鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Gdt1過表達(dá)對釀酒酵母蛋白酶A胞外分泌的影響

宋露露，劉小航，郭學(xué)武，陳葉福*，肖冬光*

1(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))，天津，300457)2(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)

釀酒酵母蛋白酶A(saccharopepsin; EC 3.4.23.25)是一種定位于液泡的水解酶，在胞內(nèi)蛋白的成熟、激活以及多倍體酵母生孢等生理生化過程中起著重要作用[1-3]。然而，在脅迫條件下，酵母細(xì)胞會(huì)分泌蛋白酶A到細(xì)胞外[4-6]。對于啤酒而言，釀酒酵母分泌到發(fā)酵液中的蛋白酶A會(huì)降解泡沫陽性蛋白-脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白LTP1，從而降低啤酒的泡沫穩(wěn)定性，影響啤酒的感官質(zhì)量[7-9]。因此，降低釀酒酵母細(xì)胞中蛋白酶A的外泌，可以有效地提高啤酒泡沫穩(wěn)定性。

蛋白酶A由PEP4基因編碼，PEP4基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯后，在核糖體上合成前蛋白酶A原[2]。前蛋白酶A原經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體修飾后，形成了蛋白酶A原。蛋白酶A原在反面高爾基體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(trans-Golgi network，TGN)中被液泡分選受體識(shí)別并結(jié)合，引導(dǎo)其轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡內(nèi)，最終蛋白酶A原在液泡中通過自我激活或者是蛋白酶B的作用下形成成熟的蛋白酶A[1,10]。酵母細(xì)胞中的液泡分選受體有多種，其中最典型的是液泡分選受體Vps10(I型跨膜受體蛋白)[11-13]。最初發(fā)現(xiàn)Vps10定位于晚期高爾基體腔室(the late Golgi compartment)，能正確分選羧肽酶Y定位于液泡[13]。研究表明，通過提高Vps10的表達(dá)水平可以促進(jìn)更多的蛋白酶A被分選到液泡中，從而降低了蛋白酶A的胞外分泌水平[14]。由此可知，加強(qiáng)蛋白酶A的液泡分選是減少蛋白酶A胞外分泌的一種有效方法。

KIENZLE和VON BLUME等[15]提出一條不同于受體介導(dǎo)的分選途徑的新的分選途徑，這條分選途徑分選蛋白依靠的是TGN腔內(nèi)Ca2+瞬時(shí)增加；哺乳動(dòng)物細(xì)胞中TGN上的SPCA1(secretory pathway calcium ATPase 1)可以誘導(dǎo)更多的Ca2+流入TGN腔內(nèi)，導(dǎo)致TGN腔內(nèi)Ca2+瞬時(shí)增加，間接促進(jìn)蛋白的分選。Pmr1是高爾基體膜上的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它是SPCA1的酵母同源物，也影響液泡蛋白的分選[16]。酵母細(xì)胞中缺失Pmr1后，原本定位于液泡的羧肽酶Y被分選到液泡的時(shí)間被延長，最終導(dǎo)致羧肽酶Y異常分泌到細(xì)胞外[16]。實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)研究表明，Pmr1缺失阻礙部分蛋白酶A被運(yùn)輸?shù)揭号葜?，加?qiáng)了蛋白酶A的胞外分泌；Pmr1過表達(dá)促進(jìn)了蛋白酶A的液泡分選，降低蛋白酶A的胞外分泌水平[17]。除了Pmr1，還有另一個(gè)定位于高爾基體的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Gdt1(由GDT1基因編碼)，與Pmr1功能相同，參與調(diào)控高爾基體和細(xì)胞質(zhì)中的鈣離子水平[18-19]。推測，Gdt1可能也影響蛋白酶A的液泡分選，間接影響蛋白酶A的胞外分泌?；谝陨辖Y(jié)果，本研究以W303-1A為親本菌株，將親本菌株中的Gdt1進(jìn)行過表達(dá)，以此來調(diào)控蛋白酶A的液泡分選，探究鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Gdt1對蛋白酶A胞外分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究所用的菌株和質(zhì)粒歸納于表1。

表1 本研究所用菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in the this study

1.1.2 主要培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉 5，蛋白胨 10，NaCl 10，使用時(shí)添加氨芐青霉素使其最終質(zhì)量濃度為0.1 g/L。

