白腐真菌對(duì)甲基藍(lán)的脫色

宋朝霞，付 佳，王 艷，黃 鋒

(河南工程學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州 451191)

三苯甲烷類染料是目前常用的三大類染料之一，具有致癌、致畸、致突變的缺點(diǎn)[1]。該類染料具有特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在自然界中很難被降解，給人類健康和自然生態(tài)平衡造成了巨大的壓力。自然界中存在具有降解染料能力的微生物，如細(xì)菌、白腐真菌、放線菌和藻類等，尤其是白腐真菌具有底物廣泛性、降解效率高、能耗低、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[2]，在染料廢水的處理上具有廣闊的應(yīng)用前景。在篩選得到白腐真菌的基礎(chǔ)上，本研究以三苯甲烷類染料甲基藍(lán)為處理對(duì)象，考察白腐真菌在不同溫度、pH值、染料濃度與葡萄糖濃度等條件下對(duì)甲基藍(lán)脫色率的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1菌源

菌種樣品取自河南工程學(xué)院校園里的自然朽木，經(jīng)分離純化后得到。

1.1.2培養(yǎng)基

愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，愈創(chuàng)木酚25 mL/L，瓊脂15 g/L，pH值為7。

PDA液體培養(yǎng)基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，自然pH值。PDA固體培養(yǎng)基另加2%的瓊脂粉。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌株的分離、純化

將腐朽木段經(jīng) 75%酒精表面消毒后，取一定量朽木樣品置于滅菌生理鹽水中，搖床振蕩30 min，對(duì)懸浮液進(jìn)行梯度稀釋。取稀釋液涂布于愈創(chuàng)木酚初篩培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)3 d。白腐真菌能夠在愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基上產(chǎn)生粉紅色透明圈，選取產(chǎn)生粉紅色透明圈的菌株繼續(xù)劃線分離直至培養(yǎng)出純菌株。將純化的菌絲轉(zhuǎn)移至PDA 斜面，于4 ℃冰箱保存。

1.2.2菌株形態(tài)學(xué)鑒定

參照魏景超的《真菌鑒定手冊(cè)》[3]對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)特征鑒定。將菌種接種至PDA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)，觀察菌株在整個(gè)生長(zhǎng)過程中的變化，包括菌落形態(tài)、顏色、表面狀況、邊緣是否整齊、生長(zhǎng)速度、干燥情況、正反面差異等。

用接種環(huán)挑取少許菌絲，浸潤(rùn)在含有純凈水的載玻片上，經(jīng)烘烤定型后使用亞甲基藍(lán)染液染色4 min，蓋上蓋玻片，用蒸餾水沖洗掉染液，待干后在顯微鏡下觀察。

1.2.3菌絲體的制備

將活化的菌絲體接種到PDA液體培養(yǎng)基中，控制搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min，在30 ℃下持續(xù)通風(fēng)培養(yǎng)3 d左右，直至PDA液體培養(yǎng)基中長(zhǎng)出均勻的菌球。

1.2.4甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制質(zhì)量濃度分別為10 mg/L、30 mg/L、50 mg/L、70 mg/L和90 mg/L的染料標(biāo)準(zhǔn)液，使用紫外可見分光光度計(jì)在530 nm處測(cè)定該染料標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，以濃度為x軸、吸光度為y軸，繪制染料標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5脫色實(shí)驗(yàn)流程

向培養(yǎng)好白腐真菌發(fā)酵液的錐形瓶中加入一定量的無菌模擬染料廢水后置于搖床中進(jìn)行脫色實(shí)驗(yàn)。

1.2.6染料脫色率的計(jì)算

染料脫色率計(jì)算公式為

(1)

式中：t為脫色率；A為脫色前染料的初始吸光度；Ai為脫色后染料的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株選育

