梔子果提取物對(duì)酸奶發(fā)酵特性和功能特性的影響

朱廣成 - 覃 思 聶乾忠 -

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

梔子(GardeniajasminoidesJ. Ellis)別名山梔子、黃枝子和白蟾等，屬茜草科常綠灌木，廣泛分布于中國(guó)中南部，被列入中國(guó)首批公布“按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)”清單之中[1]。近年來(lái)系列研究[2-3]表明，梔子各個(gè)部位均有藥食兩用價(jià)值，其果、花、葉和根等部位中均含有不同功能活性成分，且差異較大。梔子果是梔子應(yīng)用最廣泛且活性成分含量最多的部位，富含梔子苷類(lèi)、三萜類(lèi)和黃酮等生物活性成分，特別是藏紅花酸(0.01%～0.70%)和藏紅花素(0.045%～0.600%)，有研究[4-5]表明當(dāng)成分藏紅花素達(dá)到一定量(10～50 mg/kg)時(shí)，具有保肝、降血糖、抗菌消炎、抗腫瘤等功效。目前，梔子果以采摘后鮮售或干燥后銷(xiāo)售為主，而以梔子果為原料開(kāi)展的功能特性研究逐漸增加，梔子果活性成分的提取及其相關(guān)功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)剛起步，開(kāi)始應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化工等領(lǐng)域[6-7]。

已有研究[8]表明，通過(guò)添加水果、蔬菜或可食性藥用植物等成分可以增強(qiáng)酸奶的生物活性。此外，添加百香果、香蕉或蘋(píng)果皮粉可改善酸奶的流變性和以及促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)[9-10]。目前，尚未見(jiàn)將梔子果提取物添加到乳制品中研究其對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)影響的報(bào)道。

試驗(yàn)擬制備一種添加梔子果提取物的功能性酸奶，研究梔子果提取物對(duì)酸奶的理化性質(zhì)、菌株生長(zhǎng)特性、生物活性(如抗氧化劑、抗菌活性和模擬胃腸液耐受性)以及揮發(fā)性成分變化情況的影響，并進(jìn)行功能性評(píng)價(jià)，旨在為新型功能性酸奶的開(kāi)發(fā)及梔子果的綜合利用提供物質(zhì)基礎(chǔ)和應(yīng)用思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

直投式發(fā)酵劑(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)：石家莊聚合臻食品有限公司；

干燥梔子果實(shí)：南陽(yáng)泰瑞生物科技股份有限公司；

脫脂奶粉：湖南太子奶集團(tuán)生物科技有限責(zé)任公司；

李斯特菌(ATCC 19115)、大腸桿菌(CGMCC 9181)：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室；

MRS肉湯培養(yǎng)基、瓊脂、MC瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

胃蛋白酶：3 000～3 500 U/g，北京索萊寶科技有限公司；

胰蛋白酶：≥50 000 U/g，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱：GZ-400-S型，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；

雙人單面垂直凈化工作臺(tái)：SW-CJ-2D型，蘇州凈化有限公司；

全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋：BKQ-B50II型，山東博科科學(xué)儀器有限公司；

超級(jí)恒溫水浴鍋：HH-601型，常州市萬(wàn)豐儀器制造有限公司；

臺(tái)式高速離心機(jī)：TG16-WS型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；

氣質(zhì)聯(lián)用儀：GCMS-QP2010型，島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司；

高效液相色譜：LC-10AT型，島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司；

數(shù)顯黏度計(jì)：NDJ-8S型，上海平軒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及內(nèi)容

1.3.1 梔子果提取物(GE)的制備 取200 g梔子干果實(shí)粉碎過(guò)0.6 mm篩子，取5 g粉末溶于250 mL蒸餾水，使用玻璃棒攪拌10 min，冷凝回旋2 h，收集液體并過(guò)濾。濾液3 000 r/min離心10 min，取上清液，重復(fù)2次；將上清液進(jìn)行抽濾并收集濾液，濾液于70 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)30 min，得黏稠液，裝到玻璃平皿中，-20 ℃冰箱預(yù)凍過(guò)夜，然后冷凍干燥24 h，研磨成粉末狀，得干粉，備用[11-12]。

1.3.2 梔子果提取物酸奶的制備工藝路線(xiàn)