YEPD(yeast extract peptone dextrose)培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20。向其中添加G418使其最終質(zhì)量濃度為0.8 g/L，用來篩選GDT1過表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化子。

配制以上LB和YEPD固體培養(yǎng)基時(shí)，添加20 g/L瓊脂粉即可。

低氮麥芽汁培養(yǎng)基：粉碎的麥芽和水的混合物(料水比為1∶4)于65 ℃糖化至碘檢完畢，時(shí)間大約為1 h左右；過濾后煮沸1 h：再次過濾后用糖度計(jì)調(diào)節(jié)表觀糖度為5 °Brix，然后向其中添加葡萄糖調(diào)節(jié)其表觀糖度為10 °Brix。

以上所有培養(yǎng)基的滅菌條件均為：115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑和酶

合成多肽(MOAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu(Dnp)-NH2)，委托南京萊昂生物科技有限公司合成；氨芐青霉素和遺傳霉素(G418)，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PCR純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒，購自美國Omega公司。

限制性內(nèi)切酶BglII、LATaq和PrimerSTAR DNA聚合酶，購自大連TaKaRa公司；閃電克隆試劑盒，購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要儀器和設(shè)備

垂直流超凈工作臺(tái)(ZHJH-C1115B)和搖床(ZWY-2102C)，上海智城分析儀器制造有限公司；生化培養(yǎng)箱(LRH-250A)，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)(UV-1200)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；熒光分光光度計(jì)(RF-5301)，日本島津公司；StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國ABI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(http: // www. ncbi. nlm. nih. gov/)中S.cerevisiaeS288c菌株的基因組序列、質(zhì)粒pUG6中的KanMX基因序列和質(zhì)粒YEp-P的DNA序列，設(shè)計(jì)用于過表達(dá)GDT1基因的引物，見表2。

表2 用于過表達(dá)GDT1基因的引物aTable 2 Primers used for GDT1 overexpression

注：a下劃線表示相鄰兩片段之間～50 bp的重疊序列，加粗堿基表示限制性酶切位點(diǎn)BglII

1.2.2 大腸桿菌(E.coli.DH5α)的轉(zhuǎn)化

將經(jīng)酶切線性化的質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增獲得的片段通過閃電克隆試劑盒進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到E.coli.DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。通過質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒并且進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

1.2.3 釀酒酵母(W303-1A)的轉(zhuǎn)化

通過醋酸鋰(LiAc)轉(zhuǎn)化法[20]將構(gòu)建GDT1基因過表達(dá)菌株所需的片段轉(zhuǎn)化入W303-1A中，通過含有G418抗性的YEPD平板篩選轉(zhuǎn)化子，用酵母基因組DNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)化子的基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.4 啤酒發(fā)酵工藝

從斜面上挑取1環(huán)釀酒酵母菌株接入到裝有5 mL 10 °P麥汁的玻璃試管中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h；將試管中培養(yǎng)好的菌液倒入裝有50 mL 10 °P麥汁的三角瓶中，16 ℃靜置培養(yǎng)36～72 h至菌株達(dá)到對數(shù)期后期；以10%接種量接入到裝有135 mL 10 °P麥汁發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，16 ℃靜置發(fā)酵，每隔24 h稱重，當(dāng)2 d之間的質(zhì)量相差小于0.1 g，發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵期間取樣，取樣時(shí)間為0、1、3、5、7 d，測定生物量、碳源消耗、氮源消耗；當(dāng)發(fā)酵結(jié)束后測定乙醇體積分?jǐn)?shù)、剩余還原糖含量以及蛋白酶A的胞內(nèi)外活力。

1.3 分析方法

1.3.1GDT1基因的mRNA水平測定

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)法[4]檢測基因GDT1的相對表達(dá)量。

1.3.2 生物量的測定

采用比濁法測定生物量。發(fā)酵過程中取樣，每次取1 mL菌液，12 000 r/min離心1 min，去上清液后用蒸餾水水洗2次，稀釋菌液到合適的濃度。以蒸餾水為空白對照，600 nm下測定菌液的吸光值。以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。

