4種富鋅乳酸菌抗氧化活性及體外消化穩(wěn)定性研究

鄭金熊 - 游麗君 -

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640)

鋅是人體重要的微量元素，是約300多種關(guān)鍵酶系的重要組成成分，存在于所有組織和體液中[1]。此外，鋅元素在人體內(nèi)還參與了多種生理活動，如有氧氧化[2]、細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑、自由基清除和細(xì)胞代謝[3]、DNA合成以及介導(dǎo)先天免疫細(xì)胞的正常功能[4]。無機(jī)鋅具有刺激胃腸道、吸收利用率低等缺點(diǎn)。近年來，將微生物作為微量元素載體通過膳食攝入以補(bǔ)充機(jī)體所需微量元素鋅，成為了鋅補(bǔ)充的新途徑[5]。

乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一類非致病、具安全性的微生物，其中絕大部分都是人體必不可少的且具有特殊生理活性的菌群，分布于人體腸道中[6]。乳酸菌具有整腸、抑菌[7]、體內(nèi)外抗氧化[8]和抗衰老等生理功能。此外，乳酸菌對金屬離子具有良好的吸附作用[9]，包括人體所需的多種微量元素，如鋅、鐵、銅等。

以乳酸菌為載體，對微量元素進(jìn)行富集的研究日趨熱門。乳酸菌細(xì)胞壁主要由肽聚糖、磷壁酸、多糖和蛋白質(zhì)組成，這些組分構(gòu)成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在與鋅離子結(jié)合過程中起關(guān)鍵性作用[10]。此外，乳酸菌細(xì)胞表面具有多種可以絡(luò)合鋅離子的基團(tuán)，如-COOH、-NH2、-SH和-OH等[11]。與傳統(tǒng)方式制備的鋅補(bǔ)充食品、藥物相比，富鋅乳酸菌具有制備工藝簡單、轉(zhuǎn)化成本低、安全性好以及益生性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。楊靖鵬等[12]發(fā)現(xiàn)，富鋅培養(yǎng)后發(fā)酵上清液抗氧化活性和菌體耐膽鹽活性均有所提高。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，由無機(jī)鋅富鋅培養(yǎng)的富鋅乳酸菌其鋅離子容易在胃腸道消化過程中釋放，從而刺激胃腸道甚至在體內(nèi)富集。試驗(yàn)擬對4種乳酸菌進(jìn)行富鋅培養(yǎng)，優(yōu)化其富鋅培養(yǎng)條件，并比較4種乳酸菌發(fā)酵上清液的抗氧化活性；采用模擬胃腸道消化方法分析富鋅乳酸菌消化穩(wěn)定性和生物利用率，旨在為富鋅產(chǎn)品的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣多肽鋅(COP2-Zn)：將牡蠣多肽與硫酸鋅以肽/鋅的質(zhì)量比15∶1混合，除去游離鋅離子，凍干即得COP2-Zn，實(shí)驗(yàn)室自制；

MRS培養(yǎng)基：上海晶都生物技術(shù)有限公司；

胃蛋白酶 (2 500 U/mg)、胰酶(1 500 U/mg)等：美國 Sigma 公司；

保加利亞乳桿菌 (Lactobacillusbulgaricus)、嗜酸乳桿菌 (Lactobacillusacidophilus)、發(fā)酵乳桿菌 (Lactobacillusfermentum)、干酪乳桿菌 (Lactobacilluscasei)：廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院；

冷凍高速離心機(jī)：5417R型，德國Eppendorf公司；

水平層流單人凈化工作臺：HS-840U3型，蘇州凈化設(shè)備有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ-LS-50SII型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌富鋅培養(yǎng)工藝優(yōu)化

(1) 菌種的活化與培養(yǎng)：取預(yù)凍存于甘油管中的4株乳酸菌菌株(保加利亞乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌)，并在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃厭氧培養(yǎng)36 h，挑取乳酸菌單菌落并接種至MRS液體培養(yǎng)基中，備用。

(2) 乳酸菌生長曲線及最佳加鋅時(shí)間：將生長良好的4種乳酸菌以2%接種量接種至MRS培養(yǎng)液中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以4 ℃冰箱中培養(yǎng)為空白對照，每隔2 h取出至4 ℃冰箱保藏。采用比濁法測定OD600 nm并繪制乳酸菌生長曲線[13]。

(3) 鋅濃度的篩選：以活化后的保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌為測試菌，MRS培養(yǎng)基中活化2代后，以接種量2%接種至含硫酸鋅的(鋅離子濃度0，50，100，150，200 mg/mL)MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。測定OD600 nm及培養(yǎng)基pH值。

