基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜定性分析啤酒中糖類條件的優(yōu)化

孟賢仁 - 謝明勇 - 聶少平 - 王君巧 -

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

啤酒是以大麥或小麥為主要原料，經(jīng)制麥、糖化和發(fā)酵等工藝釀制成的一種食品。制麥過程中，谷物發(fā)芽產(chǎn)生多種酶系(包含淀粉酶系中的α-淀粉酶和β-淀粉酶等)，其中淀粉酶在糖化過程中能夠有效地將淀粉及非淀粉多糖(主要為β-葡聚糖)轉(zhuǎn)化為葡萄糖、麥芽糖和低聚麥芽糖。發(fā)酵過程中，大部分小分子量的糖類會(huì)被酵母代謝轉(zhuǎn)化為乙醇和二氧化碳，但麥芽四糖和一些分子量較大的低聚麥芽糖仍保留在最終的產(chǎn)品中[1]。由于啤酒中的糖類模式會(huì)潛在影響啤酒最終的感官特性，因此需對(duì)啤酒體系中的糖類模式進(jìn)行監(jiān)測[2]。

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI TOF MS)是表征生物分子的強(qiáng)有力工具，具有高靈敏度、低樣品損耗和高通量等優(yōu)點(diǎn)[3]，并且已廣泛應(yīng)用于多肽[4]、蛋白質(zhì)[5]、脂質(zhì)[6]、碳水化合物[7]及原花青素[8]的結(jié)構(gòu)表征，但這些研究往往分析的是分離純化后的化學(xué)組分。近年來，基于MALDI TOF MS直接對(duì)食品中化學(xué)組分的表征成為新的研究熱點(diǎn)。Bonatto等[9]采集了多種巧克力的MALDI TOF MS譜圖，并提取其中潛在的可可代謝物的質(zhì)譜峰進(jìn)行聚類分析，可對(duì)含有不同可可含量的多種巧克力進(jìn)行區(qū)分。Qu等[10]研究發(fā)現(xiàn)純蜂蜜和摻假蜂蜜在MALDI TOF MS下的糖類模式具有差異，可利用MALDI TOF MS對(duì)蜂蜜中摻入高果糖玉米糖漿和玉米糖漿的摻假行為進(jìn)行高通量監(jiān)測。

在MALDI TOF MS分析中，基質(zhì)的選擇及樣品的制備至關(guān)重要。二羥基苯甲酸(DHB)是一種常用于糖類分析的基質(zhì)。Park等[11]采用3種DHB同分異構(gòu)體(2,4-DHB、2,5-DHB和2,6-DHB)作為基質(zhì)，系統(tǒng)地探討了不同條件下MALDI TOF MS對(duì)4種啤酒中寡糖的表征能力。但是2,5-DHB一般會(huì)在靶板圈點(diǎn)的周圍形成一層指向中心的針狀結(jié)晶，而圈點(diǎn)的中心不易形成結(jié)晶。這些不均一的結(jié)晶，使得需要在靶板上尋找理想的出峰“甜點(diǎn)”，不利于試驗(yàn)的重復(fù)性和便捷性。針對(duì)2,5-DHB的這一缺點(diǎn)，二元混合基質(zhì)的設(shè)計(jì)付諸實(shí)現(xiàn)。Karas等[12]將少量(約10%)的2-羥基-5-甲氧基苯甲酸混入2,5-DHB中，得到一種結(jié)晶更均一的“super DHB”基質(zhì)。Hsu等[13]研究發(fā)現(xiàn)2,4,6-三羥基苯乙酮(THAP)是一種能夠在較寬分子量范圍內(nèi)檢測多糖信號(hào)的基質(zhì)，適用于普魯蘭多糖、高分子葡聚糖和多聚唾液酸的分析。目前對(duì)啤酒中糖類的分析方法有熒光輔助糖電泳法[14]、高效陰離子交換色譜—脈沖安培檢測法[15]和高效液相色譜法[16]，但熒光輔助糖電泳法必須對(duì)糖衍生化后才能分析，因此操作麻煩。而色譜法大多耗時(shí)較長，不夠簡單快捷。并且上述研究[14-16]大都只分析到聚合度不超過7的寡糖，不能全面反映啤酒中糖類的組成情況。試驗(yàn)擬嘗試開發(fā)一種基于MALDI TOF MS定性分析啤酒中糖類的方法，以期該方法能夠簡便快捷地表征啤酒中聚合度>7的糖類。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