1.3.3 表觀糖度的測定

采用手持糖度折光儀測定發(fā)酵過程中表觀糖度的變化。

1.3.4 α-氨基氮含量的測定

采用茚三酮比色法測定發(fā)酵過程中α-氨基氮的含量變化[21]。

1.3.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)的測定

采用GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》中的密度瓶法(標(biāo)溫20 ℃)測定。

1.3.6 還原糖的測定

采用斐林試劑法測定發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液中還原糖的含量。

1.3.7 蛋白酶A活力的測定

采用KONDO等報(bào)道的熒光底物法[22]測定蛋白酶A活力。

在每支測樣玻璃試管中分別加入1 370 μL蒸餾水、1 500 μL Na2HPO4-C6H8O7緩沖液和100 μL待測樣品；在避光的條件下，向上述混合液中加入12 μL熒光底物，混勻后將試管放入37 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min；30 min后，取出測樣玻璃試管并加入18 μL NaOH (0.5 mol/L)終止反應(yīng)；用熒光分光光度計(jì)測定蛋白酶A的活力(測量時(shí)，設(shè)定分光光度計(jì)的參數(shù)為Ex=328 nm，Em=393 nm，狹縫寬度為1.5 nm)。

2 結(jié)果與討論

2.1 鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Gdt1過表達(dá)菌株的構(gòu)建

2.1.1 重組質(zhì)粒YEp-P-GDT1的構(gòu)建

以親本菌株的基因組為模板，用表2中的引物GDT1-F/GDT1-R擴(kuò)增獲得GDT1基因片段。限制性內(nèi)切酶BglⅡ單酶切質(zhì)粒YEp-P，使之線性化。用閃電克隆試劑盒將經(jīng)BglⅡ酶切線性化的載體YEp-P與GDT1基因片段進(jìn)行連接。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到E.coliDH5α感受態(tài)中進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建質(zhì)粒YEp-P-GDT1，構(gòu)建過程如圖1所示。

圖1 質(zhì)粒YEp-P-GDT1的構(gòu)建流程Fig.1 The flow chart of the plasmid YEp-P-GDT1construction

用限制性內(nèi)切酶BglⅡ單酶切質(zhì)粒YEp-P-GDT1，然后對酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。YEp-P-GDT1質(zhì)粒經(jīng)BglⅡ酶切后出現(xiàn)2條條帶，大小分別與BglⅡ酶切線性化的質(zhì)粒YEp-P大小(6 950 bp)以及與BglⅡ酶切的GDT1基因片段大小(853 bp)相同，表明質(zhì)粒YEp-P-GDT1構(gòu)建成功。

M-DL15 000 DNA marker；1-YEp-P質(zhì)粒的BglⅡ酶切結(jié)果；2-YEp-P-GDT1質(zhì)粒的BglⅡ酶切結(jié)果圖2 質(zhì)粒YEp-P-GDT1的驗(yàn)證Fig.2 The verification of the plasmid YEp-P-GDT1

2.1.2 Gdt1過表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化子的獲得及驗(yàn)證

過表達(dá)親本菌株W303-1A中的GDT1基因用的是同源重組依賴型DNA組裝法。

PCR擴(kuò)增獲得構(gòu)建GDT1基因過表達(dá)菌株所需片段：GDT1+A(GDT1基因的上同源臂，以親本菌株基因組為模板，用引物GDT1+A-F/GDT1+A-R擴(kuò)增)，Kan+GDT1(loxP-KanMX-loxP，以pUG6質(zhì)粒為模板，用引物Kan+GDT1-F/Kan+GDT1-R擴(kuò)增)，P+GDT1(PGK1p-GDT1-PGK1t，以YEp-P-GDT1質(zhì)粒為模板，用引物P+GDT1-F/P+GDT1-R擴(kuò)增)和GDT1+B(GDT1基因的下同源臂，以親本菌株基因組模板，用引物GDT1+B-F/GDT1+B-R擴(kuò)增)。所得片段與預(yù)期大小一致(如圖3)，表明過表達(dá)GDT1基因所需片段正確。

M-DL5000 DNA marker；1-GDT1+A(1 025 bp)；2-Kan+GDT1(1 661 bp)；3-P+GDT1(2 670 bp)；4-GDT1+B(1 026 bp) 圖3 過表達(dá)GDT1基因所需DNA片段準(zhǔn)備Fig.3 Preparing of the DNA fragments used for GDT1overexpression

