青岡櫟果殼提取物體外抗氧化及α -葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶抑制能力研究

茹月蓉 - 楊金梅 - 沈文杰 - 王軍民 -郭 磊 范方宇 - 沙小梅 - 王振興, -,

(1. 西南林業(yè)大學生命科學學院，云南 昆明 650224；2. 江西師范大學生命科學學院，江西 南昌 330022)

青岡櫟果實是殼斗科青岡屬喬木青岡櫟(Cyclobalanopsisglauca)的種子，由果仁和果殼組成。青岡櫟果仁富含淀粉、油脂、蛋白質、多酚等營養(yǎng)物質和活性成分[1-2]，民間常用作淀粉、釀酒原料或動物飼料，亦可藥用作為收斂劑，是一種具有較高開發(fā)價值的綠色食品資源[3]。

青岡櫟除用于園林綠化和木材利用外，其大量的樹葉、樹皮、樹根和果實尚未得到開發(fā)利用。研究發(fā)現(xiàn)，青岡櫟樹葉提取液具有較強的抗氧化能力、抗癌、抗疲勞作用[4]，其樹根提取液具有抗疲勞和抗癌活性[5]；青岡櫟果實具有較強的抗癌活性[6]，其種子提取物具有較強的清除ABTS自由基和DPPH自由基能力[7]，說明青岡櫟資源具有很高的開發(fā)潛力。作為青岡櫟的主要副產物，青岡櫟果殼約占果實重量的20%～40%，但其活性成分和功能性質尚未見報道。

課題組前期采用超聲波輔助乙醇提取了青岡櫟果殼中活性成分，發(fā)現(xiàn)提取物具有較強的鐵還原能力和氧自由基吸收能力。但對于其他方面的功能活性并未作研究，且抗氧化能力涉及到多種反應特征和機理，單一的方法不能準確全面地表征樣品的抗氧化能力[8]。試驗擬以羥基自由基、DPPH自由基、超氧陰離子、ABTS自由基清除能力為指標，評價青岡櫟果殼提取物的體外抗氧化能力；以抑制α-葡萄糖苷酶的能力為指標，評估其體外降血糖能力；以抑制乙酰膽堿酯酶的能力，評估其防治阿茲海默癥的能力。為進一步開發(fā)利用青岡櫟資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青岡櫟果實：江蘇省宿遷市沭陽縣；

乙醇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、抗壞血酸(VC)、奎諾二甲基丙烯酸酯(trolox)、氫氧化鈉、過氧化氫、硫酸亞鐵、過硫酸鉀，鹽酸等：分析純，天津市大茂化學試劑廠；

三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)、水楊酸、鄰苯三酚、甘氨酸：北京索萊寶科技有限公司；

阿卡波糖、加蘭他敏、4-甲基傘形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUG)、釀酒酵母α-葡萄糖苷酶、二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)、硫代乙酰膽堿、電鰻乙酰膽堿酯酶(AChE)：西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。

1.2 儀器與設備

循環(huán)水真空泵：SH2-D(III)型，邦西儀器科技有限公司；

電子天平：AX224ZH型，奧豪斯儀器(常州)有限公司；

紫外—可見分光光度計：722N型，上海菁華科技儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-6型，上海力辰邦西儀器儀器有限公司；

酶標儀：SynergyH1型，美國伯騰儀器有限公司；

超聲波清洗器：SG5200HDT型，上海冠特超聲儀器有限公司；

旋轉蒸發(fā)儀：N-1001型，日本東京理化器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青岡櫟果殼提取物的制備 青岡櫟果實曬干后取殼，粉碎，過60目篩，45 ℃恒溫箱中烘干至恒重。準確稱取青岡櫟果殼粉末，按料液比1∶30 (g/mL)加入40%的乙醇水溶液，240 W下超聲提取20 min，過濾，殘渣重復提取2次，合并上清液，4 000 r/min離心30 min，棄去沉淀，再將上清液反復抽濾至澄清透亮，得青岡櫟果殼提取液。將提取液于50 ℃下真空旋干，得青岡櫟果殼提取物(CGSE)。

