短雙歧桿菌凍干保護(hù)劑的優(yōu)選及高密度凍干工藝優(yōu)化

蔣文鑫，崔樹茂，毛丙永，唐鑫，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

2001年，世界衛(wèi)生組織將益生菌定義為“當(dāng)攝入足夠的數(shù)量，給宿主帶來健康益處的活微生物”[1]。雙歧桿菌屬是具有益生菌特征的主要種屬之一，臨床研究證明雙歧桿菌是最有益的腸道微生物[2-3]。短雙歧桿菌是益生菌產(chǎn)品中常用的雙歧桿菌之一，它具有預(yù)防和治療兒科疾病，增強(qiáng)免疫，改善皮膚，預(yù)防肥胖等多種益生功能[4-6]。

為了增強(qiáng)益生菌的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，必須將其保存在水分大量減少的干燥狀態(tài)。因此，制備益生菌菌粉是首選方法，其干燥方式包括噴霧干燥、冷凍干燥、真空干燥和流化床干燥[7]。其中真空冷凍干燥，也稱作冷凍干燥，是將物料凍結(jié)到共晶點(diǎn)溫度以下，在低壓狀態(tài)下，通過升華除去物料中水分的一種干燥方法[8]，是近幾十年來最方便，應(yīng)用最廣泛，可提高益生菌貯存穩(wěn)定性的除水方法之一。與其他干燥方法相比，真空冷凍干燥技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)更為突出：低溫操作使各種成分的活性喪失少；菌種的形態(tài)得以保持；復(fù)水性好，能較快還原成干燥前的鮮活狀態(tài)；脫水徹底，易于保藏與運(yùn)輸，銷售方便[9]。目前，雙歧桿菌菌粉的制備主要采用真空冷凍干燥法。但是，雙歧桿菌在凍干過程中仍可能受到多種損傷，如機(jī)械損傷、溶質(zhì)損傷、膜損傷、蛋白質(zhì)變性(包括酶變性)和DNA損傷等，加入保護(hù)劑是降低凍干對(duì)菌株損傷的最佳策略之一[7,10-13]。目前文獻(xiàn)中報(bào)道的雙歧桿菌凍干保護(hù)劑主要有糖類、蛋白類和其他類小分子物質(zhì)，比較常見的保護(hù)劑為蔗糖、海藻糖、甘露醇、脫脂乳粉、抗壞血酸、微量元素等[4,7]。由于雙歧桿菌的耐受能力較差，現(xiàn)有的凍干保護(hù)劑效果都不好，凍干保護(hù)機(jī)理尚不明確。因此本文針對(duì)短雙歧桿菌所適用的凍干保護(hù)劑進(jìn)行系統(tǒng)的分析及優(yōu)化，進(jìn)而為雙歧桿菌的凍干保護(hù)提供思路。

目前雙歧桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)效率較低，且真空冷凍干燥是一個(gè)高能耗的過程。因此，如何降低能耗，提高每次凍干的產(chǎn)量是工業(yè)化生產(chǎn)中面臨的極大挑戰(zhàn)。針對(duì)這種挑戰(zhàn)，在凍干前提高樣品的濃度，可以減小凍干體積，提高單位凍干面積的產(chǎn)量，即高密度凍干，從而降低工作能耗。但是，如何在保證凍干存活率的條件下提高樣品的濃度，是實(shí)現(xiàn)雙歧桿菌高密度凍干的難點(diǎn)。本研究在實(shí)驗(yàn)所得的短雙歧桿菌最佳凍干保護(hù)配方的基礎(chǔ)上，優(yōu)化凍干前樣品的干物質(zhì)配比及質(zhì)量分?jǐn)?shù)，進(jìn)而獲得最佳的高密度凍干方案，實(shí)現(xiàn)降低能耗的目的。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 菌株

短雙歧桿菌CCFM 683(BifidobacteriumbreveCCFM 683)，由江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心保藏。

1.1.2 試劑

MRS-L培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，吐溫80 1 mL，K2HPO42.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，MnSO4·7H2O 0.05 g，半胱氨酸磷酸鹽1 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4，115 ℃滅菌20 min，原料均購自國(guó)藥集團(tuán)。

半胱氨酸磷酸鹽緩沖液(Cys緩沖液)：L-半胱氨酸磷酸鹽0.5 g，KH2PO46.0 g，Na2HPO44.5 g，NaCl 4.0 g，吐溫80 0.6 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8～7.0，115 ℃滅菌20 min，原料均購自國(guó)藥集團(tuán)。