將以上片段通過LiAc轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到親本菌株感受態(tài)中，經(jīng)過G418抗性YPD平板篩選獲得轉(zhuǎn)化子，對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示。以過表達(dá)GDT1基因轉(zhuǎn)化子的基因組為模板，(A+K)+GDT1-F/(A+K)+GDT1-R、Kan+P-F/Kan+P-R和(P+B)+GDT1-F/(P+B)+GDT1-R為引物分別擴(kuò)增出1 642、1 493和1 201 bp大小的條帶，與驗(yàn)證引物預(yù)期擴(kuò)增的片段大小一致；將上述PCR擴(kuò)增體系中的轉(zhuǎn)化子基因組替換為親本菌株基因組，擴(kuò)增不到產(chǎn)物，說明GDT1基因過表達(dá)菌株構(gòu)建成功，將其命名為W+GDT1。

M-DL5000 DNA marker；1-以(A+K)+GDT1-F/(A+K)+GDT1-R為引物，從W+GDT1的基因組上擴(kuò)增得到的產(chǎn)物(1 642 bp)；2-以(A+K)+GDT1-F/(A+K)+GDT1-R為引物，從親本株基因組上擴(kuò)增得到的結(jié)果；3-以Kan+P-F/Kan+P-R為引物，從W+GDT1的基因組上擴(kuò)增得到的產(chǎn)物(1 493 bp)；4-以Kan+P-F/Kan+P-R為引物，從親本株基因組上擴(kuò)增得到的結(jié)果；5-以(P+B)+GDT1-F/(P+B)+GDT1-R為引物，從W+GDT1的基因組上擴(kuò)增得到的產(chǎn)物(1 201 bp)；6，以(P+B)+GDT1-F/(P+B)+GDT1-R為引物，從親本株基因組上擴(kuò)增得到的結(jié)果圖4 過表達(dá)GDT1轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證Fig.4 The PCR verification of the transformants harboringGDT1 overexpression

2.1.3 Gdt1過表達(dá)菌株中GDT1基因轉(zhuǎn)錄水平的測定

測定菌株W+GDT1中Gdt1的相對表達(dá)水平來考察過表達(dá)GDT1基因?qū)dt1蛋白表達(dá)量的影響(結(jié)果見圖5)。過表達(dá)GDT1后，與親本菌株相比，菌株W+GDT1中GDT1的相對表達(dá)水平提高了23.41倍。說明過表達(dá)GDT1基因的確提高了菌株中GDT1基因的轉(zhuǎn)錄水平。

圖5 GDT1基因的相對表達(dá)水平Fig.5 The relative expression level of GDT1

2.2 鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Gdt1過表達(dá)對蛋白酶A胞外分泌的影響

為了考察Gdt1是否也同Pmr1一樣，在蛋白酶A的液泡分選過程中起相同的作用，將Gdt1過表達(dá)菌株W+GDT1、Pmr1過表達(dá)菌株W+PMR1以及親本菌株W303-1A同時(shí)在低氮脅迫條件下進(jìn)行發(fā)酵，然后測定了其胞內(nèi)外蛋白酶A活力(結(jié)果見圖6)。

圖6 發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌株W+GDT1、W+PMR1和W303-1A的蛋白酶A活力Fig.6 PrA activity of the strains W+GDT1, W+PMR1 and W303-1A at the end of fermentation

圖6顯示，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，菌株W+GDT1的胞內(nèi)蛋白酶A的活力較親本菌株提高了12.59%，胞外蛋白酶A活力較親本菌株降低了18.81%；菌株W+PMR1的胞內(nèi)蛋白酶A活力較親本菌株提高了11.06%，胞外蛋白酶A活力較親本菌株降低了12.42%。過表達(dá)Gdt1或者過表達(dá)Pmr1都提高了胞內(nèi)蛋白酶A的酶活力，降低了胞外蛋白酶A的酶活力，說明過表達(dá)Gdt1可能如過表達(dá)Pmr1一樣，促進(jìn)蛋白酶A的液泡分選，致使更多的蛋白酶A被運(yùn)輸?shù)揭号葜?，進(jìn)而相應(yīng)的外泌到細(xì)胞外的蛋白酶A量減少。與親本菌株相比，過表達(dá)Gdt1后，可能單位時(shí)間內(nèi)運(yùn)輸較多的Ca2+進(jìn)入TGN腔內(nèi)，縮短了TGN腔內(nèi)Ca2+水平瞬時(shí)增加的時(shí)間，這可能是過表達(dá)Gdt1促進(jìn)蛋白酶A的液泡分選，降低蛋白酶A的胞外分泌的原因之一。研究表明，Gdt1在液泡蛋白羧肽酶Y糖基化過程中有重要的作用，羧肽酶Y的異常糖基化可能降低其被分選到液泡的效率[23-24]。過表達(dá)GDT1基因后，細(xì)胞內(nèi)Gdt1蛋白表達(dá)量提高，可能促進(jìn)了蛋白酶A前體物質(zhì)的糖基化過程的快速完成，進(jìn)而提高分選其到液泡的效率，從而更多的蛋白酶A被分選到液泡中，這可能是過表達(dá)Gdt1促進(jìn)蛋白酶A的液泡分選，降低蛋白酶A的胞外分泌的另一個(gè)原因。

