染料木素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值及不確定度評估

李全發(fā) - 于寒松,2 -,2 王 敏 周 劍

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118；2. 國家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系研發(fā)中心加工實驗室,吉林 長春 130118；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081)

大豆異黃酮(soybean isoflavone，SI)是大豆生長過程中形成的次級代謝產(chǎn)物, 又稱植物雌激素，它是多酚類混合物，具有多種生物活性[1]。大豆異黃酮在常溫下的性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于醇類、酯類、酮類溶劑和稀堿中，不溶于水，難溶于石油、乙醚、苯等非極性有機(jī)溶劑。大豆異黃酮作為異黃酮類化合物，具有異黃酮類化合物所共有的理化性質(zhì)。其中染料木素呈長方形或六邊形棒狀結(jié)晶(60%乙醇)、樹枝狀結(jié)晶(乙醚)，溶于DMSO和Meth，幾乎不溶于水，改變?nèi)芤簆H對染料木素沒有明顯影響。染料木素結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 染料木素分子結(jié)構(gòu)式Figure 1 Molecular structure of Genistein

隨著研究的深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮具有多種生物活性，如抗氧化活性[2]、抗癌活性[3-4]、類雌激素[5]及抗雌激素活性[6]，還可以預(yù)防心血管疾病[7]、改善更年期綜合癥[8]等，不同組分的大豆異黃酮生物活性也不相同[9-10]。同時，許多學(xué)者也建立了很多分析大豆異黃酮含量的方法，例如高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)[11-12]、高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS)[13-15]、氣相色譜法(Gas Chromatography， GC)[16]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(Gas Chromatographic-Mass Spectrometric，GC-MS)[17-18]等，這些方法的建立可為相關(guān)大豆異黃酮的定量測定提供參考依據(jù)[19]。楊得志等[20]采用DSC法和CT法兩種不同原理的定量方法研制了染料木素的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，筆者在對染料木素原料采用DSC法進(jìn)行純度初測時，發(fā)現(xiàn)染料木素在檢測溫度接近270 ℃時，會變?yōu)榻购隣?，造成DSC基線大幅度變化，不利于積分，從而降低了定值的準(zhǔn)確度；同時庫倫滴定法(CT)在配置電解液時比較繁瑣，且不易判斷滴定終點。

為了提高定值的準(zhǔn)確性及簡化定值過程，試驗擬采用質(zhì)量平衡法(Mass Balance Method，MB)及定量核磁氫譜法(Quantitative- Nuclear Magnetic Resonance，q-NMR)對染料木素展開定值研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：Waters 2695型，配有可變波長紫外檢測器和Empower工作站，美國Waters公司；

質(zhì)譜儀：AB SCIEX Triple Quad 3500型，配電噴霧離子源(ESI)，美國AB SCIEX公司；

傅立葉變換紅外光譜儀：IRT racer-100型，美國Agilent公司；

核磁共振儀器：Avance III 400 MHz型，德國Bruker公司；

氣相色譜儀：Agilent 7890A型，配氫火焰離子化檢測器FID、HS-10型頂空進(jìn)樣器，美國Agilent公司；

卡爾費休水分滴定儀：DO DL32型，瑞士Mettler Toledo公司；

紫外/可見光分光光度計：VAVODROP 2000c型，美國Thermo Fisher公司；

分析天平：XS105型，瑞士Mettler Toledo公司；

電子天平：UMX2型，瑞士Mettler Toledo公司；

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：X series 2型，美國Thermo Fisher公司；

核磁管：5 mm經(jīng)濟(jì)型，美國Wilmad公司。

1.1.2 材料與試劑

染料木素：純度>98%，美國Chroma Dex公司；

乙腈、甲醇、異丙醇、二氯甲烷、二甲苯：色譜純，德國Merck公司；

氘代甲醇：99.8%，美國Sigma公司；

乙酸乙酯(GBW 06114)、丙酮(GBW 06115)、正己烷(GBW 06116)、一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)苯甲酸(GBW 06117)：中國計量科學(xué)院；

DMSO-d6：北京百靈威科技有限公司。

1.2 定性分析

根據(jù)文獻(xiàn)[21]，對市售的染料木素純品原料進(jìn)行定性分析，主要包括質(zhì)譜法、紅外光譜法和核磁氫譜法。

1.3 樣品分裝

稱取染料木素原料3 g，采用加熱及冷凍干燥的方法去除水分。將干燥的樣品與研缽中攪拌混合約2 h后，進(jìn)行分裝。每個包裝分裝量20.0～22.0 mg，分裝不少于100瓶。將其密封并保存于干燥室溫(20 ℃)下。