保護(hù)劑：海藻糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖、山梨糖醇等試劑,均購自創(chuàng)賽生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AW500SG-7152厭氧工作站，英國(guó)依萊泰科公司；FE20 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；EL3002電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MS-3-basic渦旋振蕩器，德國(guó)IKA公司；MLS-3750高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；ZHJH-C1115B超凈工作臺(tái)，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；LYOBETA-5PS凍干機(jī)，西班牙Telstar公司；RC-BIOS10落地式離心機(jī)，賽默飛世爾公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株活化與培養(yǎng)

用接種環(huán)蘸取保菌管中的菌液在MRS-L平板上劃線，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落至MRS-L液體試管中，置于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)18～22 h。將菌液以體積分?jǐn)?shù)為5%的接種量連續(xù)活化3次后，獲取菌株培養(yǎng)液用于試驗(yàn)。

1.3.2 短雙歧桿菌的凍干

以體積分?jǐn)?shù)為5%的接種量接菌至MRS-L培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)18～22 h后，8 000×g， 4 ℃，離心15 min，棄去上清液。將菌泥與無菌生理鹽水以質(zhì)量比1∶1混勻后，調(diào)節(jié)pH至6.5左右制得菌懸液，再將菌懸液與保護(hù)劑溶液以體積比2∶1混合，充分混勻后吸取1 mL分裝至凍干瓶?jī)龈伞?/p>

凍干工藝：預(yù)凍，控制層板1 h內(nèi)降溫至-50 ℃，保持4 h；一次干燥，控制層板1.3 h升溫至-30 ℃，保持30 h；二次干燥，控制層板1 h升溫至25 ℃，保持20 h。

1.3.3 保護(hù)劑溶液的配制

1.3.3.1 單一保護(hù)劑溶液的配制

分別稱取定量的糖(醇)類、蛋白類等各種保護(hù)劑，加入定量的水溶解，制得質(zhì)量濃度為200 g/L的保護(hù)劑溶液。

1.3.3.2 復(fù)合保護(hù)劑溶液的配制

復(fù)合保護(hù)劑中各組分按比例復(fù)配，維持保護(hù)劑溶液的質(zhì)量濃度恒為200 g/L。

(1)糖類復(fù)合保護(hù)劑溶液

保護(hù)劑A(2種保護(hù)劑質(zhì)量比1∶1復(fù)配)：將2種糖類復(fù)配且兩者質(zhì)量比為1∶1，即每種糖的質(zhì)量濃度為100 g/L。

保護(hù)劑B(3種保護(hù)劑質(zhì)量比1∶1∶1復(fù)配)：將3種糖類復(fù)配且3者質(zhì)量比為1∶1∶1，即每種糖的質(zhì)量濃度為67 g/L。

(2)糖類復(fù)合蛋白類保護(hù)劑溶液

保護(hù)劑C(糖類與蛋白類質(zhì)量比為1∶1)：最優(yōu)糖類保護(hù)劑100 g/L，蛋白類100 g/L。

保護(hù)劑D(糖類與蛋白類質(zhì)量比為3∶1)：最優(yōu)糖類保護(hù)劑150 g/L，蛋白類50 g/L。

(3)最優(yōu)復(fù)合保護(hù)劑復(fù)配其他小分子類保護(hù)劑

前面優(yōu)化得到的最優(yōu)復(fù)合保護(hù)劑分別添加MnSO410 g/L、MgSO420 g/L，抗壞血酸30 g/L，谷胱甘肽15 g/L，L-酪氨酸15 g/L，甜菜堿0.4 g/L，復(fù)合保護(hù)劑溶液的總質(zhì)量濃度為200 g/L。

1.3.4 短雙歧桿菌的高密度凍干

稱取定量的菌泥置于烘箱中烘干，稱量干燥后的物質(zhì)質(zhì)量，換算可得每克菌泥中的干物質(zhì)含量。稱取定量的菌泥與保護(hù)劑，按照菌泥干物質(zhì)與保護(hù)劑1∶1、1∶1.2的質(zhì)量比，分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、20%、25%的樣品，充分混勻后吸取1 mL分裝至凍干瓶?jī)龈?，凍干工藝?.3.2。

1.3.5 活菌計(jì)數(shù)[14-15]

1.3.5.1 凍干前活菌計(jì)數(shù)

吸取0.5 mL凍干前樣品至4.5 mL Cys緩沖液中進(jìn)行10倍稀釋，重復(fù)以上步驟，稀釋至合適梯度。吸取1 mL稀釋后的樣品于無菌平板中，傾注適量的MRS-L固體培養(yǎng)基混合均勻，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，待凝固后倒置于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h。

1.3.5.2 凍干后活菌計(jì)數(shù)