Pmr1在液泡蛋白酶(蛋白酶A和羧肽酶Y)的液泡分選過程中起作用[16-17]。如Pmr1一樣，Gdt1也可能間接調(diào)控其他液泡蛋白酶(除蛋白酶A之外)的液泡分選，另2個(gè)典型的液泡蛋白酶是羧肽酶Y和蛋白酶B。羧肽酶Y編碼基因和蛋白酶B編碼基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯后，形成各自的前體物質(zhì)，前體物質(zhì)經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的修飾后，最終被分選到液泡中激活成為有活性的羧肽酶Y和蛋白酶B[25]。由此可知，在液泡中才存在有活性的羧肽酶Y和蛋白酶B，2種蛋白酶在液泡中才發(fā)揮其作用，在分選蛋白酶A原到液泡的過程中不會(huì)起作用。蛋白酶A原在液泡中經(jīng)過蛋白酶B的特異蛋白水解作用或者自我激活作用，才形成具有活性的蛋白酶A[1,10]。若過表達(dá)Gdt1影響了蛋白酶B的液泡分選，引起液泡中有活性的蛋白酶B的含量發(fā)生變化，是否也會(huì)間接影響蛋白酶A的胞內(nèi)外酶活力？過表達(dá)Gdt1可能會(huì)促進(jìn)蛋白酶B的液泡分選，使更多的蛋白酶B被分選到液泡中，液泡中較多的蛋白酶B會(huì)加快液泡中的蛋白酶A原轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂谢钚缘牡鞍酌窤；蛋白酶B在蛋白酶A的液泡分選過程中不起作用，分選到液泡中的蛋白酶A原的量不會(huì)因液泡中蛋白酶B量的增加而發(fā)生改變，因此液泡中蛋白酶B量的增加只是縮短了液泡中蛋白酶A原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牡鞍酌窤的時(shí)間，并不會(huì)影響液泡中最終的蛋白酶A的酶活力；分選到液泡中的蛋白酶A原的量沒有改變，相對應(yīng)的外泌到細(xì)胞外的蛋白酶A原的量也不會(huì)改變，細(xì)胞外的蛋白酶A原在自我激活的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牡鞍酌窤[26]，從而胞外蛋白酶A的酶活力也不會(huì)因液泡中蛋白酶B量的增加發(fā)生改變。顯然，在過表達(dá)Gdt1影響蛋白酶B的液泡分選的情況下，液泡中蛋白酶A酶活力是由分選到液泡中的蛋白酶A原的量決定的，并不會(huì)受蛋白酶B的影響。

2.3 鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Gdt1過表達(dá)對菌株基本發(fā)酵性能的影響

2.3.1 對發(fā)酵過程中菌株的生長繁殖、碳源和氮源吸收能力的影響

發(fā)酵期間各菌株的生物量、各菌株發(fā)酵液中的表觀糖度以及α-氨基氮含量測定結(jié)果見圖7。

由圖7-a可知，菌株W+GDT1在發(fā)酵期間的生物量變化趨勢和親本菌株W303-1A相同：在第1天，菌體大量的繁殖，繁殖速度最快；從第2天到第5天菌體的繁殖速度逐漸緩慢，第6天到第7天，發(fā)酵液中菌體的濃度不變，即從第5天開始進(jìn)入穩(wěn)定期；菌株W+GDT1發(fā)酵期間相同的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的菌體量與親本菌株基本相同。在酵母細(xì)胞中，過表達(dá)GDT1不會(huì)影響酵母細(xì)胞的生長繁殖。

