、FGE3和FGE4組的肉雞胰腺蛋白酶活性有顯著升高(P<0.05)(表7)。與對(duì)照組相比，F(xiàn)GE3和FGE4組十二指腸和空腸蛋白酶活性、十二指腸淀粉酶活性有顯著提高(P<0.05)；日糧中添加FGE顯著增加了空腸淀粉酶的活性(P<0.05)。分析結(jié)果表明，隨著日糧中FGE添加水平的增加，對(duì)胰腺和十二指腸的蛋白酶活性有線性(P=0.036，P=0.040)影響。

表7 FGE對(duì)肉雞胰腺和小腸內(nèi)容物消化酶活性的影響 U·g-1

2.2.4 FGE對(duì)肉雞AKP酶活性的影響

由圖5可見(jiàn)，與對(duì)照組和NFGE組相比，F(xiàn)GE2、FGE3組肉雞十二指腸AKP的活性顯著提高(P<0.05)；此外，與對(duì)照組相比，F(xiàn)GE3和FGE4組的空腸AKP活性也有顯著提高(P<0.05)。

2.2.5 FGE對(duì)肉雞血清D-木糖和尿素氮水平的影響

如圖6所示，與對(duì)照組和NFGE組相比，日糧中添加銀杏葉發(fā)酵物對(duì)血清D-木糖水平均有提高，其中FGE2、FGE3組差異顯著(P<0.05)。添加FGE顯著降低血清尿素氮水平(P<0.05)。分析結(jié)果表明，隨著日糧中FGE添加水平的增加對(duì)血清D-木糖水平有線性(P=0.013)影響。

相同指標(biāo)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

圖5 日糧添加FGE對(duì)肉雞小腸黏膜AKP活性的影響

圖6 FGE對(duì)肉雞血清D-木糖和尿素氮水平的影響

3 討論

3.1 雙菌發(fā)酵對(duì)銀杏葉-杜仲葉固態(tài)發(fā)酵的影響

本試驗(yàn)采用了黑曲霉菌和產(chǎn)朊假絲酵母菌，混合發(fā)酵銀杏葉、杜仲葉原料，使其粗蛋白、氨基酸、總黃酮類(lèi)和綠原酸含量皆得到提高，這和湯小朋[7]在研究單菌及混菌固態(tài)發(fā)酵木薯渣品質(zhì)中認(rèn)為混菌發(fā)酵能夠較好提高產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量的結(jié)論是一致的。雙菌發(fā)酵可以解除單菌發(fā)酵時(shí)微生物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物累積導(dǎo)致的反饋遏制，如本研究中黑曲霉會(huì)產(chǎn)生大量的纖維素酶，分解纖維素產(chǎn)生大量還原糖，這些還原糖除了供應(yīng)黑曲霉自身利用外，大部分將積累在培養(yǎng)基，從而阻遏黑曲霉繼續(xù)分泌纖維素酶[8]；而產(chǎn)朊假絲酵母菌恰恰可以利用這些還原糖，從而使發(fā)酵持續(xù)進(jìn)行，直至發(fā)酵更為徹底，而且還產(chǎn)生了大量的菌體蛋白[9]。這也可以解釋本研究中無(wú)論是單葉發(fā)酵還是復(fù)合葉發(fā)酵，最終產(chǎn)品的蛋白含量都有大幅提高。

3.2 發(fā)酵溫度和時(shí)間對(duì)銀杏葉-杜仲葉固態(tài)發(fā)酵的影響

固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，微生物生長(zhǎng)會(huì)有大量的熱產(chǎn)生，引起物料溫度變化，需要有效控制發(fā)酵溫度。發(fā)酵時(shí)間也是影響發(fā)酵品質(zhì)的重要因素，發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)物濃度隨著發(fā)酵時(shí)間而變化。本試驗(yàn)中銀杏葉的發(fā)酵溫度為28 ℃、發(fā)酵時(shí)間為72 h，杜仲葉的發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵時(shí)間為96 h，銀杏-杜仲葉混合發(fā)酵的溫度為28 ℃、時(shí)間為96 h。和趙林果等[1]以銀杏葉為原料，采用黑曲霉為發(fā)酵菌種，生產(chǎn)飼料復(fù)合酶的研究：發(fā)酵溫度是28-30 ℃，發(fā)酵時(shí)間72 h的條件相近，低于陳旸等[10]采用植物乳桿菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參皂苷發(fā)酵溫度35℃發(fā)酵溫度。低于侯衍英等[11]以紅曲霉雙向固態(tài)發(fā)酵丹參20 d的發(fā)酵時(shí)間。這和微生物的種類(lèi)和具體發(fā)酵基質(zhì)相關(guān)。

