體外發(fā)酵荔枝皮多酚對(duì)多酚抗氧化能力和腸道菌群的影響

黃小霞 - 李曉樂 - 李 武 楊瑞麗 -

(1. 海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 海口 570228；2. 廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510462；3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510462)

荔枝(LitchichinensisSonn.)為亞熱帶無患子科荔枝屬植物，主產(chǎn)于中國(guó)，以海南、廣西、廣東、福建和臺(tái)灣等地栽培最多[1]。荔枝的收獲時(shí)間集中，除鮮食外，通常加工成荔枝干、果醋、罐頭、果酒等。在加工過程中，荔枝果皮一般被當(dāng)作加工廢物丟棄。有文獻(xiàn)[2]顯示，荔枝果皮的重量大約是其鮮果重量的15%，含有豐富的多酚類物質(zhì)，具有抗氧化、降血脂、改善心腦血管疾病等活性。但研究[3]顯示，多酚的生物利用率極低，超過95%的膳食多酚不能被小腸吸收，而通過結(jié)腸微生物代謝。

人體腸道內(nèi)大約存在1014個(gè)、1 000多種不同的細(xì)菌[4]，這些微生物在糞便中的數(shù)量高達(dá)1011～1012CFU/g[5]。腸道菌群被稱作人體的“第二大腦”與宿主共同進(jìn)化，其群類結(jié)構(gòu)及多樣性為宿主提供了多種功能，如消化復(fù)雜的膳食殘?jiān)?、產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抵御病原體和調(diào)節(jié)免疫功能[6]。研究[7]顯示，腸道菌群在膳食功能因子的生物可及性和功效發(fā)揮過程中起著重要的作用。腸道菌群與膳食功效因子的互作關(guān)系受到越來越多研究者的關(guān)注[8]。已有研究[9]表明不同的多酚體外發(fā)酵對(duì)腸道菌群的影響不同，而關(guān)于荔枝皮多酚對(duì)腸道菌群的影響還未見報(bào)道。

試驗(yàn)擬通過離體人腸道菌群代謝荔枝皮多酚，采用高通量測(cè)序分析腸道菌群在代謝過程中菌群結(jié)構(gòu)的變化，檢測(cè)荔枝皮多酚在體外發(fā)酵過程多酚含量和抗氧化活性的變化，以期為荔枝果皮多酚的功效作用和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

荔枝：淮枝，廣東廣州某荔枝生產(chǎn)基地；

厭氧培養(yǎng)基：廣州健陽(yáng)生物技術(shù)有限公司；

乙醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、鐵離子還原抗氧化劑(FRAP)：美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

厭氧培養(yǎng)箱：YQY-1型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；

多功能酶標(biāo)儀：Multiskan Mk3型，美國(guó)Thermo Fisher公司；

PCR儀：GeneAmp PCR System 9700型，美國(guó)愛普拜斯公司。

1.2 方法

1.2.1 荔枝皮多酚粗提物的制備 新鮮荔枝皮粉碎，按料液比1∶15 (g/mL)與70%乙醇溶液混合，于40 ℃水浴恒溫浸提3 h，200目尼龍布過濾，殘?jiān)鼜?fù)提1次，抽濾，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干后冷凍干燥(-80 ℃，0.34 Pa，48 h)，得荔枝皮多酚粗提物，經(jīng)測(cè)定其總酚含量為(17.85±1.84) mg GAE/g·FW。

