Biacore 分子互作技術(shù)加速抗體藥研發(fā)和申報

文/張睿

抗體藥研發(fā)涉及篩選、活性檢測、表位作圖、一致性評價、免疫原性和質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)——Biacore 作為藥物活性檢測平臺，可以滿足藥物研發(fā)多個環(huán)節(jié)的需求，加快研發(fā)速度，其準確穩(wěn)定的數(shù)據(jù)質(zhì)量已經(jīng)得到了藥企和監(jiān)管部門的廣泛應(yīng)用和認可。本文將利用抗體研發(fā)與質(zhì)控中的幾個重要環(huán)節(jié)來展示Biacore 分子互作技術(shù)的原理和應(yīng)用。

抗體藥具有性能均一、特異性好的優(yōu)勢，在腫瘤、免疫等各類疾病的治療中發(fā)揮著重要作用。國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）頒布了多個抗體藥物法規(guī)及指導(dǎo)原則，規(guī)范抗體藥物的研發(fā)生產(chǎn)及申報流程。隨著原研藥在國內(nèi)的上市和藥品采購價格的下滑，加快研發(fā)效率、降低生產(chǎn)成本成為抗體藥市場競爭的關(guān)鍵?？贵w藥研發(fā)涉及篩選、活性檢測、表位作圖、一致性評價、免疫原性和質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)。Biacore 作為藥物活性檢測平臺，可以滿足藥物研發(fā)多個環(huán)節(jié)的需求，加快研發(fā)速度，其準確穩(wěn)定的數(shù)據(jù)質(zhì)量已經(jīng)得到了藥企和監(jiān)管部門的廣泛應(yīng)用和認可。目前，Biacore 基于表面等離子共振技術(shù)已經(jīng)被中國、美國和日本藥典收錄。本文將利用抗體研發(fā)與質(zhì)控中的幾個重要環(huán)節(jié)來展示Biacore分子互作技術(shù)的原理和應(yīng)用。

圖1 Biacore 技術(shù)檢測Taltz 與IL-17A 的親和力結(jié)果

抗體篩選與定量

細胞株的好壞很大程度上決定了抗體藥的質(zhì)量和成本，因此細胞株的篩選與定量是抗體藥研發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。ELISA 法由于檢測精度差、自動化程度低等問題，已經(jīng)無法滿足細胞株篩選的要求。Biacore 技術(shù)可以大大提高抗體篩選的效率和準確性，實現(xiàn)上清、腹水的直接檢測。動力學(xué)數(shù)據(jù)在抗體篩選中尤為關(guān)鍵，因為解離速率決定了抗體的在靶時間，解離速率慢的抗體成藥性更好。Biacore 技術(shù)通過檢測解離速率的快慢完成排序，抓取出想要的候選分子。表達量也是細胞株開發(fā)的重要指標，在采用Biacore技術(shù)進行動力學(xué)篩選時，同時還可以基于捕獲量的高低對抗體濃度進行定量，將濃度定量與篩選實驗合二為一，大大簡化了篩選流程。例如，羅氏（Roche）就采用了Biacore 技術(shù)進行抗體篩選，在24 h 內(nèi)完成了近400 個抗體的檢測，并篩選出了慢解離的候選抗體，進行進一步開發(fā)。

藥物結(jié)合活性綜合表征

在抗體體外生物活性檢測項目中，抗體與抗原、Fcγ 受體、FcRn 以及C1q 的親和檢測均需采用Biacore 技術(shù)進行申報。目前美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準上市的70 多種抗體藥物中有近80%采用了Biacore 技術(shù)完成研發(fā)和申報。例如，禮來的Taltz在2016 年獲得FDA 批準用于治療銀屑病。Taltz 對IL-17A 具有較高的親和力和特異性，可以抑制IL-17A 與IL-17 受體的結(jié)合。在申報材料中，Biacore 技術(shù)用于檢測Taltz 與靶點IL-17A 的親和力（圖1）。

治療性抗體的功效不僅取決于Fab 片段結(jié)合抗原的活性，還取決于其Fc 片段與Fcγ 受體的相互作用，F(xiàn)cγ 受體的親和力能夠作為藥物功效及半衰期的預(yù)測 指 標。2013 年，Roche 針 對CD20 靶點的單抗Gazyva 獲批上市，用于慢性淋巴性白血病的治療。在申報材料中，Biacore 技術(shù)用于Fcγ 受體結(jié)合活性的測定，結(jié)果顯示Gazyva 比美羅華有更好的FcγRIII 結(jié)合能力（圖2）。