3.3 FGE對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響

植物資源經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵處理，發(fā)酵產(chǎn)物中富含各種酶、維生素和生長(zhǎng)因子[12]，發(fā)酵后銀杏黃酮甙元能夠更容易、更迅速地被動(dòng)物的腸道消化吸收[13]。本研究中，AA肉雞日糧中添加發(fā)酵產(chǎn)物FGE顯著改善了F/G，原因可能是日糧中添加銀杏-杜仲葉發(fā)酵物改善了肉雞腸道的健康狀態(tài)，進(jìn)而降低了肉雞的脂肪沉積。腹部沉積的脂肪作為家禽產(chǎn)業(yè)和家禽市場(chǎng)的一種浪費(fèi)，被認(rèn)為是一種額外的損失，本試驗(yàn)揭示了日糧中添加FGE能夠降低腹部脂肪的沉積，進(jìn)而改善了動(dòng)物的飼料效率。

3.4 FGE對(duì)肉雞消化機(jī)能的影響

腸道是最重要的營(yíng)養(yǎng)吸收位點(diǎn)，腸道黏膜的結(jié)構(gòu)能夠在一定程度上反應(yīng)腸道健康與否。食糜中存在的應(yīng)激因子與黏膜表面近距離接觸，能夠快速改變腸道黏膜的結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，飼喂FGE組肉雞的十二指腸和空腸的絨毛高度，空腸的絨毛高度與隱窩深度之比都有顯著增加。本試驗(yàn)中所觀察到的生產(chǎn)性能的改善與腸道結(jié)構(gòu)的改善是相吻合的。

在腸道中，隨著腸細(xì)胞的成熟并上移至絨毛頂端，AKP酶活性的表達(dá)增加。因此，AKP活性的增加表明腸道中較多數(shù)量的官能的和成熟的腸上皮細(xì)胞[14]。本試驗(yàn)中，發(fā)酵物處理肉雞的AKP活性比對(duì)照組顯著提高，這可能暗示了銀杏-杜仲葉發(fā)酵物具有通過(guò)刺激AKP的活性而改善機(jī)體消化和吸收功能的能力。日糧中添加FGE對(duì)AKP活性的刺激作用也支持本試驗(yàn)中生產(chǎn)性能的結(jié)果。

胰腺及腸道消化酶在腸道大分子的消化與吸收中起著關(guān)鍵的作用。本試驗(yàn)中腸道蛋白酶和淀粉酶的活性增加與尿素氮分泌降低的結(jié)果相一致。Hong等[15]報(bào)道大分子的肽，如抗原蛋白，可能會(huì)被降解為小分子的肽。同時(shí)，抗?fàn)I養(yǎng)因子-酶復(fù)合物的減少可能也會(huì)為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化讓出更多的消化酶[16]，最終導(dǎo)致對(duì)飼料更高效率的利用并改善肉雞的F/G。因此，肉雞日糧中添加FGE對(duì)腸道消化酶活性的改善作用可能與FGE中的蛋白質(zhì)對(duì)酶的降解作用有關(guān)。

4 結(jié)論

銀杏-杜仲葉復(fù)合發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)：初始含水量60%，培養(yǎng)基初始pH為5.0，接種產(chǎn)朊假絲酵母菌量為1.00%，銀杏葉與杜仲葉配比為2∶1，黑曲霉菌接種量為2.00%，發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時(shí)間為96 h，培養(yǎng)基通過(guò)生物轉(zhuǎn)化后營(yíng)養(yǎng)豐富，總黃酮和綠原酸含量達(dá)到最優(yōu)化，分別為2.13%和0.50%，比發(fā)酵前分別提高了27.55%和19.48%。發(fā)酵后蛋白含量提高103.30%，必需氨基酸含量提高69.52%。日糧中添加0.2%～0.5%(后期0.4%～1.0%)的FGE，能夠改善腸道結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)腸道消化吸收功能，明顯降低料重比，從而提升肉雞的生長(zhǎng)性能。