豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒及其敲除抑制方法

張健民 李 陽

（1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州，510282；2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院肝膽二科，廣東 廣州，510282）

引言

目前，供體的極度短缺是器官移植所面臨的最大的障礙，很多患者在等待供體器官中死去。雖然國家采取了多項(xiàng)措施用于鼓勵(lì)和推廣器官捐贈(zèng)，但并沒有有效解決我國器官供體嚴(yán)重短缺現(xiàn)象。目前，異種器官移植被認(rèn)為是解決供體器官短缺現(xiàn)狀的一種有效方法。其中，豬由于具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、豬的心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、皮膚、營養(yǎng)需要、骨骼發(fā)育以及礦物質(zhì)代謝等都與人的情況極其相似；2、豬的主要臟器器官與人類大小相近；3、豬基因多樣、繁殖周期短、生產(chǎn)力高，一窩產(chǎn)仔多，便于根據(jù)特殊需要進(jìn)行選育；因此，被認(rèn)為是異種移植器官組織來源的最佳供體。但使豬成為異種移植器官供體仍有很多障礙需要克服，這主要包括免疫排斥和致病微生物的傳播。早在十幾年前科學(xué)家就開始對(duì)豬進(jìn)行免疫學(xué)改造，以解決免疫排斥問題。對(duì)于豬體內(nèi)的病原微生物，其絕大多數(shù)真菌、細(xì)菌、病毒可通過SPF級(jí)培育凈化去除，但豬基因組內(nèi)存在的PERV難以通過凈化培育去除。本文對(duì)PERV的特征及抑制其表達(dá)的方法進(jìn)行了綜述。

1 PERV簡介

1.1 PERV分子特性：

PERV的基因組為單股正鏈線性RNA，長約7-9kb，由兩端的非編碼區(qū)和中間的gag、pol、env三個(gè)編碼區(qū)組成。Gag編碼病毒的核心蛋白；pol基因編碼病毒復(fù)制所需的酶類，主要有蛋白酶（PR）、逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）和整合酶（IN）；env基因編碼囊膜糖蛋白，主要包括表面蛋白（SU）gp70和穿膜蛋白(TM)p15E。根據(jù)PERV env基因編碼的不同，可以將PERV分為三個(gè)亞型：PERV-A、PERV-B、PERV-C，其差異主要在于SU表面糖基化的VRA、VRB和PRO區(qū)，這種差異可能導(dǎo)致不同類型的PERV有著不同的宿主感染范圍。

PERV的基因序列不保守：巴馬小型豬PERV（PERV-BM）株為進(jìn)化株A亞型的進(jìn)化分支[1]，以PERV-BM基因序列為基準(zhǔn)，將其與GenBank數(shù)據(jù)庫公布的17株不同亞型的PERV序列進(jìn)行全基因序列同源性比對(duì)分析，結(jié)果表明PERV-BM與同樣來自中國的EF133960 CA亞型)同源性最高，為97.1%；與英國的KC 116219 C同源性最低，為88.4%，PERV呈現(xiàn)不保守性。

圖1 PERV-巴馬株與其它各亞型PERV之間的核苷酸序列同源性比較（1）

圖2 PERV巴馬株的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（1）

1.2 PERV的分布：

PERV在不同豬種和組織中分布情況不同。對(duì)PERV感染和分布情況可以通過直接檢測病毒DNA、病毒mRNA及相關(guān)病毒蛋白的存在來證明PERV感染，也可通過檢測病毒產(chǎn)物來間接證明存在PERV病毒感染[2][3][4]。利用PCR、實(shí)時(shí)PCR[5][6][7]、Southern blot[8]等方法可以直接檢測出病毒前DNA的存在；通過對(duì)PERV設(shè)計(jì)引物和探針還可以直接檢測出細(xì)胞中PERV的拷貝數(shù)[9]；通過FISH可檢測出PERV前DNA在染色體中的位置[10][11]；PERV所表達(dá)RNA的水平可通過RT-PCR的方法進(jìn)行檢測[12]；其相關(guān)蛋白的表達(dá)，可通過 Western blot、免疫組化等方法進(jìn)行檢測[13][14]。通過檢測RT等酶的活性可以間接驗(yàn)證PERV的存在[15]。Sai P.[16]等通過western blot和RT-PCR等方法從蛋白和mRNA水平對(duì)不同豬種、不同臟器組織中PERV的表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)PERV表達(dá)水平都不盡相同。以Q-PCR等方法檢測不同豬種組織臟器中PERV前DNA拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)不同豬種不同組織來源細(xì)胞中PERV前DNA拷貝數(shù)也不相同（表1）。