脫脂復(fù)原乳(脫脂奶粉為12 g/100 mL)→加白砂糖(8%)和梔子果提取物(0.0%，0.1%，0.5%，1.0%)→60 ℃均質(zhì)→殺菌(95 ℃，15 min)→冷卻至(40±2) ℃→加0.3%直投式發(fā)酵劑→42 ℃發(fā)酵→冷藏和后熟(4 ℃，12 h)[13]

分別取發(fā)酵0，4，8，12 h和后熟12 h的樣品測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 藏紅花酸和藏紅花素Ⅰ的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[14]。

1.4.2 酸奶中活菌數(shù)和產(chǎn)酸能力的測(cè)定

(1) 活菌數(shù)：按GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》執(zhí)行。

(2) 產(chǎn)酸能力：用pH值和滴定酸度表示酸奶樣品中菌株的產(chǎn)酸能力，其中pH值直接用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定，酸度測(cè)定按GB/T 5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測(cè)定》執(zhí)行。

1.4.3 酸奶生物活性的測(cè)定

(1) 抑菌活性：參照文獻(xiàn)[15]。

(2) 模擬胃腸液耐受性：取0.5 mL樣品分別加入含4.5 mL無(wú)菌的模擬胃液和模擬腸液(模擬胃液和腸液參照《中國(guó)藥典》配制[16])中，37 ℃孵育3 h，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定孵育前后的活菌數(shù)并按式(1)計(jì)算存活率。

(1)

式中：

c——菌株存活率，%；

m1——模擬胃液和腸液處理3 h的酸奶活菌數(shù)，lg (CFU/mL)；

m2——未處理酸奶活菌數(shù)，lg (CFU/mL)。

(3) 抗氧化活性：取5 mL不同發(fā)酵階段的酸奶樣品于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，收集上清液，測(cè)定其抗氧化活性[17]。取1 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液與1 mL上清液充分混勻，避光室溫反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定吸光值，記為As。以相同體積無(wú)水乙醇代替DPPH溶液測(cè)量吸光值，記為Ab；以相同體積蒸餾水替換樣品測(cè)量吸光值，記為Ac。按式(2)計(jì)算DPPH清除率。

(2)

式中：

D——DPPH自由基清除率，%；

As——樣品組吸光值；

Ac——對(duì)照組吸光值；

Ab——空白組吸光值。

1.4.4 酸奶黏度和持水力的測(cè)定

(1) 持水率：根據(jù)文獻(xiàn)[18]，修改如下；取5 g樣品于10 mL離心管中，以4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，稱(chēng)取剩余質(zhì)量。按式(3)計(jì)算持水率。

(3)

式中：

B——持水率，%；

m1——離心管質(zhì)量，g；

m2——酸奶和離心管質(zhì)量，g；

m3——離心管和剩余沉淀質(zhì)量，g。

(2) 黏度：在室溫下，用NDJ-8S數(shù)顯黏度計(jì)(3號(hào)轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速12 r/min)測(cè)定[19]。

1.4.5 揮發(fā)性風(fēng)味成分的測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[20]進(jìn)行樣品的萃??；GC和MS的條件根據(jù)文獻(xiàn)[21]進(jìn)行樣品的測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理及分析，數(shù)據(jù)采用(x±s)表示，檢驗(yàn)組間比較進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，P≤0.05表示為差異顯著；并以O(shè)rigin Pro 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 梔子果提取物(GE)中藏紅花酸和藏紅花素的測(cè)定

采用1.3.1所制備的GE呈橘紅色粉末，無(wú)異味，微苦；通過(guò)HPLC測(cè)定的藏紅花酸和藏紅花素的含量分別為(183.000±5.800)，(108.000±3.500) mg/kg；試驗(yàn)的GE中藏紅花酸和藏紅花素的含量相對(duì)豐富，表明將GE加入到酸奶中能賦予酸奶藏紅花酸和藏紅花素等活性成分所具備的有益功能(包括保肝、降血糖和抗菌消炎)。