抗體與FcRn 的親和強弱程度可以預(yù)測抗體的半衰期。Celltrion 公 司 的Inflectra 是Remicade 的生物仿制藥。在申報材料中，Biacore 技術(shù)用于證明Inflectra 和Remicade 與FcRn 結(jié)合的一致性（圖3）。

C1q 是補體激活途徑中的啟動蛋白，C1q 的常規(guī)檢測方法為ELISA，但由于抗體和C1q 的結(jié)合較弱，采用ELISA 法檢測可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此很多企業(yè)選擇采用Biacore 技術(shù)檢測抗體和C1q 的結(jié)合，如羅氏的抗體藥Ocrevus。

圖2 Biacore 技術(shù)檢測Gazyva 和Rituximab 與Fcγ 受體的親和力數(shù)據(jù)

一致性評價

2016 年起，國務(wù)院和國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）發(fā)布了多個一致性評價的指導(dǎo)文件，對通過一致性評價的品種給予優(yōu)先支持、醫(yī)保支付等優(yōu)待。一致性評價中關(guān)鍵一環(huán)是說明藥物的生物活性和原研藥的相似性。在FDA 生物類似藥指南中，Biacore 技術(shù)是結(jié)合測定的首推方法。眾多企業(yè)在一致性評價中紛紛采用Biacore 技術(shù)進行了申報上市，如Zarxio、Inflectra 以及Benepali 等。Biacore 獨創(chuàng)性地開發(fā)了指紋圖譜比對功能，利用其可以直接進行傳感圖細節(jié)比對并作出相似性打分，避免了由于擬合模型選擇等操作帶來的分析誤差，使結(jié)果更加直觀和準確（圖4）。

圖3 Biacore 技術(shù)檢測Inflectra 和Remicade 與FcRn的親和結(jié)果圖

Sandoz 公 司 的GP2013 是 美羅華的生物類似藥。在GP2013 的申報材料中，Biacore 技術(shù)被用于Fcγ 受體的親和力測定，用來說明GP2013 與原研藥的高度相似性（圖5）。

圖4 Biacore 平臺獨創(chuàng)性指紋圖譜比對技術(shù)

生物活性質(zhì)量控制

抗體藥物由于分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生物活性敏感，其工藝中每個環(huán)節(jié)的變化都可能導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量出現(xiàn)差異。因此企業(yè)應(yīng)對抗體藥物工藝流程中的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（特別是生物活性）進行實時監(jiān)測、控制和放行。基于Biacore 平臺可以建立全面的質(zhì)控標準，完成結(jié)合活性、活性濃度、翻譯后修飾和雜質(zhì)含量等的質(zhì)量控制。Biacore 平臺可以實時監(jiān)控各工藝流程組分中抗體的生物活性，如細胞培養(yǎng)、過濾、澄清等；活性有問題的抗體會出現(xiàn)解離加快、結(jié)合信號降低的現(xiàn)象，以幫助企業(yè)快速發(fā)現(xiàn)工藝中的問題。

Biacore 技術(shù)還可以用于最終產(chǎn)品的批次放行，例如金賽藥業(yè)基于Biacore 技術(shù)的生長激素蛋白批次放行標準獲得了中國食品藥品檢定研究院審批通過（圖6）。

蛋白總濃度并不能反映藥物的有效濃度，活性濃度才是影響藥效的關(guān)鍵指標。Biacore 活性濃度定量方法精度高、線性好，得到了眾多用戶的青睞。例如，諾華的奧馬珠單抗采用了Biacore 技術(shù)作為其工藝濃度控制的手段（圖7）。

翻譯后修飾對于維持抗體的正常結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，是質(zhì)量控制中的關(guān)鍵一環(huán)。利用Biacore 技術(shù)可以比較不同翻譯后修飾前后對抗體生物活性和穩(wěn)定性的影響，如糖基化、脫酰胺化等。

圖5 Biacore 技術(shù)檢測GP2013 和美羅華與Fcγ 受體的結(jié)合相似性

圖6 Biacore 技術(shù)在藥物批次放行中的應(yīng)用

圖7 利用Biacore 技術(shù)測定奧馬珠單抗的活性濃度

小結(jié)

Biacore 分子互作技術(shù)除了在以上抗體篩選、生物活性、一致性評價和質(zhì)量控制中的應(yīng)用外，在表位分析、抗體改造、免疫原性等環(huán)節(jié)也發(fā)揮著巨大作用。Biacore 技術(shù)符合GxP 和21 CFR Part 11 法規(guī)的要求，其準確穩(wěn)定的數(shù)據(jù)質(zhì)量已經(jīng)得到了藥企和監(jiān)管機構(gòu)的廣泛應(yīng)用和認可，能夠為加快抗體藥物上市保駕護航。