經(jīng)過分離純化得到一株在愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生明顯粉紅色透明圈的真菌，該菌菌落呈白色，圓形，表面呈絨毛狀，干燥，邊緣整齊，菌落不透明，菌落特征如圖1所示。對(duì)該菌株進(jìn)行染色鏡檢，菌株有發(fā)達(dá)的菌絲體，有多核菌絲，有隔膜、鎖狀聯(lián)合，符合白腐真菌鏡檢特征，編號(hào)SH02，如圖2所示。

圖1 菌株SH02菌落Fig.1 Colony of the strain SH02

圖2 菌株SH02鏡檢結(jié)果Fig.2 Microscopic examination of the strain SH02

2.2 白腐真菌脫色實(shí)驗(yàn)

2.2.1染料標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。由圖3可知，甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度與甲基藍(lán)質(zhì)量濃度為0～90 mg/L時(shí)呈線性相關(guān)，線性回歸方程為y= 0.007 3x-0.012 8，R2= 0.998 9。在脫色實(shí)驗(yàn)中可采用該線性回歸方程計(jì)算溶液中甲基藍(lán)的濃度。

2.2.2染料初始濃度對(duì)脫色率的影響

在pH值為7、恒溫30 ℃的條件下，考察白腐真菌在不同染料濃度下對(duì)甲基藍(lán)脫色效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖3 甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of methyl blue

圖4 甲基藍(lán)初始濃度對(duì)菌株SH02脫色率的影響Fig.4 Effect of methyl blue concentration on the decolorization rate by SH02

由圖4可知，甲基藍(lán)初始質(zhì)量濃度為10～50 mg/L，隨著濃度的增大白腐真菌脫色率不斷增大，當(dāng)甲基藍(lán)初始質(zhì)量濃度達(dá)到50 mg /L時(shí)，脫色率為60.3%，但染料初始濃度繼續(xù)增大，脫色率急劇下降，當(dāng)染料初始質(zhì)量濃度達(dá)到70 mg/L時(shí)，脫色率僅為29.9%。分析原因可能是因?yàn)槿玖蠞舛炔粩嗵岣邔?duì)菌絲體的毒性逐漸增大，導(dǎo)致白腐真菌菌絲體的生長(zhǎng)或酶的分泌受到抑制，最終影響菌絲體對(duì)染料的脫色效果。

2.2.3初始pH值對(duì)脫色率的影響

在甲基藍(lán)初始質(zhì)量濃度為 50 mg/L、恒溫30 ℃的條件下，在pH 值為2～8時(shí)考察白腐真菌脫色效果，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，在不同pH值緩沖體系中，白腐真菌對(duì)甲基藍(lán)染料的脫色效果有明顯的區(qū)別。其中，在pH值為5～7的條件下，體系中甲基藍(lán)的脫色率相對(duì)較高，尤其是在pH值為6時(shí)，脫色效果最好，脫色率達(dá)到69.7%。當(dāng)體系pH值小于5時(shí)，脫色率隨pH值的降低而顯著降低。分析原因可能是由于pH 值的變化直接影響真菌表面所帶電荷的電性及甲基藍(lán)的電離狀態(tài)，進(jìn)而影響微生物與染料分子的結(jié)合能力，最終導(dǎo)致脫色效果的差異，也可能是由于pH 值的變化對(duì)白腐真菌產(chǎn)生特定的染料降解酶有影響[4]。

2.2.4溫度對(duì)脫色率的影響

以甲基藍(lán)初始質(zhì)量濃度為 50 mg/L、pH值為6的模擬染料廢水為研究對(duì)象，考察白腐真菌在不同溫度下對(duì)甲基藍(lán)的脫色效果，結(jié)果如圖6所示。

圖5 初始pH值對(duì)菌株SH02脫色率的影響Fig.5 Effect of initial pH on the decolorization rate by SH02

圖6 不同溫度對(duì)菌株SH02脫色率的影響Fig.6 Effect of temperature on the decolorization rate by SH02