1.2.2 人體糞便采集 選擇30名21～25歲的健康成人(男∶女=1∶1)，無腸道病史，采樣前兩周內(nèi)未使用過任何藥物。采集志愿者新鮮糞便，采樣瓶1 h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室，液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 腸道菌群制備 參照文獻(xiàn)[10]并作改進(jìn)，將采集的糞便解凍，在無菌操作條件下，糞便與生理鹽水按1∶4 (g/mL)比例混合均勻，蝸旋2 min，用4層無菌紗布過濾，濾液即為腸道菌液。按1∶9的比例將腸道菌液加入?yún)捬跖囵B(yǎng)基中，混勻，液體石蠟液封后置于干燥器(含厭氧產(chǎn)氣包)中37 ℃培養(yǎng)24 h，得培養(yǎng)液，以3%比例進(jìn)行二次擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.4 荔枝皮多酚體外發(fā)酵 參照Rycroft等[11]的體外發(fā)酵法并改進(jìn)，5.4 mL腸道菌懸液加入0.6 mL 0.3 mg/mL荔枝皮多酚，混合均勻后，迅速吸取1.0 mL加入滅菌離心管，37 ℃厭氧培養(yǎng)。監(jiān)測(cè)發(fā)酵不同時(shí)間點(diǎn)(0，4，8，12，24，48 h)多酚含量、抗氧化值和腸道菌群的變化。

1.2.5 總酚含量的測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu比色法[12]。

1.2.6 抗氧化活性的測(cè)定

(1) FRAP抗氧化能力：參照文獻(xiàn)[13]，修改如下：150 mL樣品與2 850 mL FRAP工作液反應(yīng)修改為2 800 μL FRAP工作液中加入200 μL稀釋至一定濃度的樣品。

(2) 清除ABTS+·能力：參照文獻(xiàn)[14]。

1.2.7 菌群構(gòu)成分析 樣品中腸道微生物總DNA提取以及高通量測(cè)序委托上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行。

(1) 樣本總DNA提?。翰捎媚c道微生物DNA試劑盒提取DNA。

(2) 目標(biāo)片段PCR擴(kuò)增：對(duì)目標(biāo)片段16S rDNA V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以第一個(gè)引物中的barcode 作為特異引物擴(kuò)增得到目標(biāo)產(chǎn)物。

(3) 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化與定量：1.2.7(2)中PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，切膠回收目標(biāo)片段，采用熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

(4) 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序：使用美國(guó)Illumina公司的試劑盒制備測(cè)序文庫(kù)。用MiSeq測(cè)序儀和使用MiSeq V3試劑盒對(duì)文庫(kù)中的片段進(jìn)行2×300 bp的雙端測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 理化指標(biāo)分析 結(jié)果以mean±SD表示(n=4)。采用SPSS 22.0軟件，單因素分析方法(ANOVA)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GraphPad Prism 8.3 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖形化處理。

1.3.2 Illumina MiSeq平臺(tái)測(cè)序數(shù)據(jù)分析 高通量測(cè)序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、過濾、去嵌合體，得到的有效數(shù)據(jù)，進(jìn)行分類操作單元的劃分以及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，菌群結(jié)構(gòu)差異及差異微生物種類采用 QIIME[15]、Usearch[16]分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚含量的變化

由圖1可知，0 h與48 h相比，對(duì)照組(滅活腸道菌群)總酚含量無顯著性變化，表明在無腸道菌群作用下，荔枝皮多酚相對(duì)穩(wěn)定。荔枝皮多酚在發(fā)酵過程中呈顯著下降趨勢(shì)，代謝48 h后其總酚含量和0 h相比降低了20.94%(P<0.05)，說明荔枝皮多酚在腸道菌群作用下發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化。

小寫字母不同表示組內(nèi)顯著性差異(P<0.05)圖1 體外發(fā)酵過程中荔枝皮多酚含量的變化Figure 1 Degradation curve of litchi pericarp polyphenolsby intestinal microflora

2.2 抗氧化活性的變化

2.2.1 FRAP抗氧化活性 荔枝皮多酚體外發(fā)酵4 h時(shí)，其FRAP抗氧化值為0 h的111.59%(P>0.05)，之后隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)RAP抗氧化活性呈降低趨勢(shì)，發(fā)酵24 h和48 h時(shí)，F(xiàn)RAP抗氧化值分別為0 h的92.97%和92.19%(P>0.05)。FRAP抗氧化值的變化，可能是由不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)微生物轉(zhuǎn)化生成的代謝產(chǎn)物種類和量不同引起的。