青島啤酒：產(chǎn)于山東省青島市；

南昌啤酒：產(chǎn)于江西省南昌市；

雪津啤酒：產(chǎn)于福建省莆田市；

烏蘇啤酒：產(chǎn)于江蘇省常州市；

2,5-DHB：色譜純，日本TCI公司；

super DHB、THAP：色譜純，美國Sigma-Aldrich公司；

乙腈：色譜純，德國Merck公司；

三氟乙酸：色譜純，阿拉丁試劑有限公司；

氯化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜：MALDI TOF/TOF 5800型，美國AB SCIEX公司；

分析天平：XS205型，美國Mettler-Toledo公司；

超純水儀系統(tǒng)：Milli-Q型，美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 啤酒的預(yù)處理 啤酒稀釋前，對(duì)啤酒進(jìn)行超聲脫氣1 h。脫氣后，分別用超純水將啤酒進(jìn)行梯度稀釋，得到啤酒原液、2倍稀釋液、4倍稀釋液、10倍稀釋液、100倍稀釋液和1 000倍稀釋液。

1.2.2 基質(zhì)的制備 將1 mg 2,5-DHB溶解于100 μL 乙腈/水溶液(體積比1∶1，含0.01%三氟乙酸)中，渦旋均勻，得到10 mg/mL 2,5-DHB基質(zhì)溶液。將1 mg super DHB溶解于100 μL 乙腈/水溶液(體積比1∶1，含0.01%三氟乙酸)中，渦旋均勻，得到10 mg/mL super DHB基質(zhì)溶液。將1 mg THAP溶解于100 μL 乙腈/水溶液(體積比1∶1，含0.01%三氟乙酸)中，渦旋均勻，得到10 mg/mL THAP基質(zhì)溶液。

用乙腈/水溶液(體積比1∶1，含0.01%三氟乙酸)溶解氯化鈉，配置得到濃度為2 mg/mL的氯化鈉溶液。將上述10 mg/mL THAP基質(zhì)溶液與2 mg/mL氯化鈉溶液按體積比2∶1混合后即可得到摻有鈉離子的THAP基質(zhì)溶液。

1.2.3 基質(zhì)和稀釋條件的優(yōu)化 點(diǎn)樣方法采用雙層法。將各濃度梯度的啤酒樣品分別與基質(zhì)溶液等體積混合，得到待測樣品溶液。取1 μL基質(zhì)溶液點(diǎn)在靶板上，待完全干燥后，再取1 μL待測樣品溶液點(diǎn)在基質(zhì)形成的結(jié)晶上。每個(gè)樣品做3次平行試驗(yàn)。待樣品完全干燥后，上機(jī)測試。

1.2.4 儀器的參數(shù) 激光源：Nd:YAG激光；采集方法：反射陽離子模式；激光強(qiáng)度：7 000；激光激發(fā)次數(shù)：500。

2 結(jié)果與分析

2.1 2,5-DHB為基質(zhì)的糖類定性分析

以2,5-DHB為基質(zhì)，MALDI TOF MS無法檢測到青島啤酒的原液、2倍稀釋液和4倍稀釋液中的糖類信號(hào)。如圖1所示，隨著對(duì)啤酒進(jìn)一步稀釋至10倍，MALDI TOF MS檢測到青島啤酒中一系列聚糖的加合鉀離子信號(hào)([Hexn+K]+)。相鄰聚合度糖類信號(hào)的質(zhì)荷比差值為162(一分子六碳糖與一分子水的相對(duì)分子質(zhì)量差值)，反映了這些聚糖都是由六碳糖聚合而成，其中[Hex15+K]+是檢測到的質(zhì)荷比最大的糖類信號(hào)。在對(duì)啤酒稀釋至100倍時(shí)，MALDI TOF MS檢測到青島啤酒中一系列聚糖的加合鈉離子信號(hào)([Hexn+Na]+)，其中 [Hex8+Na]+是檢測到的質(zhì)荷比最高的糖類信號(hào)。在對(duì)啤酒稀釋至1 000倍時(shí)，未采集到糖類信號(hào)。這可能是由于啤酒中的糖類濃度較低，已超出此條件下MALDI TOF MS的檢測限。由上述結(jié)果可知，當(dāng)以2,5-DHB為基質(zhì)，樣品稀釋10倍時(shí)，MALDI TOF MS表征青島啤酒中的糖類效果較好，能夠檢測到聚糖的最大聚合度為15。