1.4 均勻性和穩(wěn)定性考察

1.4.1 均勻性 根據(jù)文獻(xiàn)[21]中的方法，考察染料木素原料分裝的均勻性，檢測方法與液相色譜法測定原料的主成分純度方法相同。

1.4.2 穩(wěn)定性 根據(jù)文獻(xiàn)[21]中的方法，考察染料木素的長期穩(wěn)定性及短期穩(wěn)定性，分別檢驗其在儲存條件及運輸過程中量值的變化。檢測方法與液相色譜法測定原料的主成分純度方法相同。

1.5 定值

1.5.1 高效液相色譜條件優(yōu)化

(1) 色譜柱的選擇：比較ZORBAX Agilent SB-Aq (250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，Eclipse Agilent Plus-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，Thermo ODS-2 (250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，Eclipse Agilent SB-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm) 4種不同色譜柱對于染料木素及其雜質(zhì)的分離情況。

(2) 流動相比例優(yōu)化：以0.15%磷酸水溶液為水相，乙腈為有機(jī)相，考察3種不同流動相比例條件下染料木素及其雜質(zhì)的分離情況。

(3) 定值波長的選擇：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值原則，要求雜質(zhì)響應(yīng)最充分的波長為定值波長。選取220，230，260，290，320，350 nm 6個不同的波長進(jìn)行優(yōu)化。

(4) 樣品濃度的選擇：針對雜質(zhì)響應(yīng)程度，考察100，500，1 000，3 000 mg/L 4種不同濃度的染料木素甲醇溶液中雜質(zhì)出峰情況。

1.5.2 質(zhì)量平衡法定值 采用液相色譜法測定原料的主成分純度，分別取6支分裝的樣品配制濃度為500 mg/mL的檢測溶液，每支樣品配制3次，分別檢驗。

根據(jù)文獻(xiàn)[21]對染料木素中的雜質(zhì)進(jìn)行分析，主要包括卡爾費休法測定水分，微波消解—電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測定無機(jī)金屬元素雜質(zhì)，頂空氣相色譜法測定揮發(fā)性雜質(zhì)。

1.5.3 定量峰選擇 選擇積分范圍內(nèi)無干擾峰，含有多個氫的單峰作為定量峰[22]，以減少定值誤差。

1.5.4 核磁共振氫譜法定值 樣品配制方法：分別準(zhǔn)確稱量約22.000 mg樣品和10.000 mg內(nèi)標(biāo)物于同一透明玻璃瓶，用1 mL DMSO-d6完全溶解后，轉(zhuǎn)移至核磁管中待測。根據(jù)文獻(xiàn)[23]中的方法，將激發(fā)中心設(shè)置為δ8.15進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 主成分定性分析

2.1.1 傅里葉紅外光譜法 采用SHIMADZU IRT racer-100紅外光譜儀測定染料木素的紅外光譜圖，結(jié)果如圖2所示。其中3 410 cm-1為O—H鍵的伸縮振動；1 652.51 cm-1為C═O雙鍵的伸縮振動；1 615.38，1 519.91 cm-1為苯環(huán)的骨架震動；1 309.67 cm-1為O—H鍵的彎曲震動；1 202.13 cm-1為C—O鍵的伸縮振動；840.48 cm-1為苯環(huán)上C—H的彎曲振動。與文獻(xiàn)[24]報道的染料木素紅外譜圖比較，峰的位置一一對應(yīng)，因此可以初步判斷染料木素樣品的結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確。

圖2 染料木素的紅外光譜圖Figure 2 Infrared spectrum of Genistein

2.1.2 質(zhì)譜法 采用質(zhì)譜法測定化合物的母離子、子離子，可以為化合物準(zhǔn)確定性提供依據(jù)。將染料木素純品溶于甲醇溶劑中，配成1 mg/L的溶液，采用AB SCIEX Triple Quad 3500質(zhì)譜儀在正離子模式下全掃分析，質(zhì)譜圖如圖3所示，質(zhì)荷比分別為271.0，215.1，153.0，與文獻(xiàn)[13]記載的定性離子對相符合。由此認(rèn)為，純品原料主要成分為染料木素。

2.1.3 核磁氫譜法 如圖4(a)所示，化學(xué)位移值在δ6.21，6.37，6.81，7.37的峰分別歸屬于苯環(huán)上所連接8、11、15、16號位置的氫，化學(xué)位移為δ12.95的峰為18號位羥基上的氫。且測得的樣品中氫原子的化學(xué)位移值與通過Chemdraw模擬的染料木素的核磁氫譜圖[圖4(b)]的化學(xué)位移值均一一對應(yīng)。綜合以上3種定性方法的結(jié)果，最后判斷原料的主成分為染料木素。