2.2 發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)的變化

由圖1可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，未添加GE酸奶中保加利亞乳桿菌數(shù)目均低于添加GE組。發(fā)酵8 h時(shí)，保加利亞乳桿菌的活菌數(shù)為7.08～7.84 lg (CFU/g)，且此時(shí)活菌數(shù)變化開(kāi)始趨于平緩，已達(dá)到菌株生長(zhǎng)穩(wěn)定期；然而，后熟12 h后保加利亞乳桿菌的活菌數(shù)均有所下降，可能是4 ℃不適合菌株的生長(zhǎng)。盡管添加0.5%的GE對(duì)保加利亞乳桿菌的活菌數(shù)沒(méi)有顯著影響(P>0.05)，但是0.5%和1.0%的GE顯著提高了保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)(P≤0.05)。這一結(jié)果表明GE能刺激酸奶中保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)。由圖2可知， GE的添加對(duì)嗜熱鏈球菌活菌數(shù)并無(wú)顯著影響(P>0.05)，與Espírito等[22-23]在酸奶中加入百香果皮粉末或菠蘿皮廢粉對(duì)嗜熱鏈球菌計(jì)數(shù)無(wú)顯著影響的結(jié)果一致。此外，后熟12 h后未添加GE的酸奶中嗜熱鏈球菌數(shù)量顯著(P≤0.05)下降，表明GE的添加能維持菌株在冷藏期間的穩(wěn)定性?？傮w而言，梔子提取物對(duì)酸奶活菌數(shù)的有益作用取決于菌株和補(bǔ)充物。

圖1 酸奶發(fā)酵過(guò)程中乳酸桿菌數(shù)量的變化

Figure 1 Changes in the number of lactobacillus during yogurt fermentation

圖2 酸奶發(fā)酵過(guò)程中嗜熱鏈球菌數(shù)量的變化

Figure 2 Changes in the number ofS.thermophilusbacteria during yogurt fermentation

2.3 酸奶發(fā)酵過(guò)程中酸度的變化

由圖3可知，發(fā)酵初期由于菌株需要適應(yīng)新環(huán)境，產(chǎn)酸較為緩慢，此時(shí)各組間pH值的下降并無(wú)顯著差異(P>0.05)。然而，隨著發(fā)酵時(shí)間的推移，添加GE能加快酸奶體系pH值的下降，尤其加入0.5%的GE時(shí)pH值降低較快，可能是GE中豐富的藏紅花酸等活性成分能增強(qiáng)酸奶中乳酸菌的產(chǎn)酸能力。此外，由圖4可知，酸奶的滴定酸度呈先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，與圖3中pH值的變化相互對(duì)應(yīng)，進(jìn)一步表明GE的添加有利于酸奶中菌株的產(chǎn)酸；相比于其他GE添加量，添加0.5%的GE對(duì)菌株的產(chǎn)酸能力有較好的促進(jìn)作用。

圖3 酸奶發(fā)酵過(guò)程中pH的變化Figure 3 Changes in pH during yogurt fermentation

圖4 酸奶發(fā)酵過(guò)程中滴定酸的變化

Figure 4 Changes in titrated acid during yogurt fermentation

2.4 梔子果提取液對(duì)酸奶黏度和持水力的影響

由圖5可知，發(fā)酵4 h后酸奶離心沉淀率均高于50%，表明發(fā)酵后酸奶穩(wěn)定性均下降，并且各組酸奶離心沉淀率無(wú)顯著差異(P>0.5)，而發(fā)酵10 h后未添加GE的酸奶離心沉淀率顯著(P≤0.5)低于已添加GE的酸奶。此外，由圖6可知，發(fā)酵開(kāi)始時(shí)，不同組別的黏度變化較??；但從4 h開(kāi)始，酸奶乳的黏度迅速升高，發(fā)酵結(jié)束后黏度最終達(dá)到2 090～2 792 mPa·s；隨著GE添加量的增加，酸奶在發(fā)酵過(guò)程中的黏度逐漸降低，并且發(fā)酵結(jié)束時(shí)的黏度有顯著減小的趨勢(shì)。酸奶的穩(wěn)定性和黏度會(huì)隨連續(xù)液體和凝膠碎片的體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，GE中部分活性成分(如藏紅花酸、藏紅花素等)可能會(huì)影響牛乳中這些物質(zhì)的體積分?jǐn)?shù)，從而導(dǎo)致添加GE的酸奶體系的穩(wěn)定性相對(duì)較低[24]。