1.3.2 CGSE的體外抗氧化能力測定

(1) 清除羥基自由基的能力：參照文獻[9]的方法并稍作改進，取2 mL不同濃度的CGSE溶液，與2 mL FeSO4(9 mmol/L)和2 mL水楊酸—乙醇溶液(9 mmol/L)混合均勻，再加入2 mL H2O2(8.8 mmol/L)，迅速搖勻后，37 ℃水浴30 min，3 000 r/min離心5 min，取上清液，測定510 nm處吸光值。以等量40%乙醇替代CGSE溶液作空白，等量95%乙醇替代水楊酸—乙醇溶液作對照，VC代替CGSE溶液作陽性對照，所有試驗重復3次，按式(1)計算羥基自由基的清除率。

(1)

式中：

R——清除率，%；

A——試驗組的吸光值；

A0——對照組的吸光值；

A1——空白組的吸光值。

(2) 清除DPPH自由基的能力：參照文獻[10]的方法并稍作改進，取2 mL不同濃度的CGSE溶液與2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L)于試管中混勻，避光反應20 min，測定517 nm處吸光值。以等量40%乙醇替代CGSE溶液作空白，等量95%乙醇替代DPPH溶液作對照，VC代替CGSE溶液作陽性對照，所有試驗重復3次，按式(1)計算清除率。

(3) 清除超氧陰離子的能力：參照文獻[11]的方法并稍作改進，采用鄰苯三酚自氧化生成超氧陰離子。取245 μL Tris-HCl緩沖液(pH 7.4，50 mmol/L)、50 μL CGSE溶液和5 μL鄰苯三酚溶液(60 mmol/L)，迅速混勻，37 ℃水浴6 min，測定325 nm處的吸光度，每隔30 s讀數(shù)一次，至300 s止。以Tris-HCl緩沖液為對照，蒸餾水為空白組，VC做陽性對照。采用Trolox代替CGSE溶液測定標準曲線并計算相同吸光值下樣品的當量濃度，即Trolox當量(TE)，用μg TE /g DW表示。所有試驗重復3次。

(4) 清除ABTS自由基的能力：參考文獻[12]的方法并稍作改進，取0.2 mL不同濃度的CGSE溶液與3.8 mL ABTS工作液，混勻，避光反應6 min，測定734 nm處吸光值。以40%乙醇替代CGSE溶液作空白，等量95%乙醇替代ABTS溶液作對照，VC代替CGSE溶液作陽性對照，所有試驗重復3次，按式(1)計算清除率。

1.3.3 CGSE抑制α-葡萄糖苷酶的能力 參考文獻[13]的方法并稍作改進，在黑色96孔酶標板中加入50 μL合適濃度的CGSE溶液和50 μL 4-MUG溶液，充分混勻，然后加入20 μLα-葡萄糖苷酶溶液(0.1 U/mL)，室溫下避光反應20 min，加入100 μL甘氨酸—NaOH溶液終止反應，振蕩30 s，在激發(fā)波長355 nm，發(fā)射波長460 nm下測定熒光強度，利用熒光底物4-MUG的熒光衰減程度來判斷α-葡萄糖苷酶的抑制能力，以40%乙醇代替CGSE溶液作為空白，PBS代替α-葡萄糖苷酶溶液的反應作為對照，以阿卡波糖為陽性對照。所有試驗重復3次，按式(2)計算抑制率。

(2)

式中：

R——抑制率，%；

A——試驗組的熒光強度；

A0——對照組的熒光強度；

A1——空白組的熒光強度。

1.3.4 CGSE抑制乙酰膽堿脂酶的能力 參考文獻[13]的方法并稍作改進，依次加入50 μL CGSE溶液、125 μL DTNB(3 mmol/L)、25 μL乙酰膽堿脂酶(0.2 U/mL)于酶標板中，室溫下反應15 min，再加入25 μL硫代乙酰膽堿溶液，反應10 min后立即加入20 μL 0.4% SDS終止反應。測定405 nm處吸光值。以加蘭他敏作為陽性對照，PBS溶液代替乙酰膽堿脂酶為對照，40%乙醇代替CGSE溶液為空白。所有試驗重復3次，按式(2)計算抑制率。

1.4 數(shù)據分析

采用Origin 8.5軟件繪圖，并對結果進行比較分析，所有試驗均平行3次，結果以(平均值±標準偏差)表示。

2 結果與分析

2.1 CGSE的體外抗氧化能力

2.1.1 清除羥基自由基的能力 由圖1可知，CGSE與VC清除羥基自由基的能力均隨濃度的增加而增大；CGSE清除羥基自由基的IC50值為(273.43±9.55) μg/mL，與商用抗氧化劑VC尚有一定差距(P<0.05)。

