小球藻高價值活性物質(zhì)研究現(xiàn)狀及展望

郭瑞雪，楊 友，張詩雯，Qureshi Shahidmoin，顧嘉琦，武彩霞，劉進(jìn)軍，蘭金蘋

(1.河北北方學(xué)院 生命科學(xué)研究中心，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院 經(jīng)濟管理學(xué)院，河北 張家口 075000)

石油資源的日益枯竭及溫室效應(yīng)的逐漸加劇，使得人類迫切尋求更加潔凈、綠色的可再生能源。與傳統(tǒng)生物能源作物相比，微藻具有分布廣、繁殖快、易培養(yǎng)、不與人爭糧、不與糧爭地、油脂含量高等特點[1]，二氧化碳固定率是C3植物的10余倍[2]，且本身富含多種高價值、高營養(yǎng)化合物，如蛋白質(zhì)、多糖、脂類、色素、維生素、微量元素等，因此，微藻目前被認(rèn)為是最理想的生物燃料、生物固碳及廢水生物修復(fù)的開發(fā)對象[3-4]，而且是動物及人類健康的營養(yǎng)膳食添加劑[5]。一項經(jīng)濟可行性研究表明，由于微藻生產(chǎn)成本的限制，生物燃料的開發(fā)并非物有所值，除非在生產(chǎn)生物燃料的過程中伴隨高附加值副產(chǎn)品的商業(yè)化生產(chǎn)[6]。若從提取油脂之后或高固碳后的藻中得到高附加值產(chǎn)品，即微藻能源、固碳過程與其保健品、健康產(chǎn)品及功能性食品的開發(fā)同步進(jìn)行，不僅會大幅降低微藻能源的生產(chǎn)成本，而且將有不可估計的市場經(jīng)濟價值。

小球藻(Chlorella)為單細(xì)胞綠藻，不僅是國內(nèi)外正在大力發(fā)展和培育的微藻能源與固碳藻種之一，而且富含磷酸多糖[7]、天然色素[8]、多種類胡蘿卜素[9]、ω-3脂肪酸及多酚[10]等多種高價值化合物，具有抗氧化活性、抗炎、抗腫瘤、抗病原微生物等多種生物活性[11-12]。因此，小球藻作為可持續(xù)的自然資源代替合成的膳食添加劑，在預(yù)防、治療人類疾病方面具有潛在的應(yīng)用價值。為確?？沙掷m(xù)生產(chǎn)具有營養(yǎng)和健康效益的高價值產(chǎn)品，必須解決微藻的規(guī)?；囵B(yǎng)和生物精加工過程。目前，筆者所在的實驗室前期工作中已經(jīng)申請了2項專利，一是“一種微藻培養(yǎng)優(yōu)化設(shè)備”[13]，能夠在規(guī)?；?、條件化制備微藻的同時提升油脂產(chǎn)量及提高固碳效率；另一個是“一種微藻收集和濃縮的方法與裝置”[14]，解決微藻規(guī)?；囵B(yǎng)難收集問題。最近，這2項專利已經(jīng)應(yīng)用到蛋白核小球藻(ChlorellapyrenoidosaFACHB—9)的規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)中。

本文主要以小球藻活性物質(zhì)的神奇功效為出發(fā)點，探討活性物質(zhì)成分及作用機理、小球藻產(chǎn)品商品化應(yīng)用存在的問題，為今后開發(fā)應(yīng)用小球藻高附加值產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

1 小球藻功能性食品及健康價值

戰(zhàn)爭年代因糧食匱乏，一些國家利用野生小球藻來充饑，從此，小球藻被開發(fā)作為人類食物資源，成為理想的谷物替代品。小球藻商業(yè)化種植始于20世紀(jì)60年代的日本和臺灣。20世紀(jì)80年代，美國、以色列、澳大利亞、中國和泰國開始大規(guī)模培養(yǎng)，小球藻成為主要的膳食添加劑。2013年，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)證高產(chǎn)油的蛋白核小球藻S106為一般公認(rèn)安全(GRAS)食品，市場上已有小球藻面條、餃子、飲料等食品在售，其中獨有的活性成分是小球藻生長因子(chlorella growth factor，CGF)，也稱為小球藻熱水提取物，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，致使小球藻以每20 h增長4倍的速度繁殖，并且使乳酸菌呈4倍增值[15]。小球藻附加值以飼料形式喂食豬，比粗糧喂食組生長速度顯著增加，可提高血液中的IgA濃度及氮的代謝水平[15-16]。目前具有代表性的小球藻食品有日本Sun Chlorella公司的飲料、美國Shoko’s Natural Products生產(chǎn)的“CGF膠囊”、中國臺灣綠藻工業(yè)公司的“綠寶CGF”以及中國廣東綠安奇公司的“綠藻精”系列產(chǎn)品。大量基礎(chǔ)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，小球藻由于富含高質(zhì)量蛋白質(zhì)、亞麻酸、多糖、核苷酸、多肽、維生素和微量元素等多種物質(zhì)，表現(xiàn)出抗病毒、抗癌、抗氧化、消炎的作用，可顯著改善高血糖、高血壓及腫瘤病人的身體狀況[17-18]。