(4) 不同富鋅乳酸菌的制備：選取牡蠣多肽鋅、硫酸鋅、葡萄糖酸鋅作為鋅源，保加利亞乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌為測試菌。按2%接種量接種乳酸菌，37 ℃培養(yǎng)10 h后，分別加入不同來源的鋅，繼續(xù)培養(yǎng)至32 h。4 ℃，6 000 r/min離心10 min，收集菌體，用PBS清洗2次，離心，得濕菌體，凍干后為乳酸菌干菌體。

1.2.2 富鋅乳酸菌發(fā)酵上清液的抗氧化活性

(1) 乳酸菌發(fā)酵上清液的制備：取經(jīng)富鋅培養(yǎng)12 h后的發(fā)酵培養(yǎng)液，用雙蒸水稀釋至109Cells/mL。10 000 r/min離心15 min，上清液過0.22 μm濾膜，得稀釋的發(fā)酵上清液。

(2) ABTS自由基清除率的測定：分別配置7 mmol/L的ABTS溶液和4.9 mmol/L的過硫酸鉀，按體積比1∶1混合，4 ℃冰箱避光儲存12～16 h得ABTS+溶液。用無水乙醇將儲備液稀釋至OD734 nm為(0.7±0.02)，即ABTS工作液。準(zhǔn)確移取0.5 mL乳酸菌培養(yǎng)基上清液，稀釋至5 mL，向2 mL工作液中加入20 μL樣品，混勻，避光靜置30 min，測定OD734 nm，以50%乙醇調(diào)零，以20 μL樣品和2 mL工作液為對照，根據(jù)文獻(xiàn)[14]，按式(1)計(jì)算ABTS自由基清除率。

(1)

式中：

R——ABTS自由基清除率，%；

As——樣品組的吸光度值；

Ac——空白組的吸光度值。

(3) DPPH自由基清除率的測定：將DPPH粉末溶解于無水乙醇，配制0.2 mmol/L的DPPH溶液。分別取1 mL乳酸菌發(fā)酵上清液及DPPH工作液于試管中，震蕩并混勻，避光靜置30 min，測定OD517 nm，以50%乙醇溶液調(diào)零，以1 mL樣品稀釋液和1 mL無水乙醇為樣品對照，以1 mL DPPH工作液和1 mL蒸餾水為空白對照，根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]， 按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率。

(2)

式中：

R——DPPH自由基清除率，%；

Ai——樣品溶液與DPPH溶液混合后測定的吸光度值；

Aj——樣品溶液與無水乙醇混合后測定的吸光度值；

Ac——樣品溶液與蒸餾水混合后測定的吸光度值。

(4) 超氧陰離子自由基清除率的測定：配制100 mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液，調(diào)節(jié)最終pH為8.2，將鄰苯三酚溶解于10 mmol/L鹽酸溶液中，使其濃度為3 mmol/L，并于25 ℃水浴20 min。移取4.5 mL Tris-HCl溶液，依次加入2 mL乳酸菌發(fā)酵上清液、3 mL蒸餾水、0.5 mL鄰苯二酚溶液，震蕩，混勻。于325 nm下每隔30 s測一次吸光度值，持續(xù)反應(yīng)4.5 min。以Tris-HCl溶液代替樣品為空白對照，計(jì)算樣品組與空白組吸光度值的平均變化率，根據(jù)文獻(xiàn)[17],按式(3)計(jì)算超氧陰離子自由基清除率。

(3)

式中：

R——超氧陰離子自由基清除率，%；

Δ空白——空白組的吸光度隨時(shí)間的變化率，min-1；

Δ樣品——樣品組的吸光度隨時(shí)間的變化率，min-1。

1.2.3 富鋅乳酸菌的體外模擬胃腸道消化穩(wěn)定性

(1) 模擬胃液配制：0.35 g胃蛋白酶溶解于100 mL 0.2%的無菌生理鹽水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH為 2.0，過0.45 μm濾膜除菌。

(2) 模擬腸液配制：0.1 g胰蛋白酶，0.9 g膽鹽溶解于無菌溶劑(1.1 g NaHCO3、0.2 g NaCl和100 mL蒸餾水，用0.5 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH為8.0),過0.45 μm濾膜除菌。

(3) 活力損失率的測定：用生理鹽水將凍干的4種富鋅乳酸菌稀釋至109Cells/mL，按10%接種量接種至pH 2.0的模擬胃液中，混勻，37 ℃下分別厭氧培養(yǎng)0，3，6 h，以2%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)24 h，測定OD600 nm。模擬胃消化3 h后，吸取1 mL消化液接種至9 mL模擬腸液中，分別于0，6，12 h取樣，以2%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)24 h，測定OD600 nm。按式(4)計(jì)算活力損失率。

(4)