圖5 酸奶發(fā)酵過(guò)程中離心沉淀率的變化

Figure 5 Changes of centrifugal sedimentation rate during yogurt fermentation

圖6 酸奶發(fā)酵過(guò)程中黏度的變化Figure 6 Changes in viscosity during yogurt fermentation

2.5 梔子果提取液對(duì)酸奶揮發(fā)性風(fēng)味成分的影響

由表1可知，未添加GE酸奶中共檢出17種揮發(fā)性風(fēng)味成分，添加0.0%，0.1%，0.5%，1.0% GE的酸奶中分別檢出揮發(fā)性風(fēng)味成分17，22，22，17種，并且不同的梔子果提取液酸奶中揮發(fā)性成分的種類(lèi)和含量存在顯著差異(P≤0.05)。進(jìn)一步結(jié)合表2可知， GE添加量對(duì)酸奶揮發(fā)性成分影響顯著(P≤0.05)，影響酸奶風(fēng)味的酮類(lèi)和醛類(lèi)化合物相對(duì)含量隨GE添加量的增加而先上升后減小，當(dāng)添加量為0.5%時(shí)有峰值，表明GE添加量過(guò)高反而影響酸奶的特征風(fēng)味，可能是隨著GE添加量的增加GE中固有風(fēng)味物質(zhì)覆蓋酸奶中的特有風(fēng)味。其中酮類(lèi)物質(zhì)貢獻(xiàn)最大，酮類(lèi)化合物是酸奶中的重要風(fēng)味物質(zhì)，多為不飽和脂肪酸的氧化、熱降解和氨基酸降解產(chǎn)物[25]；當(dāng)添加量為0.5%時(shí)，酸奶中酮類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量最高為52.794%，主要為1-(2-氯苯基)蒽-9,10-二酮、5-異丙基-六-5-烯-2-酮和4,5-辛二酮；雖然添加GE的酸奶中均未檢測(cè)出酸奶中特征風(fēng)味物質(zhì)2,3-丁二酮(雙乙酰)，然而4,5-辛二酮也能呈現(xiàn)出2,3-丁二酮的奶油甜香味。所以，4,5-辛二酮對(duì)GE酸奶風(fēng)味的產(chǎn)生具有積極作用[26]。此外，僅0.5%和1.0% GE酸奶中檢測(cè)出醛類(lèi)物質(zhì)，表明GE有利于酸奶中醛類(lèi)物質(zhì)的形成，醛類(lèi)物質(zhì)是在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的特征風(fēng)味成分，在發(fā)酵乳制品的滋味與香味的風(fēng)味物質(zhì)中起關(guān)鍵作用[26]。綜上，GE在酸奶特征風(fēng)味的形成上具有積極作用，并且在0.5%的添加量時(shí)較為適宜。

2.6 酸奶的生物活性

不同GE添加量酸奶的抗菌活性、模擬胃腸液的耐受性和抗氧化等生物活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)于抗菌活性，所有組別的酸奶對(duì)大腸桿菌和李斯特菌均表現(xiàn)出抑菌活性，并且對(duì)大腸桿菌的抑菌活性存在GE的濃度依賴(lài)性，當(dāng)添加量為0.5%和1.0%時(shí)抑菌活性顯著高于未添加GE的酸奶；而酸奶對(duì)李斯特菌的抑制活性差異不顯著(P>0.05)，可能是GE的加入僅對(duì)革蘭氏陰性菌發(fā)揮作用，而酸奶中主要微生物為革蘭氏陽(yáng)性菌，說(shuō)明在一定程度上提升了酸奶的安全品質(zhì)。