盡管小球藻有很多健康價值，但還有大量研究表明攝入過量的小球藻可引發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)，如過敏反應(yīng)、惡心、嘔吐等胃腸道問題。2016年召回的Soylent產(chǎn)品因以小球藻藻粉為原料而引發(fā)過敏反應(yīng)。另外，小球藻可誘發(fā)急性腎小管間質(zhì)性腎炎，引起腎功能衰竭[19]。商業(yè)化的小球藻已經(jīng)存在一定的不良反應(yīng)，急需要開發(fā)適用于人類食用的新型藻種，此外，還有更多的生物活性化合物有待發(fā)現(xiàn)。因此，需開發(fā)一種檢測潛在的有害代謝物的方法以及從微藻中提取目標(biāo)化合物代替整個生物質(zhì)的流程。

2 小球藻活性物質(zhì)分離提取及生物學(xué)活性

小球藻中含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、核酸、多種維生素及必要的礦物質(zhì)，還富含植物色素，如葉綠素、葉黃素等，其基本成分見表1。

表1 小球藻的基本成分 mg

注：表中數(shù)據(jù)為每1000 g小球藻干粉中的基本成分含量。

2.1 蛋白質(zhì)及多肽

蛋白質(zhì)在藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和代謝中起著重要作用，是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及參與光合作用催化酶的主要成分。小球藻蛋白質(zhì)與傳統(tǒng)來源的蛋白質(zhì)在數(shù)量和質(zhì)量上均不同。小球藻蛋白質(zhì)含量很高，尤其是蛋白核小球藻可高達(dá)60%以上，此外，小球藻含有哺乳動物不能合成的必需氨基酸及優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，如乳球蛋白、卵清蛋白等，其氨基酸組成高于世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)頒布的用于人類營養(yǎng)的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，作為高蛋白食品來源，小球藻能夠迅速補充體能，因此被FAO列為21世紀(jì)人類的健康食品[20]。

小球藻細(xì)胞壁堅硬，只有破壞細(xì)胞壁及細(xì)胞膜，使內(nèi)容物釋放，才能提取蛋白質(zhì)。破壞細(xì)胞壁的方法很多，其中高頻超聲法應(yīng)用較廣泛，但并不能完全充分釋放內(nèi)容物；酶解是一種非常有利的方法，它具有選擇性高、副產(chǎn)物少、操作溫度低的特點；還有許多其他方法裂解細(xì)胞壁，如鋯珠、酸或堿處理、微波、脈沖電場等。但這些方法均會影響蛋白質(zhì)提取的純度及活性。Zhang等[21]開發(fā)了乙醇浸泡、酶消法、超聲和均質(zhì)技術(shù)相結(jié)合的方法，提取72.4%的小球藻蛋白質(zhì)。從蛋白質(zhì)中純化生物活性肽是提高生物活性的必要條件，活性肽是蛋白質(zhì)混合物通過硫酸銨或有機溶劑消除脂肪、碳水化合物等成分而獲得。根據(jù)活性肽的分子量大小、疏水性和電荷等物理化學(xué)參數(shù)，可通過多種技術(shù)對其進(jìn)行分離純化，如膜超濾法、尺寸排除色譜法、反相高效液相色譜法和離子交換色譜法等。其中，反相高效液相色譜法(RP-HPLC)被認(rèn)為是最有效的多肽純化方法。另外，電膜過濾技術(shù)也是一種常用的純化活性肽的方法，比膜過濾的選擇性更強，可根據(jù)電荷和分子量分離生物活性肽，且不需要施加壓力[22]。近年來?；钚噪募兓夹g(shù)已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但其商業(yè)化生產(chǎn)仍然面臨著生產(chǎn)成本過高的挑戰(zhàn)，在生產(chǎn)過程中可能會引起肽結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致生物活性減弱或喪失。因此，對活性肽進(jìn)行純化時，需要同時考慮其有效性和經(jīng)濟性。