2.2 Super DHB為基質(zhì)的糖類定性分析

以super DHB為基質(zhì)，MALDI TOF MS無法檢測到青島啤酒的原液和2倍稀釋液中的糖類信號(hào)。如圖2所示，在對(duì)啤酒稀釋至4倍和10倍時(shí)，MALDI TOF MS檢測到青島啤酒中一系列聚糖的加合鉀離子信號(hào)，其中[Hex9+K]+是檢測到質(zhì)荷比最高的糖類信號(hào)，并且相同聚合度的[Hexn+K]+信號(hào)在4倍稀釋條件下的信噪比均高于10倍稀釋的信噪比。在對(duì)啤酒稀釋至100倍時(shí)，MALDI TOF MS檢測到質(zhì)荷比最高的糖類信號(hào)是[Hex7+Na]+。由上述結(jié)果可知，當(dāng)以super DHB為基質(zhì)，樣品稀釋4倍時(shí)，MALDI TOF MS表征青島啤酒中的糖類效果一般，能夠檢測到聚糖的最大聚合度為9。

2.3 THAP為基質(zhì)的糖類定性分析

圖3為各濃度梯度的青島啤酒以THAP為基質(zhì)采集到的MALDI TOF MS譜圖。從圖3可看出，MALDI TOF MS能夠采集到青島啤酒6個(gè)稀釋樣品中的糖類信號(hào)。隨著對(duì)青島啤酒從原液逐步稀釋到10倍稀釋液，可檢測到啤酒中糖類聚合度增加，并且相同聚合度的[Hexn+K]+信噪比也均增加。如[Hex9+K]+信號(hào)在啤酒原液、2倍稀釋液、4倍稀釋液和10倍稀釋液中的信噪比分別為20.00，38.53，86.79，298.58。在對(duì)啤酒稀釋至10倍時(shí)，MALDI TOF MS能夠成功檢測到聚合度為18的糖信號(hào)([Hex18+K]+)。在對(duì)啤酒稀釋至100倍和1 000倍時(shí)，所能檢測到最大質(zhì)荷比的信號(hào)分別為[Hex13+Na]+和[Hex9+Na]+。這可能是啤酒中聚合度>4的聚糖中，聚合度高的糖類含量低于聚合度低的糖類含量[2]。隨著對(duì)啤酒的稀釋，啤酒中聚合度高的糖類濃度先降至檢測限以下，故而在高稀釋倍數(shù)下，較難檢測到啤酒中的聚合度較高的糖類。由上述結(jié)果可知，當(dāng)以THAP 為基質(zhì)，樣品稀釋10倍時(shí)，MALDI TOF MS表征青島啤酒中的糖類效果良好。

圖1 以2,5-DHB為基質(zhì)采集到的青島啤酒的10倍和100倍稀釋液的MALDI TOF MS譜圖Figure 1 MALDI TOF mass spectra of 10-fold and 100-fold dilutions of Tsingtao beer with 2,5-DHB as matrix

圖2 以super DHB為基質(zhì)采集到的不同濃度梯度下青島啤酒的MALDI TOF MS譜圖Figure 2 MALDI TOF mass spectra of different concentrations of Tsingtao beer with super DHB as matrix

