豬SIRT5基因外顯子區(qū)多態(tài)性研究

張雄，史開志*，陳大軍，張勇，楊紅，王天松

(1. 貴州省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005；2. 赫章九龍農業(yè)旅游開發(fā)有限公司，貴州 赫章 553200；3. 貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；4. 畢節(jié)市畜禽遺傳資源管理站，貴州 畢節(jié) 551700)

沉默信息調節(jié)因子(sirtuins)是一類動態(tài)調節(jié)細胞生理的進化保守酶。哺乳動物有7種SIRT(SIRT 1～7)，它們位于不同的細胞間且具有不同的功能[1-3]。SIRT5屬于一種位于多個亞細胞位點的Sirtuin異構體，具有多種酶活性，包括依賴NAD的組蛋白去乙?；浮①嚢彼崦撯}酶等，這些酶活性表明SIRT5在糖酵解、三羧酸循環(huán)和脂肪酸氧化等多種細胞代謝過程中起著重要作用[4-6]。

王利紅等[7]研究發(fā)現(xiàn)SIRT5基因在蘇姜豬各組織中廣泛表達，且在胃、腸等物質能量代謝旺盛的組織表達量較高。Rardin等[8]指出SIRT5在小鼠近端腎小管上皮細胞中調節(jié)線粒體與過氧化物酶體脂肪酸氧化的平衡。桂林生[9]對秦川牛SIRT5基因進行SNP檢測，在第7內含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)4個SNP位點，其中G22010A 和G22052A位點基因型與秦川牛背膘厚和眼肌面積顯著關聯(lián)，優(yōu)勢基因型分別為GG和GA。

鑒于SIRT5基因在動物脂質代謝途徑中調節(jié)作用，且在國內地方豬分子多態(tài)性研究中鮮有報道。本試驗以4個豬資源群體作為為試驗對象，利用DNA混池結合PCR產物直接測序法，系統(tǒng)分析SIRT5基因外顯子區(qū)域多態(tài)位點，為今后挖掘與性狀表型值關聯(lián)的特征標記奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品采集

從江香豬育肥豬66份血樣采自貴陽市綠生源香豬生態(tài)福利養(yǎng)殖場；黔北黑豬♀×巴克夏♂F1代雜交豬60份血樣采自貴州自然之園生態(tài)農業(yè)高坡養(yǎng)殖基地；夜郎黃金豬(可樂豬♀×野豬♂)34份血樣采自赫章九龍農業(yè)旅游有限公司養(yǎng)殖基地；大約克豬47份血樣采自貴陽市臺農種豬養(yǎng)殖基地。以上豬血樣均采用上海生工生物工程(上海)股份有限公司生產的Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(血液)提取其基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

瓊脂糖、2×TaqMaster Mixture、核酸染料、DL 2000-Marker均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 引物設計與合成

參考豬SIRT5基因全序列(登錄號:NC_010449.5)，采用Primer Premier 5.0設計SIRT5基因外顯子區(qū)擴增引物，送生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物詳見表1。

表1 引物序列信息

引物名稱引物序列(5'→3')退火溫度/℃片段長度/bp擴增區(qū)域SIRT5-1F:CTAGGAGCGCCTGAGAACACR:CAGAGTGGCTTTCTCCAAGG60436外顯子1SIRT5-2F:GAGGTGCGTGGCGAGGTTTR:ATCCAGCGTTGCCGTGAGC59472外顯子2SIRT5-3F:GATTTTCCAGGGTCCCTCATR:CACTCCAGGATCGTGTTAAGC58505外顯子3SIRT5-4F:AGTCCCTGGTCGCGTAGTAAR:TCCTGTGGTTTGCACTGAAC58522外顯子4SIRT5-5F:CTCTGGAGGGAGAACCACTGR:CCTGTCACCCCAGGCTAATA58636外顯子5SIRT5-6F:GGCACCTAAAAGCAGGACAAR:AGGGGAAAGGCTTTGAGAAG58560外顯子6SIRT5-7F:GCACAACCAGAATGTGAACGR:CGTTTGCTTCCATCAGAACA57554外顯子7SIRT5-8F:ATCATCTGTGTGGTGCCTGAR:ACACCTTTACTCCCCCTGCT60656外顯子8