小球藻蛋白質(zhì)具有一定的生物學(xué)活性，Moris等[23]從小球藻中分離出一種蛋白質(zhì)的水解物，通過激發(fā)T細(xì)胞依賴的抗體反應(yīng)和促進(jìn)遲發(fā)性過敏反應(yīng)來增強機體的免疫作用。發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)水解物一般為活性肽，小球藻中鑒定的活性肽不多，其中Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Glu-Phe和Leu-Asn-Gly-Asp-Val-Trp這兩段序列均表現(xiàn)出很強的抗氧化活性和DPPH自由基清除能力[24-25]。Ko[24]等對小球藻經(jīng)蛋白酶水解后得到的酶解產(chǎn)物的抗氧化活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其酶解產(chǎn)物能夠清除過氧化物、DPPH和OH-，同時能夠降低AAPH引起的細(xì)胞凋亡和壞死，進(jìn)一步證明了小球藻蛋白質(zhì)具有清除體內(nèi)自由基、延緩衰老的生物學(xué)活性。

人體血壓的調(diào)節(jié)涉及許多復(fù)雜的系統(tǒng)，市場上有不同種類的治療高血壓藥物，但多會引起不良反應(yīng)，包括低血壓、血管性水腫、咳嗽、頭暈、頭痛、惡心和腎損傷等。因此，從自然資源中提取抗高血壓化合物具有重要的應(yīng)用價值。研究發(fā)現(xiàn)，小球藻中含有的活性肽具有抗高血壓的神奇作用，從藻類活性蛋白中提取的Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Gln-Phe、Gly-Met-Asn-Asn-Leu-Thr-Pro和Leu-Glu-Gln氨基酸序列能有效抑制人體血管緊張素轉(zhuǎn)換(ACE)的合成。Ko等[26]用小球藻的活性肽提取物對大鼠進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)小球藻中序列為Val-Glu-Tyr的氨基酸對自發(fā)性高血壓大鼠具有降壓作用，進(jìn)一步證實了小球藻蛋白質(zhì)水解物具有降低血壓上升的作用。

許多研究表明CGF中的蛋白質(zhì)具有抗腫瘤的作用，對肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞等多種癌細(xì)胞的增殖均有抑制作用。Kunt等[27]采用明膠酶譜法研究了小球藻外分泌物對人體明膠酶的抑制作用，利用Western blotting技術(shù)對MMPs-1、MMPs-2、MMPs-9蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)小球藻蛋白質(zhì)提取液可以上調(diào)TIMP-3蛋白質(zhì)表達(dá)，下調(diào)c-Jun蛋白質(zhì)表達(dá)，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞中3種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)，對乳腺癌的治療有很大的應(yīng)用價值。CGF對肝癌細(xì)胞HepG2的生長有顯著的抑制作用，Wang等[28]采用低溫高壓提取、酶解、離子交換、凝膠過濾層析等方法在小球藻中分離出一種對肝癌細(xì)胞HepG2具有抑制活性的多肽CPAP(C.pyrenoidosaantitumor polypeptide)。Tanaka等[29]用小球藻CK22藻株的糖蛋白提取物對小鼠進(jìn)行試驗，結(jié)果顯示其對小鼠的自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移有抑制作用。

2.2 碳水化合物

碳水化合物可以附著在蛋白質(zhì)或脂類(如糖蛋白和糖脂)上形成復(fù)合多糖，是小球藻細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)特征之一。小球藻可以合成許多具有不同類型結(jié)構(gòu)的碳水化合物，包括單糖、寡糖和多糖等，在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞代謝方面均具有重要的生理作用。

小球藻活性多糖具有顯著的抗腫瘤作用，Sheng[31]等從小球藻中提取出CPPSⅠa和CPPSⅡa兩種多糖，由鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和1種未知糖組成，其中CPPS Ia中半乳糖含量最高，CPPS IIa中鼠李糖含量最高，這兩種糖對肺癌A549細(xì)胞均表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。Suárez等[32]從小球藻熱水提取液中分離出一系列分子量不同但結(jié)構(gòu)相似的磷酸化多糖，發(fā)現(xiàn)其具有刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞合成一氧化氮(NO)的作用，并且高分子量的磷酸化多糖表現(xiàn)出的活性更高。進(jìn)一步對多糖進(jìn)行組分分析，顯示多糖主鏈為β-D-吡喃半乳糖-(1→3)-β-D-吡喃半乳糖-(1→3)-，從小球藻中分離出的阿拉伯多糖(47 kDa)并未顯示出刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞合成NO的活性。施瑛[33]研究了小球藻多糖的免疫活性作用，結(jié)果顯示小球藻中的多糖成分具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，作用強度與所用多糖劑量有關(guān)。藻細(xì)胞中的硫酸鹽多糖(SPS)是研究最多的具有抗炎活性的碳水化合物，Kang等[34]發(fā)現(xiàn)從微藻中提取的硫酸-1-葡聚糖可以限制巨噬細(xì)胞NO和PGL2的產(chǎn)生，對炎癥的產(chǎn)生具有抑制作用。還有研究表明，從藻種提取的硫酸化-巖藻多糖可以通過與細(xì)胞核的表面結(jié)合而減少炎癥的發(fā)生，對機體炎癥的預(yù)防具有顯著作用[35]。