2.1.2 清除DPPH自由基的能力 由圖2可知，CGSE與VC的變化趨勢基本一致。當質量濃度<20 μg/mL時，CGSE和VC對DPPH自由基的清除能力均隨濃度的增大先增強后趨于穩(wěn)定。當質量濃度為20 μg/mL時，對DPPH自由基的清除能力最強，達89.64%，VC的清除率為91.12%。CGSE的IC50值為(8.31±0.08) μg/mL，與VC無顯著性差異(P>0.05)，表明CGSE具有較強的清除DPPH自由基能力。

圖1 CGSE對羥基自由基的清除率Figure 1 The hydroxyl radicals scavenging ability of CGSE

圖2 CGSE對DPPH自由基的清除率Figure 2 The DPPH scavenging ability of CGSE

2.1.3 清除超氧陰離子自由基的能力 由圖3可知，CGSE清除超氧陰離子能力為(1 662.37±30.71) μg Trolox/g·DW，略高于VC(P>0.05)，表明CGSE具有較強的抑制鄰苯三酚自氧化能力。

圖3 CGSE清除超氧陰離子的能力

Figure 3 The superoxide anion scavenging ability of CGSE

2.1.4 清除ABTS自由基的能力 由圖4可知，CGSE和VC對ABTS自由基的清除率隨濃度的增大而增大。當樣品質量濃度為70 μg/mL時，CGSE的清除率高達98.37%，高于VC。CGSE的IC50值為(26.43±0.14) μg/mL，顯著低于VC(P<0.05)。表明CGSE具有比VC更強的清除ABTS自由基的能力。

2.2 CGSE對α-葡萄糖苷酶的抑制能力

由圖5可知，CGSE與阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制能力均隨濃度的增加而增大；CGSE抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值為(24.81±1.99) μg/mL，顯著低于對照物樣品阿卡波糖(P<0.01)，表明CGSE具有較強的抑制α-葡萄糖苷酶的能力。

2.3 CGSE對乙酰膽堿酯酶的抑制的能力

由圖6可知，CGSE抑制乙酰膽堿酯酶的能力隨濃度的增加而增大，但弱于對照藥物加蘭他敏。CGSE抑制乙酰膽堿酯酶的IC50值為(422.29±25.26) μg/mL，顯著高于加蘭他敏(P<0.01)。

圖4 CGSE對ABTS自由基的清除率Figure 4 The ABTS+ scavenging ability of CGSE

圖5 CGSE抑制α-葡萄糖苷酶的能力Figure 5 The α-glucosidase inhibitory activity of CGSE

圖6 CGSE抑制乙酰膽堿酯酶的能力Figure 6 The AChE inhibitory activity of CGSE

3 結論

以超聲波輔助乙醇提取法提取了青岡櫟果殼提取物(CGSE)，鑒于抗氧化復雜的反應特征和機理，采用了4種不同抗氧化體系來綜合表征CGSE的抗氧化能力。結果表明：CGSE的清除羥基自由基的能力弱于商業(yè)抗氧化劑VC；清除DPPH自由基和超氧陰離子能力與VC無顯著性差異；清除ABTS自由基的能力顯著高于VC，說明青岡櫟果殼可作為優(yōu)良的天然抗氧化劑使用。CGSE抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值為(24.81±1.99) μg/mL，其抑制能力高于阿卡波糖，也高于麻櫟橡子[14]、麻櫟葉[15]等同科植物，說明CGSE具有較強的抑制α-葡萄糖苷酶能力，具備開發(fā)為天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑的潛力；CGSE抑制乙酰膽堿酯酶的IC50值為(422.29±25.26) μg/mL，高于丹參[16]等藥用植物，但離常用藥物加蘭他敏尚有一定差距，需進行進一步分離純化，尋找相關活性物質，并考慮以其為母體進行結構修飾以增強其活性[17]。后續(xù)可篩選出青岡櫟果殼中具有抗氧化能力、抑制α-葡萄糖苷酶和乙酰膽堿酯酶的物質成分，并對其結構進行鑒定，研究其工作機理。