1.4 PCR擴增反應

PCR擴增采用25 μL反應體系，反應體系如下：2×EsTaqMasterMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，模板DNA 2 μL(20 ng/μL)。反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(溫度見表1)，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸2 min。PCR擴增產物4 ℃保存，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑選特異性好的PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 變異位點篩選及等位基因頻率估算

豬SIRT5基因原序列與測序峰圖運用Megalign和Seqman軟件進行序列比對分析，確定SNPs位點。使用MWsnap 3.0軟件測量各SNPs等位基因的相應高度，等位基因頻率計算公式如下：Fi=Hi/(H1+H2)(i=1，2)。式中：Fi表示 SNP位點等位基因頻率，H1、H2表示等位基因在測序峰圖上的高度。

1.6 mRNA二級結構分析

采用在線生物信息學分析軟件RNAfold WebServer對豬SIRT5基因突變前后的mRNA二級結構進行預測分析。

2 結果與分析

2.1 DNA提取與PCR擴增

用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測SIRT5基因第1～8外顯子PCR擴增產物，結果見圖1。由圖可知，PCR擴增產物與目的片段大小一致，特異性良好，達到測序標準。

A.第1外顯子；B. 第2外顯子；C. 第3外顯子；D. 第4外顯子；E. 第5外顯子；F. 第6外顯子；G. 第7外顯子；H. 第8外顯子

M.DL2000 Marker；1.從江香豬；2.黔北黑豬♀×巴克夏♂F1代雜交豬；3.夜郎黃金豬；4.大約克豬

圖1 豬SIRT5基因外顯子區(qū)PCR擴增產物電泳檢測

2.2 序列比對與SNP位點挖掘

將PCR擴增產物進行測序，應用DNAStar軟件中Seqman程序將測序結果與NCBI中公布杜洛克豬SIRT5基因進行序列比對，在豬SIRT5基因外顯子區(qū)挖掘得到3個SNPs位點(見圖2)。參照豬SIRT5基因mRNA完整序列，以第1個轉錄起始位點+1，分別將3個變異位點命名為：G515A、C831T和A882G。其中，G515A位于第4外顯子區(qū)，為錯義突變位點，可導致第170位氨基酸發(fā)生改變，由甘氨酸改變?yōu)楣劝彼?；C831T和A882G位點分別位于第7和第8外顯子區(qū)，均為同義突變位點。

2.3 等位基因頻率估算

通過MWsnap 3.0軟件標尺對4個豬群體的3個SNPs位點峰高進行測量，并根據(jù)等位基因頻率計算公式進行頻率估算，結果見表2。從表中可見，G515A位點中，僅在黔北黑豬♀×巴克夏♂F1代雜交豬出現(xiàn)較高的多態(tài)性，G和A預測等位基因頻率值相近，而在從江香豬、夜郎黃金豬和大約克豬種中均呈現(xiàn)出單峰，為偏態(tài)分布；C831T位點中，從江香豬和夜郎黃金豬中以C預測等位基因頻率值較高，且在從江香豬群體中C和T頻率值相近，多態(tài)含量豐富，在大約克豬和黔北黑豬♀×巴克夏♂F1代雜交豬以T預測等位基因頻率值高；A882G位點中預測頻率值分布呈現(xiàn)出從江香豬多態(tài)豐富，大約克豬偏態(tài)分布。