圖3 染料木素的質(zhì)譜圖Figure 3 Mass spectrum of Genistein

2.2 均勻性考察

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的相關(guān)技術(shù)要求[25][26]1-3，研究從整個封裝過程的前、中、后3個時間段分別隨機(jī)抽取樣品，共11個包裝單位進(jìn)行均勻性檢驗。采用單因素方差分析法檢驗測量的數(shù)據(jù)，均勻性檢驗結(jié)果如表1所示。由表1可知，F(xiàn)

2.3 穩(wěn)定性考察

穩(wěn)定性考察主要為檢驗標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在長期儲存條件和不同運輸環(huán)境溫度下，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的理化性質(zhì)和量值保持不變的能力。對染料木素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了長期和短期的穩(wěn)定性考察，并采用直線擬合法考察穩(wěn)定性結(jié)果。

2.3.1 長期穩(wěn)定性考察 長期穩(wěn)定性考察及監(jiān)測結(jié)果如表2所示，由擬合直線的線性方程可知，斜率β1=0.002和截距β0=99.634，且∣β1∣

2.3.2 短期穩(wěn)定性考察 采用趨勢分析對監(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行考察，結(jié)果(如表3所示)顯示，3種溫度條件下∣β1∣

圖4 染料木素的核磁氫譜圖Figure 4 1H-NMR spectrum of Genistein

表1 染料木素均勻性檢驗結(jié)果?

表2 染料木素長期穩(wěn)定性考察結(jié)果?Table 2 The results of long-term stability of Genistein %

?β1為2.00E-03，β0為99.634，s2為9.611E-05，s(β1)為1.016E-03，t0.95，3為3.180。

表3 染料木素短期穩(wěn)定性考察結(jié)果?Table 3 The results of short-term stability of Genistein %

? 20 ℃：β1為-5.00E-03，β0為99.65，s2為3.00E-04，s(β1)為2.89E-03，t0.95，2為4.30；40 ℃：β1為-2.00E-03，β0為99.63，s2為6.00E-05，s(β1)為1.29E-03，t0.95，2為4.30；60 ℃：β1為-1.50E-03，β0為99.62，s2為1.55E-05，s(β1)為6.60E-04，t0.95，3為4.30。

2.4 質(zhì)量平衡法定值

2.4.1 高效液相色譜條件優(yōu)化 研究考察HPLC在不同色譜柱、流動相比例、檢測波長和樣品濃度條件下，染料木素液相色譜譜圖的變化，結(jié)果如圖5所示。使用Plus-C18色譜柱時，主峰的峰形較好，主峰后出現(xiàn)其余色譜柱上未出現(xiàn)的雜質(zhì)峰，見圖5(a)；當(dāng)流動相比例為74∶26時，雜質(zhì)與主峰完全分離，其余雜質(zhì)分離效果較好，見圖5(b)；在261 nm的紫外吸收波長下，6.5 min和12.5 min的雜質(zhì)響應(yīng)最充分，雜質(zhì)的峰面積最大，見圖5(c)；當(dāng)樣品濃度為500 mg/L及以上時，雜質(zhì)1、2、3出峰明顯，響應(yīng)充分，見圖5(d)。最后確定染料木素的液相色譜條件為：定值波長261 nm，色譜柱Eclipse Agilent Plus-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動相比例74∶26，樣品濃度500 mg/L。

2.4.2 質(zhì)量平衡法定值結(jié)果 樣品實際純度等于HPLC-UV法測得的純度減去水分含量、揮發(fā)性雜質(zhì)含量、以及無機(jī)元素含量等，最終質(zhì)量平衡法定值結(jié)果如表4所示，其中無機(jī)元素含量較少可以忽略。所以由質(zhì)量平衡法(MB)測定的染料木素純度為99.58%。

2.5 核磁共振氫譜法定值

2.5.1 定量峰選擇 通過分析苯甲酸和染料木素混標(biāo)的核磁氫譜圖，可以確定苯甲酸與染料木素混合樣品中的各個質(zhì)子峰的歸屬，并且可以確定每個質(zhì)子峰對應(yīng)的質(zhì)子數(shù)。染料木素A位的質(zhì)子峰與苯甲酸B位的質(zhì)子峰，化學(xué)位移值接近，耦合裂分簡單，不受其他質(zhì)子峰干擾，可以當(dāng)作定量峰(圖6)進(jìn)行定值研究。