2.2.2 ABTS+·抗氧化活性 如圖3所示，在0～48 h時(shí)ABTS+·抗氧化活性無顯著差異。發(fā)酵4，8，12，24，48 h時(shí)，ABTS+·抗氧化值分別為0 h的102.58%，105.64%，103.96%，98.60%和93.58%(P>0.05)。表明多酚被腸道菌群生物轉(zhuǎn)化成的產(chǎn)物仍然具有良好的抗氧化活性。

2.3 體外發(fā)酵荔枝皮多酚對(duì)腸道菌群的影響

2.3.1 腸道菌群基本分析 圖4為各分類水平的主要類群，從內(nèi)到外依次為門、綱、目、科。從門的水平上，體外培養(yǎng)腸道菌群樣品中主要的類群依次為：厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)，占其總含量的97.47%；從綱的水平上，主要的類群依次為梭菌綱(Clostridia)、變形菌綱(Gammaproteobacteria)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)，占其總含量的95.65%；從目的水平上，主要的類群依次為梭菌目(Clostridiales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、擬桿菌目(Bacteroidales)、乳桿菌目(Lactobacillales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、脫硫弧菌目(Desulfovibrionales)，占其總含量的94.99%；從科的水平上，主要的類群依次為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、韋榮氏菌科(Veillonellaceae)、腸球菌科(Enterococcaceae)、消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、脫硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)，占其總含量的90.87%。由鑒定結(jié)果可知，糞便樣品分離制備腸道菌群及體外厭氧發(fā)酵方法具有可行性。

小寫字母不同表示組內(nèi)顯著性差異(P<0.05)圖2 體外發(fā)酵荔枝皮多酚FRAP抗氧化活性的變化

Figure 2 Changes of FRAP antioxidant activity of LPP before and after incubation with intestinal microbiota

圖3 體外發(fā)酵荔枝皮多酚ABTS+·抗氧化活性的變化

Figure 3 Changes of ABTS+· antioxidant activity of LPP before and after incubation with intestinal microbiota

圖4 各分類水平的主要類群Figure 4 The main groups at each classification level

2.3.2 對(duì)腸道菌群α多樣性的影響 如表1所示，24個(gè)樣品共獲得864 040條16S rDNA有效序列量，采用QIIM對(duì)有效序列以97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU的劃分。結(jié)果顯示，隨著體外發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，香濃指數(shù)有所升高，表明菌群的多樣性提高。

表1 發(fā)酵荔枝皮多酚過程中腸道菌群信息及α 多樣性Table 1 Sample information and α diversity of intestinal microbiota (n =4)

2.3.3 對(duì)腸道菌類群的影響 圖5為荔枝皮多酚代謝的菌群OUT聚類分析。從圖5中可以發(fā)現(xiàn)，門、綱、目水平上的微生物類群數(shù)目隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)無明顯變化，但科、屬、種水平上的微生物類群在24～48 h呈增加趨勢(shì)。根據(jù)Li等[17]的報(bào)道，荔枝皮多酚及其發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可能促進(jìn)或抑制某些菌屬的生長(zhǎng)，從而引起腸道菌類群的變化。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間各分類水平的微生物類群的變化

Figure 5 The changes of microorganism group number in different incubation time

2.3.4 對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬及其相對(duì)豐度的影響 荔枝皮代謝過程中優(yōu)勢(shì)菌屬的熱圖(圖6)分析結(jié)果顯示，腸道菌群前三優(yōu)勢(shì)菌屬為腸球菌屬(Enterococcus)、擬桿菌屬(Bacteroides)和梭菌屬(Clostridium)。其中腸球菌屬(Enterococcus)的相對(duì)含量在整個(gè)代謝過程中呈增加趨勢(shì)，48 h時(shí)增加至0 h的1.47倍，而擬桿菌屬(Bacteroides)和梭菌屬(Clostridium)呈降低趨勢(shì)。由圖7的結(jié)果顯示，其相對(duì)含量在48 h分別降低至0 h的57.16%和20.87%。梭桿菌屬(Fusobacterium)和脫硫弧菌(Desulfovibrio)的相對(duì)含量較低，但在整個(gè)發(fā)酵過程中呈增加趨勢(shì)，在48 h時(shí)，其相對(duì)豐度分別是0 h的13.58倍和10.35倍(圖7)。