在凍干后的樣品中加入定量的無菌水，使其復(fù)水至凍干前的質(zhì)量，活菌計(jì)數(shù)操作同凍干前。

1.3.6 凍干存活率的測(cè)定[16]

(1)

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行，使用SPSS Statistics 26.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行ANOVA判斷(Tukey’s檢驗(yàn))，P<0.05認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類凍干保護(hù)劑的保護(hù)特性

依據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道，凍干保護(hù)劑按照滲透性分為可滲透類、半滲透類和不滲透類3種[9,17]：甘油等可滲透化合物使細(xì)胞膜更具可塑性，并與水結(jié)合，從而抑制過度脫水，防止細(xì)胞在冷凍過程中形成冰晶[18]；小分子糖等半滲透化合物在冷凍前誘導(dǎo)細(xì)胞的質(zhì)壁分離，并集中在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間作為冰生長(zhǎng)的緩沖層，與細(xì)胞膜磷脂和蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵相互作用，代替極性基團(tuán)周圍失去的氫鍵結(jié)合水，為膜提供機(jī)械保護(hù)[19]；大分子糖及蛋白質(zhì)等不滲透化合物吸附在細(xì)胞表面，形成一個(gè)保護(hù)層，通過增加溶液黏度來抑制冰的生長(zhǎng)速度，同時(shí)減少與氧的接觸[9,20]。目前關(guān)于雙歧桿菌凍干保護(hù)劑的文獻(xiàn)多為少數(shù)幾種保護(hù)劑之間的對(duì)比，沒有系統(tǒng)地分析雙歧桿菌凍干保護(hù)劑之間的差異。本試驗(yàn)將文獻(xiàn)報(bào)道中常見的糖(醇)類、蛋白類保護(hù)劑按照不同的分子質(zhì)量進(jìn)行分類，以凍干后活菌數(shù)和存活率為依據(jù)，系統(tǒng)分析不同結(jié)構(gòu)不同分子質(zhì)量不同性質(zhì)的保護(hù)劑對(duì)短雙歧桿菌的凍干保護(hù)差異。

由表1可知，與空白對(duì)照組相比，除赤蘚糖醇的凍干存活率為(1.27±0.57)%，其余保護(hù)劑的凍干存活率均有所提高。糖(醇)類保護(hù)劑的凍干存活率普遍高于蛋白類凍干保護(hù)劑，且結(jié)構(gòu)大小低于三糖的小分子糖對(duì)短雙歧桿菌的凍干保護(hù)效果較好。其中，棉子糖的凍干存活率最高，為(53.22±3.55)%，山梨糖醇的存活率僅次于棉子糖，凍干存活率為(46.13±5.55)%。

2.2 糖類復(fù)合保護(hù)劑的保護(hù)效果

山梨糖醇被用作凍干保護(hù)劑的研究較多，其保護(hù)機(jī)理[20-22]主要有：(I)替代水并與膜磷脂中的磷酸基團(tuán)相互作用；(II)提供高的滲透應(yīng)力，高滲透脅迫誘導(dǎo)熱休克蛋白基因表達(dá)，熱休克蛋白可維持膜結(jié)合酶

表1 短雙歧桿菌在不同種類保護(hù)劑中的凍干存活率Table 1 The freeze-drying survival rate ofB.breve in different protectants

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

和膜的完整性；(III)穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，形成山梨醇蛋白復(fù)合物；(IV) 抗氧化特性可防止脂質(zhì)氧化。棉子糖作為三糖，含有多個(gè)羥基，在凍干過程中除去水后，棉子糖的羥基基團(tuán)可以代替水分子，細(xì)胞膜的極性頭通過氫鍵與棉子糖的羥基直接相互作用，從而減少菌體在凍干過程中受到的損傷[7]。另外，ACHMAD等[23]研究發(fā)現(xiàn)，短雙歧桿菌在棉子糖上的生長(zhǎng)要優(yōu)于其他測(cè)試的可發(fā)酵糖。作為可被高效利用的三糖，棉子糖亦有可能在與菌體混合時(shí)被快速轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)進(jìn)行積累，在胞內(nèi)、胞外同時(shí)保護(hù)菌體減少凍干損傷。綜合討論，山梨糖醇與棉子糖除了共同的保護(hù)機(jī)制外，還有其他不同的潛在提高凍干保護(hù)的機(jī)制，因此將二者進(jìn)行復(fù)配，研究其對(duì)短雙歧桿菌的凍干保護(hù)效果。