值得注意是，MALDI TOF MS采集到啤酒原液、2倍稀釋液、4倍稀釋液和10倍稀釋液中的糖類信號(hào)主要為加合鉀離子信號(hào)。隨著對(duì)啤酒的稀釋倍數(shù)加大，啤酒的100倍稀釋液和1 000倍稀釋液中的糖類信號(hào)主要為加合鈉離子信號(hào)。其中可能的原因是在啤酒的稀釋倍數(shù)較低時(shí)，金屬離子的離子強(qiáng)度主導(dǎo)了糖類的金屬離子加合狀態(tài)[11]。啤酒中鉀離子的離子強(qiáng)度高于鈉離子的離子強(qiáng)度，啤酒中的糖類傾向于與離子強(qiáng)度大的鉀離子加合，故而MALDI TOF MS采集到啤酒原液、2倍稀釋液、4倍稀釋液和10倍稀釋液中的糖類信號(hào)主要為加合鉀離子信號(hào)。在稀釋倍數(shù)較高時(shí)，糖類與金屬離子的親和性差異主導(dǎo)了糖類的金屬離子加合狀態(tài)。Mauri等[2]研究發(fā)現(xiàn)糖類對(duì)鈉離子的親和性高于鉀離子的親和性。故而試驗(yàn)中MALDI TOF MS采集到啤酒100倍稀釋液和1 000倍稀釋液中的糖類信號(hào)主要為加合鈉離子信號(hào)。為驗(yàn)證在啤酒的稀釋倍數(shù)較低時(shí)是金屬離子的離子強(qiáng)度主導(dǎo)了糖類的金屬離子加合狀態(tài)，向THAP基質(zhì)溶液中加入氯化鈉溶液并與啤酒樣品混合后測試。結(jié)果顯示，MALDI TOF MS采集到青島啤酒原液、2倍稀釋液、4倍稀釋液和10倍稀釋液(圖4)中的糖類信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕羌雍镶c離子信號(hào)，確證了上述假設(shè)。

2.4 THAP應(yīng)用于其他啤酒中糖類的定性分析

通過比較上述3種基質(zhì)對(duì)啤酒中糖類的激光解吸電離能力，THAP是一種能夠支持MALDI TOF MS在6個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)對(duì)啤酒都采集到糖類信號(hào)的基質(zhì)，是電離效率最高的基質(zhì)。同時(shí)，比較3種基質(zhì)在各自較優(yōu)條件下采集的譜圖，以THAP為基質(zhì)采集到的譜圖中所能檢測到糖類的聚合度最大且具有較高的信噪比。THAP作為基質(zhì)的另一優(yōu)點(diǎn)是其形成的結(jié)晶較DHB和super DHB形成的更均一，無需在靶板上尋找理想的出峰“甜點(diǎn)”，有利于試驗(yàn)的重復(fù)性和便捷性。

圖3 以THAP為基質(zhì)采集到的不同濃度梯度下青島啤酒的MALDI TOF MS譜圖Figure 3 MALDI TOF mass spectra of different concentrations of Tsingtao beer with THAP as matrix

圖4 以摻有鈉離子的THAP為基質(zhì)采集到的青島啤酒的10倍稀釋液的MALDI TOF MS譜圖

Figure 4 MALDI TOF mass spectra of 10-fold dilution of Tsingtao beer with THAP containing Na+as matrix

此外，在以THAP為基質(zhì)，樣品稀釋10倍的條件下，試驗(yàn)還研究了另外3種市面上常見啤酒(南昌啤酒、雪津啤酒和烏蘇啤酒)的聚糖信號(hào)，結(jié)果如圖5所示，MALDI TOF MS檢測到南昌啤酒和雪津啤酒中聚合度最高為18的聚糖信號(hào)([Hex18+K]+)，且該信號(hào)的信噪比>10.00，分別為10.27和15.56；烏蘇啤酒檢測到聚糖的最大聚合度為19([Hex19+K]+)，信噪比為11.64。以上結(jié)果證實(shí)以THAP為基質(zhì)，啤酒樣品稀釋10倍的條件是MALDI TOF MS定性分析啤酒中糖類的較優(yōu)條件。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以2,5-DHB、super DHB和THAP為基質(zhì)，對(duì)啤酒樣品設(shè)置6個(gè)稀釋倍數(shù)，優(yōu)化了MALDI TOF MS對(duì)啤酒中糖類分析的試驗(yàn)條件。結(jié)果表明，THAP應(yīng)用于MALDI TOF MS對(duì)啤酒中糖類表征的能力優(yōu)于另外兩種基質(zhì)，在啤酒稀釋倍數(shù)為10倍時(shí)檢測到的聚合度能夠達(dá)到18。此條件下的MALDI TOF MS具有檢測到的糖類分子量范圍寬和信噪比高的優(yōu)點(diǎn)。

圖5 3種市面常見啤酒(南昌啤酒、雪津啤酒和烏蘇啤酒)的MALDI TOF MS譜圖

Figure 5 MALDI TOF mass spectra of three kinds of commercially available beers (Nanchang, Sedrin and Wusu beers)