藍(lán)色代表相對(duì)含量較低，顏色越深，相對(duì)豐度越低；紅色代表相對(duì)含量較高，顏色越深，相對(duì)豐度越高。

圖6 優(yōu)勢(shì)屬的相對(duì)豐度變化

Figure 6 Relative abundance changes of the main genus

圖7 主要差異屬的相對(duì)豐度變化Figure 7 Relative abundance changes of the major variant genus

與相關(guān)報(bào)道比，試驗(yàn)?zāi)c道微生物的優(yōu)勢(shì)菌屬與潘亞平等[18]的研究結(jié)果相近。擬桿菌屬是人和動(dòng)物體內(nèi)大量存在的正常菌群，報(bào)道[19]顯示擬桿菌屬在炎癥性腸病中具有促炎作用，其降低能減少腸道炎癥的發(fā)生，試驗(yàn)結(jié)果顯示，荔枝皮多酚能夠降低擬桿菌屬腸道中的相對(duì)豐度，提示荔枝皮多酚的抗腸道炎癥作用可能與其引起擬桿菌的變化有關(guān)。梭桿菌屬是腸道內(nèi)主要的產(chǎn)丁酸菌，丁酸是短鏈脂肪酸的一種，具有為腸上皮細(xì)胞提供能量、促進(jìn)腸黏膜修復(fù)，調(diào)節(jié)腸道免疫等作用[20]，其在荔枝皮多酚發(fā)酵過程中逐漸富集，表明荔枝皮多酚可能被梭桿菌屬酵解生成短鏈脂肪酸丁酸，進(jìn)一步發(fā)揮維護(hù)腸道健康的作用。

2.3.5 優(yōu)勢(shì)菌屬的相互關(guān)系 菌群關(guān)聯(lián)分析結(jié)果(圖8)顯示，發(fā)酵荔枝皮的優(yōu)勢(shì)菌屬存在相互協(xié)同或相互競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系。其中，腸球菌屬(Enterococcus)、薩特氏菌屬(Sutterella)與考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)呈顯著的正相關(guān)，表現(xiàn)為協(xié)同關(guān)系。脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、顫螺旋菌屬(Oscillospira)與雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)呈現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。微生物對(duì)多酚結(jié)構(gòu)的敏感性不同，不同的多酚需要不同的菌屬單獨(dú)或協(xié)同進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，從而表現(xiàn)出菌屬間競(jìng)爭(zhēng)或協(xié)同關(guān)系。這種結(jié)果提示，微生物間的相互關(guān)系也可能是引起菌群結(jié)構(gòu)變化的原因之一。

計(jì)算優(yōu)勢(shì)菌屬之間的斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)，在其中rho>0.6且P<0.01的優(yōu)勢(shì)菌屬之間構(gòu)建關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。紅色線為正相關(guān)，黑色線為負(fù)相關(guān)

圖8 優(yōu)勢(shì)屬的相互關(guān)系

Figure 8 The relationship between dominant genus

3 結(jié)論

荔枝皮多酚在腸道菌群發(fā)酵過程中總酚含量顯著下降，抗氧化活性在0～48 h呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，可能是因?yàn)椴煌l(fā)酵時(shí)間轉(zhuǎn)化生成的代謝產(chǎn)物種類和量不同，代謝產(chǎn)物具有一定的抗氧化活性。在48 h發(fā)酵過程中，荔枝皮多酚能提高腸道菌群的α多樣性。優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度隨發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)變化，其中，梭桿菌屬和脫硫弧菌屬的相對(duì)豐度顯著提高，擬桿菌屬和梭菌屬顯著降低，腸球菌屬與考拉桿菌屬表現(xiàn)為協(xié)同關(guān)系，脫硫弧菌屬與雙歧桿菌屬表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。荔枝皮多酚對(duì)腸道菌群的影響與其他報(bào)道的植物多酚相比存在差異，可能與多酚單體的組成不同有密切關(guān)系，后續(xù)試驗(yàn)將進(jìn)一步考察多酚單體在發(fā)酵過程中的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物生成和變化。