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(圖1)，山梨糖醇與棉子糖復(fù)配后，相較于單一保護(hù)劑，凍干存活率有顯著性提高。這說明山梨糖醇與棉子糖的保護(hù)機(jī)理確有不同之處。將山梨糖醇與棉子糖復(fù)配后作為凍干保護(hù)劑，2者可以從多方面保護(hù)短雙歧桿菌，進(jìn)一步提高單一保護(hù)劑的凍干保護(hù)效果。綜合以上因素，我們將山梨糖醇和棉子糖作為與蛋白類復(fù)配的優(yōu)勢(shì)保護(hù)劑。

圖1 短雙歧桿菌在糖類復(fù)合保護(hù)劑中的凍干存活率Fig.1 Freeze-drying survival rate of B. breve in carbohydrate compound protectant注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 復(fù)配蛋白類保護(hù)劑的保護(hù)效果

蛋白質(zhì)與糖類的不同性質(zhì)會(huì)產(chǎn)生不同的保護(hù)特性。小分子糖作為一種半透膜化合物，可在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間聚集。而蛋白質(zhì)作為一種非滲透性化合物，主要吸附在細(xì)胞表面[20]。如脫脂乳，在細(xì)胞與蛋白之間的疏水相互作用過程中，在細(xì)胞表面形成一層保護(hù)層，從而保護(hù)細(xì)胞[24]。雖然蛋白類物質(zhì)作為單一保護(hù)劑時(shí)，保護(hù)效果并不好(表1)，但是基于其與糖類保護(hù)劑具有不同的保護(hù)機(jī)理，將糖類和蛋白類保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)配時(shí)，可能會(huì)從多方面保護(hù)雙歧桿菌，從而提高菌株的存活率。同時(shí)，蛋白類保護(hù)劑不僅可以在凍干過程中為細(xì)胞提供保護(hù)層，還可以使凍干產(chǎn)品形成多孔結(jié)構(gòu)，使復(fù)水更容易，更利于應(yīng)用于生產(chǎn)當(dāng)中[20]。因此，我們將糖類復(fù)合保護(hù)劑與蛋白類物質(zhì)按照不同比例復(fù)配，考察糖類保護(hù)劑與蛋白類保護(hù)劑復(fù)配是否會(huì)提高對(duì)菌體的凍干保護(hù)效果。

由圖2可知，添加蛋白并沒有像預(yù)期的那樣提高雙歧桿菌的凍干保護(hù)效果，但少量添加蛋白類物質(zhì)可確保糖類復(fù)合保護(hù)劑保護(hù)效果不會(huì)降低(4組和5組沒有顯著差異)。但是若只添加糖類保護(hù)劑，凍干后的樣品質(zhì)地較硬且不易粉碎成粉劑，而添加一定比例的蛋白可提高菌粉的疏松度，更利于凍干粉劑的成型。綜合考慮，將糖類復(fù)合保護(hù)劑與膠原蛋白以質(zhì)量比3∶1復(fù)配后的保護(hù)劑作為優(yōu)勢(shì)保護(hù)劑，進(jìn)一步研究與其他小分子物質(zhì)復(fù)配后對(duì)短雙歧桿菌的凍干保護(hù)效果。

1-m(山梨糖醇+棉子糖)∶m(乳清蛋白)=1∶1；2-m(山梨糖醇+棉子糖)∶m(乳清蛋白)=3∶1；3-m(山梨糖醇+棉子糖)∶m(膠原蛋白)=1∶1；4-m(山梨糖醇+棉子糖)∶m(膠原蛋白)=3∶1；5-山梨糖醇+棉子糖；6-膠原蛋白；7-乳清蛋白圖2 短雙歧桿菌在復(fù)配蛋白類保護(hù)劑中的凍干存活率Fig.2 Freeze-drying survival rate of B. breve inthe compound of protein protectants

2.4 復(fù)配其他小分子對(duì)菌株的凍干保護(hù)效果

除了糖(醇)類、蛋白類物質(zhì)可提高菌株的凍干存活率外，也有其他小分子對(duì)菌株的凍干保護(hù)效果的報(bào)道。例如，抗壞血酸等抗氧化劑可能延緩膜磷脂的自氧化作用[25]；甜菜堿可以在干燥過程中穩(wěn)定蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜在滲透脅迫條件下造成的低水分活度[26]；L-酪氨酸等氨基酸可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，起到胞內(nèi)緩沖作用[20]；谷胱甘肽能夠保護(hù)菌株在冷凍脅迫過程中的細(xì)胞完整性和平滑度并提高細(xì)胞膜不飽和脂肪酸成分的比例[27]；MnSO4作為緩沖鹽，能夠滲透到細(xì)胞內(nèi)部從而調(diào)節(jié)菌體內(nèi)部理化平衡，同時(shí)可與其他保護(hù)劑產(chǎn)生聯(lián)合作用[28]。因此，我們將這幾種小分子物質(zhì)與前期確定的復(fù)合保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)配，進(jìn)一步驗(yàn)證這些物質(zhì)是否會(huì)優(yōu)化已有配方的凍干保護(hù)效果。