1.從江香豬；2.黔北黑豬♀×巴克夏♂F1代雜交豬；3.夜郎黃金豬；4.大約克豬

圖2 不同品種豬SIRT5基因3個SNPs位點測序比對峰圖

表2 等位基因頻率估算結果

SNPs所處位置從江香豬黔北黑豬♀×巴克夏♂F1代雜交豬夜郎黃金豬大約克豬G515A第4外顯子G(1)G(0.49)G(1)G(1)A(0)A(0.51)A(0)A(0)C831T第7外顯子C(0.56)C(0.19)C(0.77)C(0)T(0.44)T(0.81)T(0.23)T(1)A882G第8外顯子A(0.53)A(0.22)A(0.62)A(0)G(0.47)G(0.78)G(0.38)G(1)

2.4 mRNA二級結構預測

豬SIRT5基因突變前后mRNA二級結構預測結果發(fā)現(xiàn)，C831T和A882G位點突變前后均不導致mRNA二級結構發(fā)生改變，而G515A位點突變后，豬SIRT5基因mRNA最小自由能由-358.2 kcal/mol變?yōu)?359.0 kcal/mol，突變后，自由能值每摩爾降低了0.8 kcal，RNA穩(wěn)定性提高。

3 討論

本試驗通過直接測序法在4個豬資源群體中共篩選到SIRT5基因的3個變異位點，分別為G515A、C831T和A882G，其中G515A屬于錯義突變，可導致甘氨酸(脂肪族類)改變?yōu)楣劝彼?酸性氨基酸類)。毛圓輝[10]分析基因mRNA二級結構穩(wěn)定性在翻譯過程中的功能，發(fā)現(xiàn)mRNA可通過二級結構穩(wěn)定性的變化調節(jié)翻譯過程，形式較為復雜，但最終表現(xiàn)為對蛋白質表達量顯著正相關調控，且這種正相關不受mRNA結構、豐度等其它因素的影響。本研究中，G515A位點可降低豬SIRT5基因mRNA最小自由能值，提升mRNA二級結構穩(wěn)定性，鑒于mRNA二級結構穩(wěn)定性與蛋白質表達量正相關關系，進一步推測G515A位點突變后，可大幅提高SIRT5蛋白表達水平，加快豬體內脂質代謝進程，實現(xiàn)皮下脂肪快速沉積。同時，該變異位點僅在黔北黑豬♀×巴克夏♂F1代雜交豬群體中出現(xiàn)高頻率的多態(tài)分布，而在從江香豬、夜郎黃金豬和大約克豬群體中均無多態(tài)性分布，推測豬SIRT5基因G515A位點具有極高偏向性與品種相關性，或許僅在巴克夏或貴州黔北黑豬群體中存在突變，可將其作為豬特有的分子標簽加以開發(fā)利用。

本試驗還發(fā)現(xiàn)，C831T和A882G 2個SNPs位點在從江香豬資源群體中多態(tài)信息含量豐富，變異豐度高，而在大約克豬中呈現(xiàn)偏態(tài)分布。出現(xiàn)該現(xiàn)象可能是由于豬種的不同、生存地理環(huán)境的差異，導致基因在配子中的隨機分離和在合子里的隨機重組出現(xiàn)一定偏差，引起基因頻率的變化，最終導致等位基因頻率差異化，形成不同的表型性狀[11]。同時，根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)的從江香豬群體中C831T和A882G位點變異程度大、多態(tài)含量豐富的特點，便于群體中有利基因型的定向選擇，其在今后的分子選育工作中獲得更大遺傳進展及作為育種標記的潛力更大[12]。鄧冠群[13]在秦川牛SIRT5基因3′UTR處挖掘出4個SNP，且突變位點的不同基因型對部分體尺和肌間脂肪指標影響顯著。Shuai等[14]研究闡述了SIRT5對皮膚下白色脂肪組織中的棕色脂肪細胞分化具有調節(jié)作用，且是棕色脂肪基因體外激活所必須的。結合SIRT5基因定位以及在脂質代謝中的重要功能，后期課題組將開展豬SIRT5基因SNPs位點與胴體肉質性狀的關聯(lián)分析，驗證G515A、C831T和A882G位點與地方豬背膘厚及瘦肉率指標間的相關性，發(fā)掘出可調節(jié)地方豬脂肪沉積的關鍵變異位點。