2.3 脂質(zhì)

脂質(zhì)是質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)組成部分，中性油脂是多糖儲存的能量儲存體。小球藻的脂質(zhì)分?jǐn)?shù)主要是中性脂質(zhì)，包括甘油酯、游離脂肪酸、類胡蘿卜素(如β-carotene)和極性脂質(zhì)，如各種磷脂和半乳糖脂類。藻細(xì)胞中的脂肪酸結(jié)構(gòu)一般由C16和C18飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的混合物以及更長的碳鏈組成。飽和脂肪通常儲存在中性脂質(zhì)中，而不飽和脂肪酸則主要與極性脂質(zhì)存在于不同的膜中，在不同的培養(yǎng)條件下維持膜的流動性。

從藻細(xì)胞中提取脂質(zhì)通常使用非極性有機溶劑或溶劑混合物，如氯仿-甲醇和己酮-異丙醇。提取后使用額外的處理步驟，包括分餾或冬化，將多不飽和脂肪酸(PUFAs)從總脂類中分離出來。然而，由于含有雜質(zhì)、氣味、味道和渾濁的外觀，仍然不適合人類食用，需要過濾、漂白、脫臭、拋光和添加抗氧化劑進(jìn)一步凈化。值得注意的是,萃取過程中使用大量溶劑引起了人們對健康、安全和環(huán)境的嚴(yán)重關(guān)注。因此，需要在溶劑回收、用綠色溶劑取代傳統(tǒng)有機溶劑和執(zhí)行更可持續(xù)的過程方面做出更多努力。

長鏈多不飽和脂肪酸在多種炎癥病理中具有治療作用，如阿爾茨海默病、關(guān)節(jié)炎和狼瘡。越來越多的動物實驗和體外實驗支持微藻油的抗炎特性。Nauroth等[36]報道，使用二十二碳五烯酸(DPA)可以抑制脂多糖(LPS)刺激分泌白介素(IL)1β和干擾腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在人類外周血單核細(xì)胞中存在。與對照組相比，喂食含有DPA(占總脂肪酸的16%)和DHA(占總脂肪酸的40%)的藻油的大鼠顯著降低了足水腫模型大鼠的炎癥反應(yīng)。Banskota等[37-38]也報道了含有單半乳糖二酰基甘油的脂質(zhì)提取物對264.7個巨噬細(xì)胞的抗炎作用。此外，在飲食中使用微藻油，特別是富含omega-3的脂肪酸，已被證明對偶氮甲烷誘導(dǎo)的結(jié)腸隱窩功能異常具有化學(xué)反應(yīng)作用。CGF中含有的亞油酸、γ-亞麻酸等多種脂肪酸，對降低血壓及血糖血脂也有顯著的作用，同時富含多種不飽和脂肪酸，其中的二十二碳六烯酸(DHA)被稱為“腦黃金”，可以促進(jìn)腦細(xì)胞的生長發(fā)育，在保健產(chǎn)品及嬰幼兒奶粉方面有廣泛應(yīng)用[39]。

2.4 色素

小球藻細(xì)胞中的總色素含量約占4%～5%，其中包含葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素。類胡蘿卜素是包括脂溶性胡蘿卜素和葉黃素在內(nèi)的光合器官的組成部分，這些化合物可獲得光能，同時也可作為光保護(hù)劑來抵抗自由基和惡劣的環(huán)境條件，如強烈的太陽輻射和紫外線。類胡蘿卜素是由各種相關(guān)色素以不同的比例自然產(chǎn)生的，利用其廣泛的作用可開發(fā)一系列高效益產(chǎn)品，有良好的發(fā)展前景和市場。

目前常見色素提取方法主要有有機溶劑浸提法、超臨界CO2法和吸附樹脂法。Kong等[40]研究了超聲輔助提取法提取普通小球藻油脂分離葉綠素的方法，發(fā)現(xiàn)最佳提取參數(shù)為：提取溫度61.4 ℃，提取時間78.7 min，乙醇體積79.4%，超聲功率為200 W。在此優(yōu)化條件下，小球藻活性物質(zhì)中的葉綠素含量可達(dá)88.9%。