由圖3可知，這些小分子物質(zhì)并沒有像文獻(xiàn)中報(bào)道的那樣顯示出提高復(fù)合保護(hù)劑的凍干保護(hù)效果。相較于不添加小分子物質(zhì)的對(duì)照組，除了加入MnSO4和MgSO4的保護(hù)劑組別凍干存活率有所降低，其他組別的凍干存活率與對(duì)照組沒有顯著差別。說明這些物質(zhì)在短雙歧桿菌的凍干過程中并無明顯保護(hù)效果。

1-復(fù)合保護(hù)劑+硫酸錳+硫酸鎂；2-復(fù)合保護(hù)劑+抗壞血酸；3-復(fù)合保護(hù)劑+谷胱甘肽；4-復(fù)合保護(hù)劑+L-酪氨酸；5-復(fù)合保護(hù)劑+甜菜堿；6-復(fù)合保護(hù)劑圖3 短雙歧桿菌在復(fù)配其他小分子中的凍干存活率Fig.3 Freeze-drying survival rate of B. breve in the compound of other small molecules

2.5 短雙歧桿菌的高密度凍干優(yōu)化

隨著人們對(duì)雙歧桿菌功能的深入了解，雙歧桿菌已經(jīng)具有越來越多的商業(yè)價(jià)值。如何提高產(chǎn)量、降低能耗便是眾多企業(yè)的關(guān)注焦點(diǎn)。目前的研究多為從菌株高密度培養(yǎng)進(jìn)行探究，鮮有從樣品濃度方面探究如何降低生產(chǎn)成本。菌泥與保護(hù)劑的配比、凍干樣品的干物質(zhì)含量是實(shí)現(xiàn)高密度凍干的關(guān)鍵因素。因此，本試驗(yàn)設(shè)定了幾組不同的干物質(zhì)比例與質(zhì)量分?jǐn)?shù)，研究不同方案的凍干效果。

由表2可見，菌泥干物質(zhì)與保護(hù)劑的質(zhì)量比為1∶1.2，樣品干物質(zhì)總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，短雙歧桿菌的凍干存活率最高。這說明，當(dāng)保護(hù)劑比菌泥干物質(zhì)多時(shí)，每個(gè)活菌體被保護(hù)劑保護(hù)的程度更高。該種方案下，保護(hù)劑由山梨糖醇、棉子糖與膠原蛋白以質(zhì)量比3∶3∶2組成。相較于目前工廠常用的15%～20%的干物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，該方案提高了每次凍干機(jī)運(yùn)行的產(chǎn)量，降低了同生產(chǎn)量的能耗。短雙歧桿菌的凍干存活率接近80%，凍干粉活菌數(shù)高達(dá)16 100億，即(1.61±0.27)×1012CFU/g。

表2 短雙歧桿菌在高密度凍干中的存活率Table 2 High density freeze-drying survival rate ofB. breve

3 結(jié)論

(1)糖(醇)類保護(hù)劑的凍干存活率普遍高于蛋白類保護(hù)劑，三糖及以下的小分子糖對(duì)短雙歧桿菌的凍干保護(hù)效果較好，棉子糖和山梨糖醇的凍干保護(hù)效果最好。

(2)棉子糖與山梨糖醇復(fù)配后會(huì)進(jìn)一步提高單一保護(hù)劑的凍干保護(hù)效果。

(3)添加蛋白類物質(zhì)不會(huì)增強(qiáng)糖類物質(zhì)對(duì)短雙歧桿菌的凍干保護(hù)效果，但適量添加可提高菌粉的疏松度。

(4)復(fù)合保護(hù)劑中添加MgSO4、MnSO4、谷胱甘肽、抗壞血酸、L-酪氨酸、甜菜堿不會(huì)顯著提升保護(hù)劑對(duì)短雙歧桿菌的凍干保護(hù)效果。

(5)保護(hù)劑由山梨糖醇、棉子糖與膠原蛋白以質(zhì)量比3∶3∶2組成，菌泥干物質(zhì)與保護(hù)劑的質(zhì)量比為1∶1.2，樣品干物質(zhì)總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，短雙歧桿菌的凍干存活率接近80%，凍干粉活菌數(shù)高達(dá) 16 100億，即(1.61±0.27)×1012CFU/g。