由圖6可知，當(dāng)脫色溫度為30 ℃時(shí)，白腐真菌對(duì)甲基藍(lán)的脫色效果最好，脫色率達(dá)到66.2%，一旦溫度低于30 ℃，脫色效果會(huì)變差。從圖6中還可以看出，在25～30 ℃條件下脫色率明顯高于15～20 ℃時(shí)。溫度對(duì)脫色效果的影響主要是因?yàn)闇囟鹊淖兓苯佑绊懭玖辖到饷傅幕钚院头€(wěn)定性，酶在最適溫度范圍內(nèi)活性最大，酶促反應(yīng)速度最快。溫度過低，酶不能充分發(fā)揮其活性，而溫度過高，酶容易變性失活，都會(huì)導(dǎo)致酶的催化效率降低，最終影響脫色率。已有研究表明，白腐真菌的最適溫度為25～30 ℃，溫度過低，白腐真菌菌絲體生長(zhǎng)緩慢，溫度過高則白腐真菌菌絲體易衰亡[5]。

2.2.5葡萄糖濃度對(duì)脫色率的影響

張慶云等[6]研究發(fā)現(xiàn)糖類(果糖) 作為共代謝基質(zhì)對(duì)混合菌群脫色降解活性黑5有一定的促進(jìn)作用。程永前等[7]和林錦美等[4]也有研究表明，投加一定量的外加碳源-葡萄糖能提高白腐真菌的脫色能力。因此，在恒溫30 ℃、甲基藍(lán)初始質(zhì)量濃度 50 mg/L、pH值為6的條件下，考察外加碳源-葡萄糖對(duì)甲基藍(lán)脫色效果的影響，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，當(dāng)體系中不添加葡萄糖時(shí)脫色率為66.5%，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為0.2 g/L時(shí)脫色率最高，達(dá)到78.9%，之后隨著葡萄糖濃度的進(jìn)一步升高，脫色效果變差。分析原因可能是在碳源相對(duì)缺乏的情況下，菌株會(huì)分泌相應(yīng)的酶類對(duì)染料進(jìn)行降解，使其轉(zhuǎn)化成菌體可以利用的物質(zhì)以維持細(xì)胞生長(zhǎng)，而在碳源相對(duì)充足的情況下，菌株優(yōu)先利用葡萄糖進(jìn)行生長(zhǎng)，染料降解酶分泌較少，不利于脫色。

2.2.6脫色機(jī)制推測(cè)

甲基藍(lán)作為一種常見的三苯甲烷類染料，具體結(jié)構(gòu)如圖8所示。其中，醌型苯環(huán)形成大的共軛體系是主要的發(fā)色團(tuán)，氨基作為助色團(tuán)，兩者共同反映染料顏色[8]。在脫色過程中，白腐菌SH02菌球始終呈現(xiàn)乳白色，說明微生物是依靠分泌到胞外的木質(zhì)素氧化酶系作用于發(fā)色團(tuán)或助色團(tuán)對(duì)染料進(jìn)行脫色的。甘莉等[9]在利用菌株B.Cepacia C09G 對(duì)孔雀綠進(jìn)行脫色的實(shí)驗(yàn)中，也通過光譜分析說明孔雀綠的—NH2、—NH/CO等官能團(tuán)被破壞。

圖7 不同葡萄糖濃度對(duì)菌株SH02脫色率的影響Fig.7 Effect of glucose concentration on the decolorization rate by SH02

圖8 甲基藍(lán)分子結(jié)構(gòu) Fig.8 Structure of the methyl blue

3 結(jié)語(yǔ)

從河南工程學(xué)院校園朽木上分離到一株白腐真菌，利用其對(duì)甲基藍(lán)進(jìn)行脫色，通過單因素實(shí)驗(yàn)，最終確定在甲基藍(lán)質(zhì)量濃度為50 mg/L、pH值為6、葡萄糖添加量為 0.2 g/L時(shí)的脫色體系，白腐真菌在30 ℃時(shí)對(duì)甲基藍(lán)的脫色效果最好，脫色率達(dá)到78.9%。