由圖7-b可知，菌株W+GDT1與親本菌株W303-1A的耗糖曲線趨勢基本上一致。結(jié)合各菌株發(fā)酵期間生物量的變化趨勢圖(圖7-a)分析：前5 d，菌體大量生長繁殖，消耗大量的糖類合成菌體細(xì)胞成分和代謝產(chǎn)物的碳架；5 d之后，菌體生長繁殖速度逐漸變慢，最終生物量趨于恒定不變，耗糖的速度也逐漸變慢最后趨于平穩(wěn)。由此可知，過表達(dá)Gdt1不會(huì)影響酵母細(xì)胞對碳源的吸收能力。

由圖7-c可知，菌株W+GDT1和親本菌株W303-1A對發(fā)酵液中α-氨基氮的利用情況曲線趨勢大致相同。結(jié)合各菌株發(fā)酵期間生物量的變化趨勢圖(圖7-a)分析：前5 d，由于菌體大量迅速的繁殖，菌體迅速吸收大量的氮源用于菌體自身生長所需，此時(shí)發(fā)酵液中α-氨基酸的含量下降的較快；5 d之后，菌體的繁殖速度逐漸變慢，最終在5 d之后發(fā)酵液中的菌濃趨于穩(wěn)定不變，相應(yīng)的菌體對發(fā)酵液中的α-氨基氮的利用速度逐漸緩慢，最后也趨于平穩(wěn)。菌株W+GDT1在發(fā)酵的各個(gè)時(shí)期消耗的α-氨基氮的含量和親本菌株W303-1A基本一致。過表達(dá)Gdt1的表達(dá)量不會(huì)影響酵母細(xì)胞對氮源的吸收能力。

a-生物量；b-碳源消耗；c-氮源消耗圖7 發(fā)酵期間菌株W+GDT1和W303-1A的生物量、耗糖和耗氮的比較Fig.7 Comparing of biomass, sugar consumption, nitrogen consumption of the strains (W+GDT1 and W303-1A) during fermentation

2.3.2 對發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌株發(fā)酵液中的乙醇體積分?jǐn)?shù)和殘?zhí)呛康挠绊?/p>

發(fā)酵結(jié)束時(shí)，對菌種發(fā)酵液中的乙醇體積分?jǐn)?shù)和殘?zhí)堑暮窟M(jìn)行了測定，測定結(jié)果見表3。發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌株W+GDT1和親本菌株發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)和殘?zhí)呛颗c親本菌株W303-1A相比較沒有顯著性差異。過表達(dá)Gdt1不會(huì)影響釀酒酵母菌株的產(chǎn)乙醇能力。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，各菌株發(fā)酵液中剩余的還原糖含量基本相同，這與圖7-b顯示的各菌株對碳源的吸收能力基本一致的結(jié)論相對應(yīng)，即過表達(dá)Gdt1不會(huì)影響菌株的碳源吸收能力，因而發(fā)酵液中剩余還原糖的量也基本相同。

表3 菌株W+GDT1和W303-1A發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)和殘?zhí)呛康谋容^Table 3 Comparing of ethanol production and residualreducing sugar content in the broth fermented with thestrains (W+GDT1 and W303-1A)

3 結(jié)論

蛋白酶A是釀酒酵母的一種液泡水解酶，在釀酒酵母細(xì)胞中起著不可替代的生理生化作用。在脅迫條件下，可以從釀酒酵母細(xì)胞中釋放到發(fā)酵培養(yǎng)基中，影響啤酒的泡沫穩(wěn)定性。本研究將鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Gdt1編碼基因GDT1在組成型強(qiáng)啟動(dòng)子PGK1的調(diào)控下過量表達(dá)，探究了Gdt1過表達(dá)對蛋白酶A的胞外分泌的影響。與親本菌株相比，Gdt1過表達(dá)菌株的胞內(nèi)蛋白酶A活力提高了12.59%，胞外蛋白酶A活力降低了18.81%。確定了過表達(dá)Gdt1能提高蛋白酶A的液泡分選，并顯著地降低了蛋白酶A的胞外分泌，為選育低蛋白酶A外泌的優(yōu)良工業(yè)釀酒酵母以及改善啤酒泡沫穩(wěn)定性提供了思路和參考。