表1 各種豬源組織細(xì)胞中PERV拷貝數(shù)

豬基因組學(xué)研究顯示在豬的基因組中PERV前DNA拷數(shù)為10到100[8][21][22][23]不等，Ramis G[24]等驗(yàn)證了PERV的拷貝數(shù)與豬的雜合性無關(guān)聯(lián)。對(duì)六種不同的豬亞種（Large White pig、Westran pig、Korean pig、Wild boar、Yucatan mini pig、d/d mini pig）豬基因組中的PERV 分布情況進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)PERV可存在于豬的各條染色體上，在每個(gè)染色體中的 拷貝數(shù)在0-5之間，但其在每條染色體上的分布規(guī)律尚未發(fā)現(xiàn)。[25][26][27][28][29][30]。Clemenceau B[16]等還對(duì)SPF培育豬中PERV mRNA的表達(dá)量進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)所有組織中均可檢測到PERV的表達(dá)。其中，以腎臟中PERV的表達(dá)量最高，肝臟、肺和心臟其次，胰臟中PERV的表達(dá)量最低。PERV在不同組織表達(dá)量的差異是由于PERV的LTR在不同組織中轉(zhuǎn)錄活性的不同造成的[31][32]。SPF豬和普通豬中PERV的表達(dá)量沒有明顯的差異，說明SPF培養(yǎng)不能夠去除豬基因組中的 PERV，SPF豬并不能夠降低異種移植時(shí)PERV傳染給人的風(fēng)險(xiǎn)。

1.3 PERV的感染過程：

首先，PERV的跨膜蛋白先與靶細(xì)胞膜融合，使病毒的核心部分進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，病毒基因組RNA復(fù)制形成雙鏈的DNA，雙鏈DNA再在整合酶的作用下整合到靶細(xì)胞基因組中，并以前DNA的形式存在。PERV前DNA成為細(xì)胞基因組的永久成分，隨宿主細(xì)胞DNA的復(fù)制而復(fù)制。前病毒DNA可以在宿主細(xì)胞RNA聚合酶II的作用下，轉(zhuǎn)錄生成病毒RNA，再經(jīng)過加工形成mRNA。在mRNA的指導(dǎo)下進(jìn)一步形成病毒相關(guān)蛋白，主要包括核心蛋白、表面蛋白、穿膜蛋白以及功能酶類（蛋白酶、反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶）。待病毒RNA基因組和結(jié)構(gòu)蛋白都形成后，病毒就開始自我裝配，并以出芽的方式從細(xì)胞膜上釋放出來，感染其他細(xì)胞。

1.4 PERV的感染特性：

現(xiàn)已證實(shí)，多種類型的豬細(xì)胞都存在PERV感染，可以釋放PERV病毒顆粒，在體外培養(yǎng)條件下PERV可以感染多種人源細(xì)胞[33]。PERV-A和PERV-B的宿主范圍較寬，不僅可以感染豬、貂等動(dòng)物細(xì)胞，也可以感染人類的293、TE671、Hela、U87等細(xì)胞系；PERV-C目前僅發(fā)現(xiàn)它可以感染2種豬細(xì)胞系和一種人細(xì)胞系；PERV-A和PERV-C會(huì)形成重組體PERV-A/C，其感染人細(xì)胞的能力遠(yuǎn)高于PERV-A。因此，宜選擇PERV-C陰性豬作為異種器官移植的供體來源。Luc JW等研究表明PERV能夠跨物種間體內(nèi)感染。他們先進(jìn)行了體外培養(yǎng)條件下，跨物種間細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)豬的胰島細(xì)胞可釋放PERV顆粒，并能夠感染體外培養(yǎng)人細(xì)胞，。之后他們將豬的胰島移植入NOD/SCID鼠體內(nèi)(非肥胖糖尿病鼠伴嚴(yán)重的免疫功能低下)，在移植后的鼠脾、肝、腎、小腸等若干組織細(xì)胞內(nèi)都檢測到了PERV的表達(dá)[34]。對(duì)于PERV在體內(nèi)條件下能否感染人體組織細(xì)胞，Paradas等對(duì)160名接受豬活體組織治療的患者進(jìn)行了PERV感染情況的追蹤調(diào)查，其中脾灌流100人，豬源性生物人工肝HEPAT Assist儀治療28人，豬皮移植15人，豬胰島細(xì)胞移植14人，體外腎灌流2人，豬整肝灌流1人，追蹤調(diào)查的這12年內(nèi)，這些患者均未出現(xiàn)病毒血癥；對(duì)PERV感染進(jìn)行檢測，有159人(97%)未檢出PERV感染，有23人存在微嵌合(PERV DNA及豬特異DNA雙陽性)，繼續(xù)觀察8.5年，均未有PERV感染發(fā)生[35]。雖然PERV能否感染人體組織細(xì)胞仍然存在爭議，但目前尚不能排除豬器官移植人體后存在PERV感染的風(fēng)險(xiǎn)。豬器官移植靈長類后，最長存活時(shí)間已超過365天，還未有豬器官中PERV在長期條件下，是否會(huì)感染靈長類的研究。目前也沒有更多豬器官移植人體及其PERV感染情況的報(bào)道。為了避免豬器官移植人體后存在PERV感染的風(fēng)險(xiǎn)，有必要去除豬基因組中PERV基因，以解除PERV感染人體的風(fēng)險(xiǎn)，為異種移植奠定基礎(chǔ)。