小球藻類胡蘿卜素結(jié)構(gòu)中存在大量的共軛雙鍵或特定基團，使其抗氧化活性明顯高于植物或合成類似物。這些化學(xué)基團通過清除活性物質(zhì)中的自由基和單線態(tài)氧，將它們中和成危害性較小的分子，激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2，繼而觸發(fā)抗氧化基因在特定細(xì)胞和組織中的表達(dá)。近年來，許多國家都致力于小球藻添加到化妝品領(lǐng)域的研究。藻細(xì)胞中維生素種類齊全，維生素A能保護(hù)皮膚黏膜，維生素C可以分解皮膚中的黑色素，保持皮膚潔白細(xì)嫩，維生素E能延緩皮膚細(xì)胞衰老。日本越來越多的化妝品加入藻粉及藻精成分，多功能面膜及美容美發(fā)系列產(chǎn)品風(fēng)行于美國、日本及西歐等國家。藻細(xì)胞中的類胡蘿卜素可以延緩衰老，還具有抗炎特性，特別是蝦青素因其抗炎作用而受到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素(劑量為100 mg·kg-1)的抗炎作用比普通抗炎藥物潑尼松龍(劑量為10 mg·kg-1)更為明顯[41]。蝦青素還可以抑制NO的生產(chǎn)，降低促炎細(xì)胞因子的水平，抑制腫瘤壞死因子和致炎細(xì)胞因子等[42]。藻細(xì)胞中的葉綠素不僅有促進(jìn)肌膚新城代謝、延緩皮膚老化作用，在降低膽固醇、促進(jìn)傷口愈合、治療缺鐵性貧血方面也具有顯著功效[43]。小球藻中的葉黃素能夠延緩慢性疾病的發(fā)生，同時還可以防止眼部疾病的發(fā)生并對心血管疾病也具有顯著的防治作用[44]。

3 小球藻開發(fā)存在的問題

小球藻活性物質(zhì)和提取的高價值副產(chǎn)品目前被用于營養(yǎng)食品和功能食品，其提取物的生物活性和經(jīng)濟價值已被廣泛認(rèn)知。但小球藻生物量中有許多未定義的生物化學(xué)物質(zhì)、潛在的毒素和重金屬，可能引起不安全消費并導(dǎo)致嚴(yán)重的健康狀況，這需要進(jìn)一步研發(fā)活性物質(zhì)的純化；另一方面，高價值的小球藻產(chǎn)品的供應(yīng)受到生產(chǎn)總成本的挑戰(zhàn)，包括栽培系統(tǒng)和維護(hù)、有限的培養(yǎng)生產(chǎn)力和生物精餾過程。雖然露天池塘是大規(guī)模養(yǎng)殖最經(jīng)濟的選擇，但它們更容易受到污染，因此，如果所選菌株合成的有價值的產(chǎn)品能夠證明該系統(tǒng)的成本是合理的，那么封閉的光生物反應(yīng)器是首選。此外，收獲和提煉生物質(zhì)也可能非常昂貴，而且成本在很大程度上取決于所選擇的過程。傳統(tǒng)的提取高價值代謝物的方法往往依賴于使用有機溶劑，產(chǎn)品中的殘留溶劑可損害健康。因此，超臨界流體萃取和酶解等綠色技術(shù)被認(rèn)為是分離高價值藻類產(chǎn)品的新興技術(shù)。小球藻加工環(huán)節(jié)中的“干燥”和“破壁”能耗過高，涉及到高溫、高壓等條件，制約其產(chǎn)業(yè)化。為了維持蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)的功能，細(xì)胞解體應(yīng)在溫和條件下進(jìn)行，但會導(dǎo)致目標(biāo)組分的提取率較低，故如何高效提取小球藻生長因子中的活性物質(zhì)并進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化有待進(jìn)一步探索研究。

4 結(jié)論與展望

小球藻活性物質(zhì)在抑制腫瘤、抵抗炎癥、防治慢性心血管疾病、增強機體免疫調(diào)節(jié)、防止氧化及延緩衰老等方面均表現(xiàn)出積極的生理作用，值得進(jìn)一步研究和探索。小球藻在醫(yī)學(xué)藥品、功能性食品、化妝品及新型餌料領(lǐng)域有著巨大的開發(fā)潛力和發(fā)展前景，對藻類成分的探明及功能研究成果顯著。雖然小球藻大規(guī)模培養(yǎng)及產(chǎn)業(yè)化面臨許多挑戰(zhàn)，但市場上對藻類產(chǎn)品的需求促使科研工作者對藻類物質(zhì)作進(jìn)一步研究，并有望取得更大的突破。