表1 GE酸奶揮發(fā)性成分種類(lèi)Table 1 Analysis of volatile components of GE yogurt

表2 GE酸奶揮發(fā)性成分Table 2 Volatile components of GE yogurt

續(xù)表2

種類(lèi)名稱(chēng) 風(fēng)味成分相對(duì)含量/%0.0%0.1%0.5%1.0%保留時(shí)間/min0.0%0.1%0.5%1.0%酮類(lèi)1-(2-氯苯基)蒽-9,10-二酮26.52630.69227.0990.00015.62815.63715.628乙烯酮0.0008.0300.0000.00027.6704-辛酮0.0000.0000.0008.97431.6955-異丙基-六-5-烯-2-酮0.0000.00013.9410.00032.1654,5-辛二酮0.0000.00011.7090.00039.1902,3-丁二酮10.4990.0000.0000.00047.6721-(3-甲基呋喃-2-基)丙-2-酮0.00012.2290.0000.00059.959其他3-苯基-2H-色烯0.0007.6330.0000.0007.0062-苯基吲哚嗪0.0000.4750.0000.00013.757異丁酸酐0.0000.1320.0000.00016.610三氟氧化胺4.6005.7580.2300.00017.00516.92216.947N-甲基酪胺22.9170.0000.0000.00019.789乙酸銫0.0000.7660.0000.00019.9962-叔丁基-2-甲基-1,3-二噻吩0.4130.0000.0000.00020.029(4E)-hept-4-en-2-one0.4950.0000.0000.00020.76121-去乙?；S索6.3530.0000.0000.00023.355琥珀酰胺0.0000.0000.0001.92323.4203,3,6,6-四甲基-1,2,4,5-四氧六環(huán)0.2890.3171.0580.00028.81620.74418.4182,4,4-三甲基-1-戊烯7.3020.0000.0000.00029.562二叔丁基過(guò)氧化物0.0000.2380.0000.00030.618β-乳糖0.0000.0000.0003.20535.2502-(1-苯基乙基)-1,3-二氧戊環(huán)0.0000.0000.1380.00047.5456,7-二甲氧基-3-苯基鉻-4-0.0000.0001.1730.00059.955糠偶酰0.0000.7660.0000.00060.0112'-甲氧基鳥(niǎo)苷0.0000.0000.0001.28260.1651,3-二氧戊環(huán)0.1440.0000.0000.00060.2452-異丙氧基-5-(4-硝基-苯基)-[1,3,4]惡二唑0.0000.0004.6930.00060.9352-(1-苯基乙基)-1,3-二氧戊環(huán)0.6190.0000.0000.00060.645S-(2,2-二甲基丙基)2,2-二甲基丙烷硫磺酸鹽0.0000.0005.8890.00061.0163-氟丙-2-腈0.0002.7474.0720.00059.43061.465

此外，由于乳酸菌在胃腸環(huán)境中的生存能力是菌株在人體能發(fā)揮益生作用的重要因素之一。由表3可知，添加GE至酸奶中能提高酸奶中菌株的存活能力，當(dāng)GE添加量為0.5%和1.0%時(shí)，菌株存活率已接近100%，表明梔子果提取物對(duì)乳酸菌順利進(jìn)入胃腸道具有保護(hù)作用。酸奶的抗氧化活性隨GE添加量的增加而增強(qiáng)，可能與GE中活性成分(藏紅花素、西紅花苷和梔子皂甙等)有關(guān)[27-29]。

表3 酸奶生物活性測(cè)定結(jié)果? Table 3 Results of yogurt bioactivity measurement

? 同列小寫(xiě)字母不同表示差異顯著(P≤0.05)。

3 結(jié)論

以添加了梔子果提取物的酸奶為研究對(duì)象，研究了不同用量的提取物對(duì)酸奶發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)、酸度、離心沉淀率和黏度的影響，評(píng)價(jià)了發(fā)酵完成后梔子果提取物酸奶的抗菌活性、模擬胃腸液耐受性和抗氧化活性，并測(cè)定了梔子果提取物添加量對(duì)酸奶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化。結(jié)果表明，梔子果提取物能顯著促進(jìn)酸奶中保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)并增強(qiáng)菌株在貯藏過(guò)程中的穩(wěn)定性，一定程度上抑制了酸奶的后酸化，能顯著增強(qiáng)酸奶對(duì)大腸桿菌的抑菌活性、對(duì)模擬胃腸液耐受性以及抗氧化活性，能促進(jìn)酸奶中特征風(fēng)味物質(zhì)醛類(lèi)和酮類(lèi)的形成并賦予產(chǎn)品更好的蛋黃色澤。同時(shí)，這種蛋黃色澤可能與梔子果提取物中富含的藏紅花酸和藏紅花素有關(guān)，其含量分別為(183.000±5.800)，(108.000±3.500) mg/kg。因此，適當(dāng)加入梔子果提取物不僅能顯著改善酸奶的品質(zhì)，還可以增強(qiáng)酸奶的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。總之梔子果提取物中可能存在某些活性成分(如藏紅花酸、藏紅花素)能顯著改善酸奶的發(fā)酵特性，但具體活性成分的功能作用及其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。