2 PERV的抑制和消除

目前，對(duì)PERV進(jìn)行抑制和消除的方法主要有三種，包括1）通過抑制病毒反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶活性抑制PERV的感染；2）通過RNAi的方法抑制PERV的表達(dá)；3）通過基因編輯技術(shù)對(duì)基因組中PERV的前DNA序列進(jìn)行敲除。

圖3 PERV感染過程及其抑制和消除

2.1 反轉(zhuǎn)錄酶（RT）和整合酶（IN）活性的抑制：

PERV的Pol編碼區(qū)編碼病毒所需的多種酶類，其中最主要的三種為：蛋白酶、反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶。通過抑制病毒復(fù)制、整合所需酶類的活性，可抑制病毒感染。

2.1.1 整合酶活性的抑制：

整合酶的作用是將PERV的前DNA整合到宿主基因組中。目前已證明二酮酸類化合物可抑制細(xì)胞內(nèi)整合酶活性。其作用機(jī)制是二酮酸類化合物可以與病毒DNA和整合酶結(jié)合所形成復(fù)合物催化核心區(qū)域中的二價(jià)金屬相結(jié)合，從而阻止了復(fù)合物與宿主DNA的結(jié)合，抑制了病毒DNA與宿主DNA的整合。

雷特格韋（Raltegravir、RAL）是一種常用整合酶抑制劑，RONFORT Corinne[36]等分別在分子水平和細(xì)胞水平證實(shí)了RAL能夠有效抑制PERV整合酶的活性。在分子水平，當(dāng)RAL的濃度達(dá)到400nM時(shí)，IN活性下降90%；細(xì)胞水平，在10nM RAL濃度處理下感染了PERV的293T細(xì)胞在經(jīng)過了39天的處理后感染了PERV的比例幾乎為零，而對(duì)照組中的感染了PERV的293T細(xì)胞達(dá)到了100%。說明了RAL能夠有效的抑制PERV整合酶活性。

2.1.2 反轉(zhuǎn)錄酶活性的抑制：

反轉(zhuǎn)錄酶具有多種酶活性，現(xiàn)已被證明其具有聚合酶活性和RNA H活性。聚合酶可以以DNA或RNA為模板，合成一條新的DNA鏈，RNA酶H再特異性的降解RNA-DNA雙鏈中的RNA鏈。逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑可以抑制病毒RNA的復(fù)制，從而抑制PERV的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑主要包括兩種：核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NRTIS）和非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIS)。

Joachim Denner、F.X.Wilhelm、WALID HENEINE[37][38][39]等研究者檢測了十余種NRTIS和NNRTIS對(duì)PERV逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制效果，其中AZT和ddGTP效果較明顯，AZT的濃度達(dá)1uM時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄酶活性最低。

2.2 RNAi抑制PERV的表達(dá)

RNA干擾是生物界普遍存在的一種抵御外來基因和病毒感染的保守進(jìn)化機(jī)制，其本質(zhì)是siRNA與靶向mRNA特異性結(jié)合，并由RISC介導(dǎo)mRNA降解，從而沉默靶向基因。

許多研究者利用siRNA干擾降解PERV編碼區(qū)mRNA從而抑制PERV的表達(dá)。Joachim Denner、Y GAO[40][41]等針對(duì)PERV編碼區(qū)的相對(duì)保守區(qū)域gag、pol序列設(shè)計(jì)siRNA，用來抑制PERV的表達(dá)，并通過RT-PCR驗(yàn)證了各個(gè)siRNA干擾PERV表達(dá)的效率，發(fā)現(xiàn)siRNA pol2的抑制效果最顯著。