式中：

R——細(xì)胞活力損失率，%；

OD0——經(jīng)消化0 h，培養(yǎng)24 h后測定的吸光度值；

ODt——經(jīng)消化th，培養(yǎng)24 h后測定的吸光度值。

1.2.4 富鋅保加利亞乳桿菌的生物利用率以及胃腸道釋放率 按1.2.1(4)的方法制備保加利亞乳桿菌干菌體，測定富鋅培養(yǎng)基中及發(fā)酵上清液的鋅含量。將凍干后的富鋅乳酸菌菌粉加入到10 mL模擬胃液中消化3 h。4 ℃，6 000 r/min離心10 min，收集菌體，用PBS清洗2次，離心，得濕菌體。測定模擬胃液及離心后胃液上清液鋅濃度。將胃消化后的濕菌體加入到10 mL模擬腸液中消化6 h，4 ℃,6 000 r/min離心10 min，收集菌體，用PBS清洗2次，離心，得腸消化后的濕菌體。測定模擬腸液及離心后腸液上清液鋅濃度。分別按式(5)～(7)計(jì)算模擬胃腸道消化胃釋放率、腸釋放率及鋅的生物利用率。

(5)

(6)

(7)

式中：

R1——胃釋放率率，%；

R2——腸釋放率率，%；

R3——生物利用率，%；

m1——富鋅培養(yǎng)基中鋅含量，mg；

m2——發(fā)酵上清液鋅含量，mg；

m3——模擬胃液離心后上清液鋅含量，mg；

m4——模擬胃液中鋅含量，mg；

m5——模擬腸液離心后上清液鋅含量，mg；

m6——模擬腸液中鋅含量，mg。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS軟件的單因素方差分析(ANOVA)中LSD最小顯著差法對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。采用Origin 2019b、Excel 2007軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌生長曲線

由圖1可知，培養(yǎng)10 h后，4種乳酸菌均開始進(jìn)入對數(shù)生長期，繼續(xù)培養(yǎng)12 h達(dá)到穩(wěn)定期，且其生長周期分布類似。研究[12]表明，對數(shù)生長期的乳酸菌生長旺盛，富鋅能力強(qiáng)，有機(jī)鋅或無機(jī)鋅的轉(zhuǎn)化利用率高。因此，最佳加鋅時(shí)間為培養(yǎng)第10 h。

2.2 鋅濃度的篩選

由圖2可知，隨著溶液中鋅離子濃度的增加，保加利亞乳桿菌的生長先促進(jìn)后被抑制，當(dāng)富鋅培養(yǎng)濃度為50 mg/mL時(shí)，OD600 nm達(dá)最大值1.85，發(fā)酵培養(yǎng)液pH值降至4.86。當(dāng)鋅離子濃度為0～200 μg/mL時(shí)，嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌的生長均受到不同程度的抑制，與楊靖鵬等[18]的結(jié)果相似。這可能是由于鋅離子濃度過高時(shí)，鋅離子吸附達(dá)飽和，對細(xì)胞具有毒害作用。因此，選擇50 mg/mL作為富鋅培養(yǎng)濃度。

圖1 4種不同乳酸菌的生長曲線Figure 1 Growth curves of four different kinds oflactic acid bacteria

圖2 富鋅濃度對乳酸菌生長的影響Figure 2 Effects of different zinc concentrations onlactic acid bacteria-rich zinc culture

2.3 富鋅乳酸菌發(fā)酵上清液的抗氧化活性

2.3.1 ABTS自由基清除活性 由圖3可知，經(jīng)富鋅后乳酸菌上清液清除ABTS自由基活性顯著提高(P<0.05)，干酪乳桿菌的ABTS自由基清除率最高為(36.73±0.53)%，比空白組提高了8.27%。這可能是由于鋅離子參與了乳酸菌的抗氧化酶系如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽酶等的合成[19]。牡蠣多肽鋅富鋅培養(yǎng)的乳酸菌具有良好的抗氧化活性，且顯著高于葡萄糖酸鋅、硫酸鋅處理的乳酸菌(P<0.05)。綜上，富鋅培養(yǎng)可以顯著提高乳酸菌上清液的ABTS自由基清除活性。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 富鋅乳酸菌發(fā)酵上清液的ABTS自由基清除活性

Figure 3 ABTS free radical scavenging activities of lactic acid bacterial cultured with different zinc sources

2.3.2 DPPH自由基清除活性 由圖4可知，經(jīng)富鋅后的乳酸菌上清液DPPH自由基清除活性顯著提高(P<0.05)。其中硫酸鋅處理組和牡蠣多肽鋅處理組的抗氧化活性高于葡萄糖酸鋅處理組，牡蠣多肽鋅處理的保加利亞乳桿菌DPPH自由基清除率為(11.21±0.87)%，高于該鋅源富集的其他菌株。綜上，富鋅培養(yǎng)可以顯著提高乳酸菌上清液的DPPH自由基清除活性。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 富鋅乳酸菌發(fā)酵上清液的DPPH自由基清除活性