2.5.2 核磁氫譜法定值結(jié)果 核磁氫譜法定值檢測結(jié)果如表5所示。

2.6 純度定值結(jié)果

純度定值的結(jié)果取質(zhì)量平衡法與定量核磁法測量結(jié)果的平均值，計算公式如式(1)所示，計算結(jié)果保留一位有效數(shù)字，為99.6%。

(1)

2.7 不確定度評定

染料木素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制過程中的不確定度評估根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值通用原則[26]17-23進(jìn)行，主要由均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗和定值過程3部分組成[27]。

2.7.1 均勻性引入的不確定度 均勻性標(biāo)準(zhǔn)偏差計算公式如式(2)所示。

(2)

式中：

SH——均勻性標(biāo)準(zhǔn)偏差；

n——組內(nèi)測量次數(shù)；

v2——組間自由度。

圖5 染料木素液相條件優(yōu)化圖Figure 5 The optimal conditions of HPLC of Genistein

表4 染料木素的質(zhì)量平衡法定值結(jié)果Table 4 The results of MB of Genistein %

(3)

2.7.2 穩(wěn)定性引入的不確定度 長期穩(wěn)定性的相對不確定度ults, rel根據(jù)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行計算，計算公式如式(4)所示，結(jié)算結(jié)果為0.000 8%。

圖6 苯甲酸及染料木素的1H-NMR譜圖

Figure 61H-NMR spectrum of benzoic acid

and genistein

(4)

短期穩(wěn)定性引入的相對不確定度usts,rel根據(jù)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行計算，計算公式：

(5)

表5 染料木素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)核磁結(jié)果

Table 5 Nuclear magnetic resonance results of genistein purity reference materials %

研究選擇不同溫度條件下不確定度最大的作為短期穩(wěn)定性的不確定度，所以應(yīng)選溫度條件為20 ℃下檢測引入的不確定度為短期穩(wěn)定性的不確定度，計算公式如式(6)所示，計算結(jié)果為0.022 5%。

(6)

2.7.3 定值引入的不確定度 定值引入的不確定度由質(zhì)量平衡法和定量核磁法兩部分構(gòu)成，計算公式如式(7)所示，計算結(jié)果為0.11%。

(7)

(1) 質(zhì)量平衡法引入的不確定度：質(zhì)量平衡法引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算公式如式(8)所示，計算結(jié)果為0.053%。

u(PMB,rel)=

(8)

式中：

u(P0)——HPLC法測定合成不確定度，%；

u(Xw)——微量水分測定引入的不確定度，%；

u(Xw)——非揮發(fā)性雜質(zhì)測定引入的不確定度，%；

u(Xv)——揮發(fā)性雜質(zhì)測定引入的不確定度，%。

質(zhì)量平衡法測定染料木素引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表6。

表6 質(zhì)量平衡法測定染料木素引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

Table 6 Relevant standard uncertainty results ofthedeterminationofGenisteinby massbalance

名稱計算結(jié)果/%u(Po)0.05u(Xw)0.018u(Xn)NDu(Xv)ND

(2) 定量核磁法引入的不確定度：定量核磁法引入的相對不確定度計算公式如式(9)所示，計算結(jié)果為0.086%。

(9)

式中：

u(Ix/Istd)——積分面積測定引入的不確定度，%；

u(Mx)——染料木素分子量引入的不確定度，%；

u(Mstd)——苯甲酸分子量引入的不確定度，%；

表7 定量核磁法測定染料木素引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

Table 7 Relevant standard uncertainty results of the determination of Genistein by qNMR

名稱計算結(jié)果/%u(Ix/Istd)0.054u(Mx)0.006 99u(Mstd)0.003 26u(mx)0.000 6u(mstd)0.000 6u(Pstd)0.01

u(mx)——樣品天平稱量引入的不確定度，%；

u(mstd)——內(nèi)標(biāo)物天平稱量引入的不確定度，%；

u(Pstd)——內(nèi)標(biāo)物純度引入的不確定度，%。

定量核磁法測定染料木素引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表7。

2.7.4 合成及拓展不確定度 染料木素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對不確定度計算公式如式(10)所示，計算結(jié)果為0.018 3%。

(10)

擴(kuò)展不確定度為：UCRM=k×p×uc,rel≈0.4%(k=2)。

3 結(jié)論

研究對市售的染料木素樣品進(jìn)行了定性分析，并對樣品進(jìn)行了均勻性檢驗和穩(wěn)定性考察，建立了一種以液相色譜法(HPLC)為基礎(chǔ)的染料木素的定值方法，同時用定量核磁法進(jìn)行純度驗證，最終確定該染料木素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度為99.6%，拓展不確定度為0.4%。