Ryota Shirakura、David Ayares、Joachim Denner、Y GAO[40][41][42][43][44]等十余研究團(tuán)隊(duì)都成功利用siRNA有效的抑制了PERV的表達(dá)。Joachim Denner等使用慢病毒載體攜帶siRNA-pol2轉(zhuǎn)染豬成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞較對(duì)照組PERV的表達(dá)量明顯降低。他們再利用體細(xì)胞核移植技術(shù)以PERV抑制細(xì)胞為供體，制作出了克隆豬。該克隆豬所有的組織器官基因組中都可檢測出siRNA-pol2的轉(zhuǎn)入，并且克隆豬PERV的表達(dá)量也較野生型豬有顯著降低。他們再以分出的陽性豬成纖維細(xì)胞進(jìn)行再克隆，再克隆豬PERV的表達(dá)量較對(duì)照組也有顯著下降。

2.3 PERV敲除

由于PERV在豬基因組中拷貝數(shù)較多，利用傳統(tǒng)敲除方法無法實(shí)現(xiàn)完全敲除，之前研究多利用RNAi技術(shù)對(duì)PERV表達(dá)進(jìn)行抑制。在ZFN、TALEN、Crispr/Cas9等高效基因編輯技術(shù)之后，使對(duì)PERV的完全敲除成為可能。

2.3.1 ZFN敲除PERV序列

Joachim Denner[45]等首先使用ZFN敲除細(xì)胞系中的PERV。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞系中可檢測到ZFN的表達(dá)，但是較對(duì)照組相比PERV拷貝數(shù)以及其mRNA表達(dá)量無明顯差異。ZFN未能有效的敲除細(xì)胞系中PERV，這可能是由于ZFN打靶效率相對(duì)較低導(dǎo)致的。

2.3.2 Crispr/Cas9敲除PERV

Crispr/Cas9打靶技術(shù)出現(xiàn)后，George Church、Luhan Yang[19]等利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功的滅活了PK15細(xì)胞中的多達(dá)62個(gè)拷貝的PERV序列。他們針對(duì)PERV保守序列pol區(qū)設(shè)計(jì)gRNA后連入PB轉(zhuǎn)座子載體中，構(gòu)建成PB-Cas9/2gRNAs載體。將PB-Cas9/2gRNAs載體轉(zhuǎn)入PK15細(xì)胞，PK15細(xì)胞可持續(xù)高效的表達(dá)靶向PERV序列Cas9和gRNA，從而導(dǎo)致PK15細(xì)胞中的62個(gè)PERV拷貝全部發(fā)生了堿基的插入或者缺失。被基因編輯的PK15細(xì)胞喪失了感染HEK293細(xì)胞的能力，62個(gè)PERV拷貝全部被滅活。

3 結(jié)論

PERV是已整合在豬的基因組中的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，整合酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、siRNA干擾等方法都能在一定程度上抑制的PERV的表達(dá)。但是通過這些方法，只是抑制了PERV的表達(dá)，PERV前DNA仍然存在與豬的基因組中，其潛在危險(xiǎn)性仍未被去除。利用ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)對(duì)其進(jìn)行敲除時(shí)，由于PERV基因序列的不保守性，即使在相對(duì)保守的gag、pol區(qū)域仍有許多不保守的序列，增加了將其從豬基因組中完全去除的難度。并且PERV有較強(qiáng)的自我修復(fù)能力，敲除的堿基數(shù)小于10bp，或其拷貝數(shù)敲除不完全時(shí)，可能只發(fā)生短暫的失活或表達(dá)降低，在殘余PERV序列作用下，又迅速恢復(fù)其活性。因此，在個(gè)體水平對(duì)PERV進(jìn)行完全敲除，制作無PERV的異種器官移植供體豬仍存在很多困難。George Church等已成功利用Crispr/Cas9技術(shù)將PK15細(xì)胞中62個(gè)拷貝的PERV失活。Crispr/Cas這一高效基因打靶技術(shù)的出現(xiàn)，使在個(gè)體水平對(duì)豬PERV序列進(jìn)行完全敲除成為可能。今后，可以以同樣的技術(shù)對(duì)體細(xì)胞PERV進(jìn)行敲除，獲得無PERV的體細(xì)胞后，再進(jìn)行克隆豬制作，以獲得無PERV豬。筆者所在實(shí)驗(yàn)室已通過CRISPR/Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)豬的基因修飾，并已培育出基因修飾豬30多種[46][47]，目前正在進(jìn)行無PERV豬的培育工作。無PERV豬培育成功后將極大推動(dòng)異種器官移植的發(fā)展。