Figure 4 DPPH free radical scavenging activities of lactic acid bacterial cultured with different zinc sources

2.3.3 超氧陰離子自由基清除活性 由圖5可知，與空白組相比，牡蠣多肽鋅培養(yǎng)的乳酸菌上清液超氧陰離子自由基清除活性顯著提高(P<0.05)。經(jīng)硫酸鋅富鋅培養(yǎng)的乳酸菌抗氧化活性高于牡蠣多肽鋅組和葡萄糖酸鋅組，其中干酪乳桿菌清除率最高為(45.17±1.39)%，保加利亞乳桿菌清除率最高為(45.29±0.63)%；嗜酸乳桿菌清除率最高為(37.17±0.79)%。研究[20]表明，乳酸菌抗氧化活性的提高可以改善由于各種因素引起的胃腸道氧化應(yīng)激紊亂，保證腸道功能的穩(wěn)定。綜上，經(jīng)富鋅培養(yǎng)后乳酸菌的體外抗氧化活性顯著提高。

2.4 富鋅乳酸菌的消化穩(wěn)定性

2.4.1 模擬胃消化穩(wěn)定性 由圖6(a)可知，不同乳酸菌經(jīng)模擬胃液消化后的細(xì)胞活力損失率提高；經(jīng)模擬胃消化3 h后，保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌及干酪乳桿菌的活力損失率分別為(6.69±0.18)%，(4.14±0.32)%，(6.93±0.42)%，(7.56±0.19)%。當(dāng)胃消化時(shí)間延長至6 h時(shí)，乳酸菌活力損失率變化緩慢。綜上，富鋅培養(yǎng)后乳酸菌的耐胃酸活性得到保留，具有一定的耐胃酸活性。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 富鋅乳酸菌發(fā)酵上清液的超氧陰離子自由基清除活性

Figure 5 Superoxide anion free radicals scavenging activities of lactic acid bacterial cultured with different zinc sources

2.4.2 模擬腸消化穩(wěn)定性 由圖6(b)可知，經(jīng)模擬腸道消化后，乳酸菌活力損失率提高；培養(yǎng)6 h后，保加利亞乳桿菌活力損失率為(31.07±0.26)%，繼續(xù)消化至12 h后，保加利亞乳桿菌的活力損失率最高，為(52.53±0.43)%。這可能是由于經(jīng)模擬胃液消化后，乳酸菌的結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，再經(jīng)模擬腸液消化后其結(jié)構(gòu)變得松散，因此死亡率提高[21]。

2.5 保加利亞乳桿菌的富鋅能力和生物利用率

研究[22]表明，乳酸菌富鋅的過程包含乳酸菌的表面吸附和細(xì)胞吸收兩個(gè)步驟。由表1可知，牡蠣多肽鋅乳酸菌的生物利用率為29.78%，顯著高于葡萄糖酸鋅和硫酸鋅的，可能是無機(jī)鋅吸附在小腸上皮細(xì)胞表面，阻止了鋅離子進(jìn)入細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而降低其生物利用率。同時(shí)，模擬胃腸道消化過程中，硫酸鋅富鋅培養(yǎng)的乳酸菌更容易發(fā)生解離，其中硫酸鋅富鋅培養(yǎng)的保加利亞乳桿菌總釋放率為15.67%，分別為牡蠣多肽鋅和葡萄糖酸鋅的3.60，2.88倍。鋅離子的釋放會在胃腸道內(nèi)發(fā)生蓄積，刺激胃腸道黏膜引起胃腸道功能紊亂。綜上，牡蠣多肽鋅可以作為乳酸菌富鋅的優(yōu)質(zhì)鋅源。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖6 富鋅乳酸菌的模擬胃腸道消化穩(wěn)定性

Figure 6 Simulated gastrointestinal digestive stability of zinc-rich lactic acid bacteria

3 結(jié)論

以富鋅乳酸菌為研究對象，優(yōu)化乳酸菌富鋅培養(yǎng)條件，并測定4種富鋅乳酸菌的抗氧化活性和胃腸道體外消化穩(wěn)定性以及生物利用率。結(jié)果表明，保加利亞乳桿菌是一種潛在的優(yōu)勢富鋅菌，且富鋅培養(yǎng)后其抗氧化活性顯著提高。牡蠣多肽鋅可以作為一種安全的鋅來源，其富鋅培養(yǎng)后的乳酸菌具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，較好的生物利用率和較低的腸釋放率。后續(xù)將對富鋅乳酸菌的益生性和體內(nèi)消化穩(wěn)定性以及潛在的生理活性進(jìn)一步研究。

表1 保加利亞乳桿菌胃腸道鋅釋放率和生物利用率?Table 1 Gastrointestinal zinc release rate and bioavailability of zinc-rich Lactobacillus bulgaricus cultured with different zinc sources %

? 字母不同表示差異顯著(P<0.05)。